Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-10-08T21:49:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação de Mestrado Mônica Reis19_07.d oc.pdf: 1532492 bytes, checksum: b88a88ff0daba799bc2fd5e3082c7928 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-10-09T11:13:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação de Mestrado Mônica Reis19_07.d oc.pdf: 1532492 bytes, checksum: b88a88ff0daba799bc2fd5e3082c7928 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-09T11:13:03Z (GMT). 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The env gene gp41 fragment of 766 bp (FP, HR1, HR2, TM regions) was amplified by “nested”-PCR from cDNA and sequenced among 110 patients (Big Dye Terminator Sequencing v. 3.1, Applied Biosystems, EUA; ABI Prism 3130). HIV-1 subtypes were assigned by REGA tool and by phylogenetic analyses (Neighbor-Joining, Kimura 2-P). T-20 resistance mutations were analyzed according to the IAS/USA, Stanford online HIV Drug Resistance Database and other sources. The median age of pregnant women (n=110) was 26 years (16-42 years), 16% were AIDS cases. The frequency of natural resistance (N42D, L44M and R46M) to T-20 was 5.4% (6/110). All resistance mutations were identified in HIV-1 subtype B isolates within the HR1 region of the gp41 fragment. The prevalence of compensatory mutations in HR2 region of gp41 was 20.9% (23/110): S138A (n=11), E137K (n=10) e N126K (n=2). All 110 isolates presented several polymorphisms. The following polymorphisms were observed in FP of gp41: M24I/L/V, I7M/V, and I4A/F/L/M. In 42.7% (47/110) of isolates many indels within the gp41 FP fragment were observed. Polymorphisms identified in HR1 were: K77E/L/Q/R/V, I69V, L54M, R46K/Q, N42S and Q32L/N. Polymorphisms in HR2 gp41 region were: S157D/N, E151A/K/Q, E148D, I135L, S133D/E/N/Q/R/T, H132F/Y, L130E/I/T, S129D/G/N/Q, N125A/D/E/S, R122K, N121E/D and E119Q. Moderate rate of natural resistance for T-20 and higher prevalence of polymorphisms in env gp41 region were described. Moreover higher prevalence of HIV-1 “non- B subtypes” C and F1 was observed. These molecular data may contribute to better therapeutic and MTCT preventive strategies for pregnant women infected with HIV-1. / Nas gestantes infectadas pelo HIV-1, a presença de mutações associadas à resistência aos antirretrovirais (ARV) representa um desafio para a prevenção da transmissão materno-infantil do HIV-1 e para futuras opções de tratamento materno. Este estudo teve como objetivo avaliar a presença de mutações na gp41 associadas à resistência natural ao inibidor de fusão T-20, polimorfismos e subtipos do HIV-1 em gestantes nunca tratadas com T-20 e com diferentes níveis de exposição a outros ARVs. Um total de 153 gestantes infectadas pelo HIV-1 (virgens de tratamento ARV, em profilaxia para TV ou em tratamento com ARV) foi recrutado entre junho/2008-junho/2010. O fragmento de 766 pb da gp41 do gene env (porções PF, HR1, HR2 e TM) foi amplificado por “nested”-PCR a partir de cDNA e sequenciado em 110 pacientes (Big Dye Terminator Sequencing v. 3.1, Applied Biosystems, EUA; ABI Prism 3130). Os subtipos do HIV-1 foram identificados pelos softwares REGA HIV-1 e por inferência filogenética (Neighbor-Joining, Kimura 2-P). Mutações associadas à resistência natural ao T-20 foram analisadas por comparação com o banco de dados da IAS-USA, Stanford HIV Drug Resistance Database e outras fontes. A mediana de idade das gestantes (n=110) foi de 26 anos (variação 16-42 anos), 16% eram casos sintomáticos. Mutações associadas à resistência natural para T-20 (N42D, L44M, R46M) foram encontradas em 5,4% (6/110). Todas as mutações associadas à resistência foram descritas nos isolados do subtipo B no fragmento HR1 da gp41. A prevalência de mutações compensatórias foi de 20,9% (23/110): S138A (n=11), E137K (n=10) e N126K (n=2). Todos os 110 isolados apresentaram vários polimorfismos. Os polimorfismos encontrados no fragmento PF da gp41 foram: M24I/L/V, I7M/V e I4A/F/L/M. Em 42,7% (47/110) dos isolados apresentaram várias inserções e deleções dentro do fragmento FP da gp41. Os polimorfismos na região HR1 foram: K77E/L/Q/R/V, I69V, L54M, R46K/Q, N42S e Q32L/N. Polimorfismos na região HR2 da gp41 foram: S157D/N, E151A/K/Q, E148D, I135L, S133D/E/N/Q/R/T, H132F/Y, L130E/I/T, S129D/G/N/Q, N125A/D/E/S, R122K, N121E/D e E119Q. Moderada prevalência de resistência natural ao T-20 e elevada frequência de polimorfismos na região da gp41 foram descritas. Além disso, uma alta prevalência de “subtipos não-B” C e F1 de HIV-1 foram observados. Estes dados moleculares podem contribuir para estratégias terapêuticas e profiláticas mais eficazes para gestantes infectadas pelo HIV-1.

nÃo hà / IntroduÃÃo: Rev Responsive Element (RRE) à uma molÃcula RNA responsÃvel pelo transporte do mRNA viral do HIV-1 do nÃcleo para o citoplasma da cÃlula CD4, atravÃs da via RRE-Rev, essencial para a replicaÃÃo viral. As mutaÃÃes de resistÃncia a Enfuvirtida sÃo primariamente localizadas no perÃmetro de 10 aminoÃcidos do HR1, regiÃo correspondente no RRE. Caracterizar o RRE poderà fornecer uma nova abordagem terapÃutica para a terapia do HIV. Objetivos: Sequenciar e caracterizar o RRE da gp41 para avaliar sua variabilidade e correlaÃÃo com parÃmetros laboratoriais em sequÃncias de pacientes infectados pelo HIV-1 que receberam terapia antirretroviral ou virgens. Em estudo in vitro avaliar a mutaÃÃo 36D na presenÃa de Enfuvirtida. Metodologia: 62 amostras de pacientes com HIV-1 do Cearà foram coletadas e 35 sequÃncias de RRE foram obtidas e distribuÃdas em trÃs grupos para fins de anÃlise comparativa: N (virgens de terapia), T (uso de antirretroviral sem inibidor de fusÃo) e F (uso de antirretroviral associados a Enfuvirtida). SequÃncias obtidas foram alinhadas com o banco de dados de Los Alamos para HIV usando HIV BLAST Search. Estudo in vitro utilizou dois vÃrus de laboratÃrio pNLA-3 (36D e 36G) observando citopatogenicidade e proliferaÃÃo na presenÃa de doses crescentes de Enfuvirtida. Resultados: A anÃlise filogenÃtica demonstrou alta prevalÃncia do HIV-1 subtipo B (97,2%). Observou-se aumento da resposta imunolÃgica no grupo T (71,5%) comparado ao F (2,98%). MutaÃÃes mais comuns e polimorfismos do Grupo N foram Q32L (41,6%), N42S (8,3%), R46K (33,3%), L54M (41,6%); no grupo T: Q32R (8,3%), R46K (25%), L54M (33,3%); e no grupo F: Q32L (18,2%), G36D (9,1%), V38A (9,1%), N42S (27,3%), N42T (9,1%), R46K (27,3%), L54M (45,4%), K77R (54,5%). TrÃs amostras demonstraram mutaÃÃes de resistÃncia significativas para os inibidores de fusÃo. AnÃlise dos sÃtios primÃrios de ligaÃÃo do RRE observou presenÃa de mutaÃÃo 28A em 27,2% e 8,3% nos grupos F e N respectivamente, e 27S em 8,3% no grupo T. Houve pressÃo seletiva da regiÃo HR1 do HIV-1 de pacientes usando antirretroviral, independente da exposiÃÃo à Enfuvirtida. NÃo houve diferenÃa estatÃstica significativa nas curvas de p24 do vÃrus 36D comparado com 36G, independente de concentraÃÃes de T20 (p>0.05). Observou-se menor formaÃÃo de sincÃcio, com diminuiÃÃo da capacidade fusogÃnica, sem impacto na infectividade. ConclusÃo: O estudo definiu as mutaÃÃes e polimorfismos mais prevalentes no CearÃ, sugerindo alta preservaÃÃo nas regiÃes de sÃtio primÃrio de ligaÃÃo do Rev-RRE. Evidenciou baixo perfil de resistÃncia a Enfuvirtida em regimes com falha utilizando esta medicaÃÃo. Detectou-se pressÃo seletiva no HR1 do HIV-1 de pacientes em uso de Antirretroviral, independente de exposiÃÃo à Enfuvirtida. Evidenciado in vitro menor formaÃÃo sincicial no vÃrus 36D, com diminuiÃÃo na atividade fusogÃnica, mantendo infectividade. / Introduction: Rev Responsive Element (RRE) is a RNA molecule responsible to mRNA from HIV-1 virus nuclear transportation to cytoplasm through RRE-Rev pathway, essential to virus replication. Enfuvirtide resistance mutations are primary located in a perimeter of 10 amino acids of HR1, a corresponded region of RRE. Characterize RRE should provide a new approach for HIV therapy. Objectives: Sequence and characterize RRE from gp41 to evaluate variability and correlate with laboratory parameters in sequences from HIV-1-infected patients, which were receiving regimens including Enfuvirtide, naÃve or rescue therapy. Also evaluated mutation G to D at codon 36 in the presence of fusion inhibitor (enfuvirtide). Methods: Sixty-two samples from HIV patients in Ceara/Brazil were collected and Thirty-five RRE sequences and clinical follow-up were analyzed, distributed into three groups: N (naÃve therapy), T (treated patients with rescue regimens) and F (rescue regimens containing Enfuvirtide). Sequences obtained were aligned with Los Alamos HIV sequence database by using the HIV BLAST Search. Culture Study was performed using two different pNLA-3 (36D and 36G) with increasing amounts of enfuvirtide. Results: A phylogenetic analyses demonstrated higher prevalence of HIV-1 subtypes B (97.2%). An increased immunology response was observed in CD4 count higher on group T (71.5%) compared with F (2.98%). Group N most common mutations and polymorphisms were Q32L (41.6%), N42S (8.3%), R46K (33.3%), L54M (41.6%); group T: Q32R (8.3%), R46K (25%), L54M (33.3%); and group F: Q32L (18.2%), G36D (9.1%), V38A (9.1%), N42S (27.3%), N42T (9.1%), R46K (27.3%), L54M (45.4%), K77R (54.5%). Three samples demonstrated significant resistance mutations to fusion inhibitors. Analysis of RRE nucleotide primary sites observed mutation 28A in 27.2% and 8.3% on groups F and N respectively, and 27S in 8.3% on group T. There was selective pressure on HR1 region from HIV-1 patients using antiretroviral, independent of enfuvirtide exposure. There was no statistical difference between p24 curves of virus 36D compared with 36G, independent of T20 concentrations (p>0.05). It was observed less syncytial formation in 36D virus, with diminished fusogenic activity besides keeping infectivity. Conclusions: This study defined most prevalent RRE polymorphisms in Ceara/Brazil and suggests highly preserved regions primary sites to Rev connection. Observed a low resistance profile to enfuvirtide in failing regimens with this drug. Selective pressure on HR1 region in failed regimens with out fusion inhibitors was detected. A less syncytial formation in 36D virus with diminished fusogenic activity was detected.

A Enfuvirtida(ENF), único inibidor de fusão disponível, representa uma opção interessante aos pacientes com infecção pelo HIV quando utilizada em combinação com outros antirretrovirais, principalmente no tratamento de multiexperimentados com falha virológica e poucas opções terapêuticas. Sua eficácia já comprovada em ensaios clínicos esbarra nas barreiras impostas por sua administração parenteral. Impulsionado por estes dados, avaliamos durante 48 semanas a resposta virológica, a evolução de células T CD4 a possível resistência primária a ENF e o impacto para a adesão do uso subcutâneo da droga em dez pacientes que fazem acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Pedro Ernesto e que tinham história de mais de dez anos de infecção pelo HIV e uso de ENF no seu esquema terapêutico sugerido por teste de resistência. Todos os pacientes alcançaram ao final do seguimento sucesso terapêutico, mantendo carga viral não detectada, e um incremento médio significativo de linfócitos T CD4. Em relação a uma possível resistência primária, em nenhum dos testes, genotipagem da glicoproteína 41, foi visualizado mutações naturais que pudessem diminuir a ação da ENF. Sobre o manejo do medicamento, preparo e aplicação, observamos que é imprescindível um apoio multidisciplinar para que não haja descontinuação na sua utilização / Enfuvirtide (ENF) is the only fusion inhibitor available. It is an interesting option for patients with HIV infection when used in combination with other antiretroviral drugs, especially in the treatment of multi-experienced patients with virological failure and few therapeutic options. Its effectiveness confirmed in clinical trials finds the barriers in its parenteral administration. Using these data, we evaluated, for 48 weeks, the virological response, evolution of CD4 T cells, the possible primary resistance to ENF and the impact to the subcutaneous use of the drug in ten patients undergoing outpatient monitoring at Hospital Universitário Pedro Ernesto with a history of more than ten years of HIV infection and use of ENF in their therapy, as suggested by resistance testing. All patients have successfully completed the therapy by the end of follow-up with an undetected viral load and a significant average increase of CD4 T lymphocytes. As for a possible primary resistance, neither the genotyping nor the glycoprotein 41 revealed natural mutations that could diminish the effect of ENF. Concerning the management, preparation and application of the drug, we found that a multidisciplinary support is essential to avoid that the drug be discontinued

A Enfuvirtida(ENF), único inibidor de fusão disponível, representa uma opção interessante aos pacientes com infecção pelo HIV quando utilizada em combinação com outros antirretrovirais, principalmente no tratamento de multiexperimentados com falha virológica e poucas opções terapêuticas. Sua eficácia já comprovada em ensaios clínicos esbarra nas barreiras impostas por sua administração parenteral. Impulsionado por estes dados, avaliamos durante 48 semanas a resposta virológica, a evolução de células T CD4 a possível resistência primária a ENF e o impacto para a adesão do uso subcutâneo da droga em dez pacientes que fazem acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Pedro Ernesto e que tinham história de mais de dez anos de infecção pelo HIV e uso de ENF no seu esquema terapêutico sugerido por teste de resistência. Todos os pacientes alcançaram ao final do seguimento sucesso terapêutico, mantendo carga viral não detectada, e um incremento médio significativo de linfócitos T CD4. Em relação a uma possível resistência primária, em nenhum dos testes, genotipagem da glicoproteína 41, foi visualizado mutações naturais que pudessem diminuir a ação da ENF. Sobre o manejo do medicamento, preparo e aplicação, observamos que é imprescindível um apoio multidisciplinar para que não haja descontinuação na sua utilização / Enfuvirtide (ENF) is the only fusion inhibitor available. It is an interesting option for patients with HIV infection when used in combination with other antiretroviral drugs, especially in the treatment of multi-experienced patients with virological failure and few therapeutic options. Its effectiveness confirmed in clinical trials finds the barriers in its parenteral administration. Using these data, we evaluated, for 48 weeks, the virological response, evolution of CD4 T cells, the possible primary resistance to ENF and the impact to the subcutaneous use of the drug in ten patients undergoing outpatient monitoring at Hospital Universitário Pedro Ernesto with a history of more than ten years of HIV infection and use of ENF in their therapy, as suggested by resistance testing. All patients have successfully completed the therapy by the end of follow-up with an undetected viral load and a significant average increase of CD4 T lymphocytes. As for a possible primary resistance, neither the genotyping nor the glycoprotein 41 revealed natural mutations that could diminish the effect of ENF. Concerning the management, preparation and application of the drug, we found that a multidisciplinary support is essential to avoid that the drug be discontinued

Introdução: estudos com Enfuvirtida (ENF) mostraram que mutações na HR1 da gp41 levam à resistência primária de cepas em pacientes sem tratamento prévio com inibidores de fusão (Derdeyn et al., 2000; Rimsky et. al., 1998; Sista et. al., 2002). Outros, que o uso contínuo de HAART leva à falha virológica (Shafer et. al., 1998; Shafer & Vuitton, 1999). Para a melhor escolha terapêutica recomenda-se usar a Genotipagem do HIV1 (Ministério da Saúde, 2008b; Perez-Elias et. al., 2003; Shafer et. al., 2001). Objetivos: avaliar o perfil de resistência do HIV1 ao ENF pelo sequenciamento da HR1 da gp41 em pacientes sob HAART, sem uso de inibidor de fusão. Realizar fenotipagem virtual da pol do HIV1 em trinta e duas cepas com resistência aos NRTI, NtRTI , NNRTI e PI para verificar indicação do ENF. Métodos: investigamos 877 prontuários de pacientes do CRT-DST/AIDS entre 5/2002 a 7/2005 e verificamos que 92 que haviam realizado o Teste de Genotipagem do HIV1 em nosso laboratório, sem tratamento prévio com inibidores de entrada poderiam participar do nosso estudo. O primeiro grupo, com 60 pacientes apresentou cepas sensíveis à pelo menos um antirretroviral (ARV) e o segundo com 32 cujas cepas apresentaram resistência parcial e completa às drogas. A região HR1/HR2 da gp41 foi seqüenciada com o kit Big Dye Terminator vs. 3.1. Alinhamos as seqüências e as comparamos com HXB2 através do programa BioEdit vs.7.0.9.0. As mutações de resistência ao ENF foram determinadas pelo algoritmo Francês (ANRS) e pelo da Universidade de Stanford. Submetemos as sequências ao Virtual Phenotype Assay (Virco, Bélgica) para obtermos a Fenotipagem Virtual. Os subtipos da HR1/HR2 da gp41 e do pol foram determinados por análises filogenéticas e os recombinantes, pelo Simplot v 3.5.1. Resultados: 89(97%) amostras foram seqüenciadas, 2 (2%) não amplificaram e 1 (1%) não tinha material suficiente. Destas, 82 (92%) eram do subtipo B, 6(7%) do F1 e 1(1%), do BF na gp41. No pol, 80(87%) eram B, 4(4%) eram F e 7(8%), eram FB. Três (3%) apresentaram resistência primária ao ENF, determinada pela N42D (1%), N43H (1%) e L44M (1%). Dez amostras tinham os polimorfismos Q39R(10%), N42H(10%), N42R(10%), N42N/S(10%) e N42S(60%). Na HR2, as mutações N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K e S138S/A estavam presentes em 26% das cepas. Apesar das cepas apresentarem resistência aos ARV pelo teste de genotipagem, a fenotipagem virtual mostrou que 10% dos ARV ainda atuavam sobre elas, enquanto que 75% delas apresentaram resistência parcial e 15%, completa às drogas. Conclusão: nosso estudo sugere a introdução do teste de genotipagem da HR1/HR2 da gp41 antes de indicar do ENF em pacientes com falha terapêutica e que a Fenotipagem Virtual pode ser usada para a escolha do melhor esquema antirretroviral que permita uma supressão viral sustentada. / Background: studies using Enfuvirtide (ENF) have showed that mutations in the HR1 (gp41) have been associated with primary resistance in strains of the patients without previous treatment with fusion inhibitors. (Rimsky et. al.,1998; Derdeyn et al.,2000, Sista et. al.,2002). The widespread use of HAART may achieve maximal suppression of the viral load, but the viral rebound may occur, leading to virologic failure (Shafer et. al.,1998; Shafer & Vuitton,1999). To optimize therapeutic choices it is recommended to use the HIV1 Genotypic Assay. Objective: to evaluate the resistance profile in the HR1 in patients submitted to HAART, but naïve entry inhibitors. To make the Virtual Phenotypic Assay in the pol of the HIV1 strains isolated of the 32 patients with resistance to the antiretroviral (ARV) and to verify the possibility of using the ENF. Methods: we investigated 877 handbook patients of the CRT-DST/AIDS from May/2002 to July/2005. We identified 92 naïve patients to entry inhibitors included in our cohort to do genotypic assay; they were included in our research. The first group was composed by 60 persons with sensible strains to only one ARV. The second, with 32 presented strains with resistance to all ARV. HR1/HR2 was sequenced (ABIPrism BigDye Terminator vs 3.1). Bioedit Software vs.7.0.9.0 was used to compare sequences with the HIVHXB2. The resistance mutations to ENF were analyzed using French ANRS and Stanford HIV Drug Resistance Algorithm. The results by Virtual Phenotype Assay of 32 patients that presented regimen failure by Genotypic Assay predicted HIV phenotypic resistance. Subtype analysis were did by Phylogeny and the recombinants strains results, confirmed by Simplot v.3.5.1. Results: 89(97%) out of 92 samples were sequenced. Two of them (2%) could not be amplified and one (1%) we did not have enough material to use. In the HR1/HR2 82(92%) of the samples were typed as B, 6(7%), as F and 1(1%) as FB. In the pol 80(87%) were classified as B, 4(4%), as F and 7(8%) as FB. According to algorithms used, 3(3%) out of 89 ENF naïve patients presented complete resistance to this drug. One virus harbored the N42D mutation (1%), another, the N43H(1%) and the other one the L44M(1%). In 10 samples we observed the polymorphisms Q39R(1%), N42H(1%), N42R(1%), N42N/S(1%) and N42S(7%). In the HR2 domain the substitutions N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K and S138S/A were present in 26% of the samples. Although strains presented resistance to the ARV by Genotypic Assay, in the Virtual Phenotypic Assay we verified that 10% of the drugs had some effect upon them. 75% of the strains presented partial and 15% completed resistance to ARV. Conclusion: it is important to introduce the HR1/HR2 genotyping test to verify resistance mutations to ENF before indicating this drug to patients with virologic failure. The virtual phenotypic assay can be used to select the better combination therapy to obtain viral suppression sustained response.

Introdução: estudos com Enfuvirtida (ENF) mostraram que mutações na HR1 da gp41 levam à resistência primária de cepas em pacientes sem tratamento prévio com inibidores de fusão (Derdeyn et al., 2000; Rimsky et. al., 1998; Sista et. al., 2002). Outros, que o uso contínuo de HAART leva à falha virológica (Shafer et. al., 1998; Shafer & Vuitton, 1999). Para a melhor escolha terapêutica recomenda-se usar a Genotipagem do HIV1 (Ministério da Saúde, 2008b; Perez-Elias et. al., 2003; Shafer et. al., 2001). Objetivos: avaliar o perfil de resistência do HIV1 ao ENF pelo sequenciamento da HR1 da gp41 em pacientes sob HAART, sem uso de inibidor de fusão. Realizar fenotipagem virtual da pol do HIV1 em trinta e duas cepas com resistência aos NRTI, NtRTI , NNRTI e PI para verificar indicação do ENF. Métodos: investigamos 877 prontuários de pacientes do CRT-DST/AIDS entre 5/2002 a 7/2005 e verificamos que 92 que haviam realizado o Teste de Genotipagem do HIV1 em nosso laboratório, sem tratamento prévio com inibidores de entrada poderiam participar do nosso estudo. O primeiro grupo, com 60 pacientes apresentou cepas sensíveis à pelo menos um antirretroviral (ARV) e o segundo com 32 cujas cepas apresentaram resistência parcial e completa às drogas. A região HR1/HR2 da gp41 foi seqüenciada com o kit Big Dye Terminator vs. 3.1. Alinhamos as seqüências e as comparamos com HXB2 através do programa BioEdit vs.7.0.9.0. As mutações de resistência ao ENF foram determinadas pelo algoritmo Francês (ANRS) e pelo da Universidade de Stanford. Submetemos as sequências ao Virtual Phenotype Assay (Virco, Bélgica) para obtermos a Fenotipagem Virtual. Os subtipos da HR1/HR2 da gp41 e do pol foram determinados por análises filogenéticas e os recombinantes, pelo Simplot v 3.5.1. Resultados: 89(97%) amostras foram seqüenciadas, 2 (2%) não amplificaram e 1 (1%) não tinha material suficiente. Destas, 82 (92%) eram do subtipo B, 6(7%) do F1 e 1(1%), do BF na gp41. No pol, 80(87%) eram B, 4(4%) eram F e 7(8%), eram FB. Três (3%) apresentaram resistência primária ao ENF, determinada pela N42D (1%), N43H (1%) e L44M (1%). Dez amostras tinham os polimorfismos Q39R(10%), N42H(10%), N42R(10%), N42N/S(10%) e N42S(60%). Na HR2, as mutações N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K e S138S/A estavam presentes em 26% das cepas. Apesar das cepas apresentarem resistência aos ARV pelo teste de genotipagem, a fenotipagem virtual mostrou que 10% dos ARV ainda atuavam sobre elas, enquanto que 75% delas apresentaram resistência parcial e 15%, completa às drogas. Conclusão: nosso estudo sugere a introdução do teste de genotipagem da HR1/HR2 da gp41 antes de indicar do ENF em pacientes com falha terapêutica e que a Fenotipagem Virtual pode ser usada para a escolha do melhor esquema antirretroviral que permita uma supressão viral sustentada. / Background: studies using Enfuvirtide (ENF) have showed that mutations in the HR1 (gp41) have been associated with primary resistance in strains of the patients without previous treatment with fusion inhibitors. (Rimsky et. al.,1998; Derdeyn et al.,2000, Sista et. al.,2002). The widespread use of HAART may achieve maximal suppression of the viral load, but the viral rebound may occur, leading to virologic failure (Shafer et. al.,1998; Shafer & Vuitton,1999). To optimize therapeutic choices it is recommended to use the HIV1 Genotypic Assay. Objective: to evaluate the resistance profile in the HR1 in patients submitted to HAART, but naïve entry inhibitors. To make the Virtual Phenotypic Assay in the pol of the HIV1 strains isolated of the 32 patients with resistance to the antiretroviral (ARV) and to verify the possibility of using the ENF. Methods: we investigated 877 handbook patients of the CRT-DST/AIDS from May/2002 to July/2005. We identified 92 naïve patients to entry inhibitors included in our cohort to do genotypic assay; they were included in our research. The first group was composed by 60 persons with sensible strains to only one ARV. The second, with 32 presented strains with resistance to all ARV. HR1/HR2 was sequenced (ABIPrism BigDye Terminator vs 3.1). Bioedit Software vs.7.0.9.0 was used to compare sequences with the HIVHXB2. The resistance mutations to ENF were analyzed using French ANRS and Stanford HIV Drug Resistance Algorithm. The results by Virtual Phenotype Assay of 32 patients that presented regimen failure by Genotypic Assay predicted HIV phenotypic resistance. Subtype analysis were did by Phylogeny and the recombinants strains results, confirmed by Simplot v.3.5.1. Results: 89(97%) out of 92 samples were sequenced. Two of them (2%) could not be amplified and one (1%) we did not have enough material to use. In the HR1/HR2 82(92%) of the samples were typed as B, 6(7%), as F and 1(1%) as FB. In the pol 80(87%) were classified as B, 4(4%), as F and 7(8%) as FB. According to algorithms used, 3(3%) out of 89 ENF naïve patients presented complete resistance to this drug. One virus harbored the N42D mutation (1%), another, the N43H(1%) and the other one the L44M(1%). In 10 samples we observed the polymorphisms Q39R(1%), N42H(1%), N42R(1%), N42N/S(1%) and N42S(7%). In the HR2 domain the substitutions N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K and S138S/A were present in 26% of the samples. Although strains presented resistance to the ARV by Genotypic Assay, in the Virtual Phenotypic Assay we verified that 10% of the drugs had some effect upon them. 75% of the strains presented partial and 15% completed resistance to ARV. Conclusion: it is important to introduce the HR1/HR2 genotyping test to verify resistance mutations to ENF before indicating this drug to patients with virologic failure. The virtual phenotypic assay can be used to select the better combination therapy to obtain viral suppression sustained response.