O sucesso da gestação depende da adequada comunicação materno-fetal, que em algumas espécies têm um contato mais íntimo devido à capacidade migratória de populações de células trofoblásticas. Nos bovinos esse mecanismo é realizado pelas células trofoblásticas gigantes (CTGs), com invasão limitada até a lâmina basal do epitélio materno. Apesar dessa leve invasão das CTGs, é possível encontrar células fetais circulantes no sangue periférico da vaca gestante, levando ao microquimerismo fetal. Além de toda uma sinalização local e sistêmica e mudanças conformacionais, a migração das CTGs também é dependente da tolerância imunológica do epitélio materno que possui uma baixa expressão de MHC de classe I. Em contrapartida, o trofoblasto expressa MHC de classe Ib para impedir a ativação das células natural killers uterinas (uNK) contra ele mesmo. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi estudar a ocorrência e contribuir para o entendimento dos mecanismos da migração celular na placenta bovina, com marcadores exclusivos do cromossomo Y e de um modelo de clone transgênico expressando a proteína GFP. A hipótese testada foi que o microquimerismo fetal observado mediante a detecção do gene TSPY no sangue periférico da vaca gestante de embrião macho, e de GFP nos tecidos placentários maternos, associado à expressão de MHC classe 1b (Qa2) na interface materno-fetal. Para tanto, 153 embriões produzidos por fertilização in vitro (FIV) foram transferidos, resultando em 34 embriões machos e 31 fêmeas no dia 62 de gestação, quando foi realizada a coleta de sangue periférico da receptora. Dentre estas gestações, foram selecionadas de 25 machos, 4 fêmeas e 5 perdas gestacionais (confirmadas no D39 por ultrassonografia) para detecção de TSPY. Também foram produzidas gestações de clones transgênicos, expressando GFP com 30, 60 e 90 dias que foram utilizadas para a detecção de mRNA e a proteína GFP. Nas gestações de FIV 60% dos embriões machos, 50% das fêmeas e 40% das perdas gestacionais foram positivos para TSPY. A detecção de TSPY nas gestações de fêmeas possivelmente é resultante da persistência do microquimerismo de gestações anteriores. Nas gestações de clones transgênicos, observou-se a presença de mRNA e proteína GFP no endométrio, também indicando migração nesta região ou o transporte da GFP, e outros conteúdos do trofoblasto, para o epitélio materno. Nos placentônios, usando anticorpo anti-GFP pode-se ver a marcação positiva tanto no trofoblasto como no epitélio materno, possivelmente decorrente de liberação das CTGs no estroma endometrial após a fusão. As CTGs, quando em formação sincicial, têm a sua expressão de GFP diminuída, o que também foi observado, utilizando-se anticorpo anti-Qa2 (antígeno murino para MHC classe Ib). O epitélio materno e o trofoblástico também foram marcados para Qa2. Mediante as técnicas utilizadas, observamos que o microquimerismo pôde ser identificado nas gestações analisadas com o uso dos marcadores TSPY no sangue e o GFP nos tecidos placentários maternos. Este estudo mostra que na placenta bovina ocorre uma migração de células fetais além do epitélio materno e abre novas perspectivas para estudos das características da interação materno-fetal ainda pouco explorada nos bovinos. / The pregnancy success depends of adequate materno-fetal communication, that in some species are have a more intimate contact due migratory capacity of trophoblastic cells populations. In bovines, this mechanism is realized by trophoblast giant cells (TGC) with limited invasion until basal lamina of maternal epithelium. Besides this light invasion of TGCs, is possible to encounter circulate fetal cells in peripheral blood of pregnant cow, leading to fetal microchimerism. Beyond local and systemic sinalization and conformational changes, TGC migration is also dependent of immunologic tolerance of maternal epithelium that possess a downregulation of classe I MHC. In complement, the trophoblast express classe Ib MHC to inhibit natural killers cells activation. In this context, the objective of this work was to study the occurrence and contribute for knowledge cellular migration mechanisms in bovine palcenta, with Y-specific markers and a model of transgenic clone expressing GFP. The tested hypothesis was that fetal microchimerism observed by detection od TSPY gene in peripheral blood of cow pregnant of male embryo, and of GFP in maternal placental tissues associated by expression of class Ib MHC (Qa2) in materno-fetal interface. For this, 153 embryos produced by in vitro fertilization (IVF) were trasnfered, resulting in 34 male embryos and 31 female in day 62 of pregnancy, when recipient peripheral blood was collected. Among these pregnancies, 25 males, 4 females and 5 pregnancy losses (confirmed at 39 days of pregnancy by ultrassonography) was selected for TSPY detection. Also were produced pregnancies of transgenic cloned, embryos expressing GFP, with 30, 60 and 90 days of pregnancy that utilized for GFP mRNA and protein detection. In IVF pregnancies, 60% of male embryos, 50% of females and 40% of pregnancy losses were positive for TSPY. The detection of TSPY in female pregnancies possible is resultant of persistence of microchimerism of anterior pregnancies. In transgenic cloned pregnancies, was observed presence of GFP mRNA and protein in endometrium, also indicating migration in this region or GFP transport, and another trophoblast content, to maternal epithelium. In placentomes, using anti-GFP antibody, could be observed positive immunolabeling in trophoblast and maternal epithelium, possible due CTGs liberation in endometrial stroma after fusion. The CTGs, in syncytium formation, have a downregulation of GFP, that also be observed, utilizing anti-Qa2 antibody (murine antigen of classe Ib MHC). The maternal and trophoblastic epithelium also was Qa2 immunolabed. By utilized techniques, microchimerism could be indentified in analyzed pregnancies with use of markers for TSPY in maternal blood and GFP in maternal placental tissues. This study show that in bovine placenta occurs fetal cell migration further maternal epithelium and show new perspectives for studies of materno-fetal interaction characteristics until under explored in bovines.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2008. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 298-310).

Dans la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis forme des granulomes dans les poumons avec, au centre, des cellules myéloïdes mono et multi-nucléées et autour, des lymphocytes. Nous avons étudié la biologie des cellules géantes dans ces granulomes tuberculeux : formation, mécanismes de survie et fonctions. Notre groupe a publié que l’IL-17A déclenche la fusion des cellules dendritiques (DC). Notre travail démontre que cette cytokine induit BCL2A1/BFL1, qui régule la survie des DC et les chémokines CCL2 et CCL20 qui dirigent le regroupement nécessaire à leur fusion. In situ, l'IL-17A est exprimée par les lymphocytes T de la couronne du granulome tuberculeux. BCL2A1, CCL2 et CCL20 sont exprimés par les cellules myéloïdes mono-et multi-nucléées. Ensuite, nous avons caractérisé le phénotype, les fonctions immunitaires et l'activité microbicide des DC traitées par l'IL-17A. Nous avons trouvé qu’elles co-expriment des marqueurs de DC et de macrophages, conservent les fonctions classiques des DC, synthétisent un profil spécifique d’enzymes destructrices et exercent une microbicidie variable suivant les souches de Mycobactéries. Nous avons nommé GMIC (Giant Myeloid Inflammatory Cell), ces cellules géantes induites par l'IL-17A. Nous proposons qu'elles constituent un nouvel effecteur myéloïde qui contrôle les mycobactéries. Ainsi, l'IL-17A participerait au maintien du cœur myéloïde du granulome tuberculeux en favorisant la formation des cellules géantes possédant des fonctions destructrices et microbicides. Les mécanismes moléculaires que nous avons documentés devraient permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales contre la tuberculose. / Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis infection, results in the development of granulomas in affected tissues. These structures are formed by a myeloid cell core including multinucleated giant cells and surrounded by T lymphocytes. We studied mechanisms of survival, formation and functions of giant cells in Mycobacterium granulomas. Previously, our group showed that the cytokine IL-17A induces the fusion of dendritic cells (DC). Here, we identified molecules induced by the IL-17A genetic program in myeloid cells: BFL1 regulated DC survival, while the chemokines CCL2 and CCL20 directed clustering required for DC fusion. In situ, in human TB granulomas, we found that IL-17A was expressed by T lymphocytes while BFL1, CCL2 and CCL20 were expressed by the mono- and multi-nucleated myeloid cells. Then we characterized phenotype, immune functions and microbicidal activity of IL-17A-treated DC and their derived giant cells. They expressed a mixed DC-macrophage phenotype, retained classical DC functions, synthesized several destructive enzymes and had increased and differential microbicidal activities against Mycobacterium species. We named GMIC (giant myeloid inflammatory cells) these IL-17A-dependent giant cells, and propose that they constitute a new inflammatory myeloid effector with potent microbicidal activities. Altogether, our results show that IL-17A may participate in the maintenance of the myeloid core of human tuberculosis granuloma by promoting the formation of GMIC with potent destructive and microbicidal functions. The molecular mechanisms we have documented should help the development of new tuberculosis therapeutic and vaccination strategies.

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In intra-oral squamous cell carcinoma (SCC), studies have suggested that MGCs may represent a foreign body reaction to the keratin produced by tumor cells and that, possibly, these cells are formed from the fusion of M2 macrophages. In the context of lower lip SCCs, there are no studies about a probable relationship between MGC reactions and the tumor progression (Pubmed Database, Scopus, Web of Science, LILACS, SIGLE – access on July 8, 2016). Thus, this study aimed to evaluate the frequency, distribution, and polarization profile (M1 - HLA-DR / M2 - CD163 ) of MGC reaction in 91 cases of lower lip SCC and to verify the association of this microscopic finding with clinicopathological parameters (tumor size, node metastasis, distant metastasis, clinical stage, and histopathological grade of malignancy). Under light microscopy, hematoxylin–eosin-stained histological sections were evaluated for the presence and distribution of MGCs reaction in high-power fields (HPFs). To evaluate the histopathological grade of malignancy, the systems proposed by Bryne et al. (1992) and the World Health Organization (WHO) (CARDESA et al., 2005) were used. Only cases containing MGCs reaction were included in the immunohistochemical study. The anti- CD68 antibody was used to confirm the monocytic/ macrophagic nature of the MGCs reaction. To identify the polarization profile of these cells, the percentage of HLA-DR and CD163 MGCs was established for each case. Thirty-six (39.6%) cases contained MGCs reaction. Significant associations between the presence of MGCs reaction and clinical parameters were not observed (p > 0.05). The occurrence of MGCs reaction in well and moderately differentiated cases (CARDESA et al., 2005) was 3.3 higher than in poorly differentiated cases (p = 0.006; PR: 3.30; 95% CI: 1.12-9.68). At the tumor invasive front (BRYNE et al., 1992), no associations between the presence of MGCs reaction and the histopathological grade of malignancy (p = 0.674), the nuclear pleomorphism (p = 0.359), the pattern of invasion (p = 0.277), and the inflammatory infiltrate (p = 0.653) were seen. Nonetheless, the occurrence of these cells in highly and moderately keratinized tumors at the invasive front was 2.03 higher than in lesions with minimal or no keratinization (p = 0.012; PR: 2.03; 95% CI: 1.11-3.71). Regarding the distribution analysis, eighteen (50%) cases had MGCs in up to 3 HPFs. Significant associations between the distribution of MGC reaction and the clinicopathological parameters were not observed (p > 0.05). Immunohistochemical analysis revealed that MGCs were CD68 in all cases. Furthermore, it was observed a predominance of HLA-DR over CD163 cells (p = 0.031). The findings of the current study suggest that MGCs reaction is not involved with tumor progression in lower lip SCCs. In these malignancies, MGCs tend to exhibit predominantly an M1 phenotype and may represent a foreign body reaction to the keratin produced by tumor cells. / A reação de células gigantes multinucleadas (CGM) tem sido relatada em diversas neoplasias malignas epiteliais. Todavia, a natureza e a potencial implicação prognóstica dessa reação nessas neoplasias permanecem assunto de discussão. No carcinoma de células escamosas (CCE) intraoral, estudos têm sugerido que as CGM podem representar uma reação do tipo corpo estranho à ceratina produzida pelas células tumorais e que, possivelmente, essas células são formadas a partir da fusão de macrófagos M2. No contexto dos CCE de lábio inferior, até o presente momento, não há estudos sobre uma possível relação das reações de CGM com a progressão tumoral (Pubmed Database, Scopus, Web of Science, LILACS, SIGLE – acesso em 08/07/2016). Dessa forma, este estudo objetivou avaliar a frequência, a distribuição e o perfil de polarização (M1 – HLA-DR / M2 – CD163 ) da reação de CGM em 91 casos de CCE de lábio inferior e verificar a associação desse achado microscópico com parâmetros clínico- patológicos (tamanho do tumor primário, metástase linfonodal regional, metástase à distância, estádio clínico e grau histopatológico de malignidade). Sob microscopia de luz, cortes histológicos corados em hematoxilina e eosina foram avaliados quanto à presença e à distribuição da reação de CGM em campos de grande aumento (high power fields - HPF). Para avaliar o grau histopatológico de malignidade, foram utilizados os sistemas propostos por Bryne et al. (1992) e pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (CARDESA et al., 2005). No estudo imunoistoquímico, foram incluídos apenas os casos contendo reação de CGM. O anticorpo anti- CD68 foi utilizado a fim de confirmar a natureza monocítica/ macrofágica da reação de CGM. Para identificar o perfil de polarização dessas células, foi estabelecido o percentual de positividade das CGM aos anticorpos anti-HLA-DR e anti-CD163 para cada caso. Trinta e seis (39,6%) casos exibiram reação de CGM. Associações significativas entre a presença da reação de CGM e os parâmetros clínicos não foram observadas (p > 0,05). A ocorrência da reação de CGM em casos bem e moderadamente diferenciados (CARDESA et al., 2005) foi 3,3 vezes maior que naqueles casos pobremente diferenciados (p = 0,006; RP: 3,30; 95% IC: 1,12-9,68). No front de invasão (BRYNE et al., 1992), não foram observadas associações entre a presença da reação de CGM e o grau histopatológico de malignidade (p = 0,674), o pleomorfismo nuclear (p = 0,359), o padrão de invasão (p = 0,277) e o infiltrado inflamatório (p = 0,653). Por sua vez, a ocorrência dessas células em casos com alto e moderado grau de ceratinização no front de invasão tumoral, foi 2,03 vezes maior que naqueles com mínima ou sem ceratinização (p = 0,012; RP: 2,03; 95% IC: 1,11-3,71). Na análise da distribuição, dezoito (50%) casos exibiram reação de CGM em até 3 HPF. Associações significativas entre a distribuição da reação de CGM e os parâmetros clínico-patológicos não foram observadas (p > 0,05). A análise imunoistoquímica revelou que as CGM eram CD68 em todos os casos. Além disso, foi observado um predomínio de células que expressavam HLA-DR em relação a CD163 (p = 0,031). Os achados do presente estudo sugerem que a reação de CGM não está envolvida com a progressão tumoral em CCE de lábio inferior. Nessas neoplasias, as CGM tendem a apresentar um fenótipo predominantemente M1 e podem representar uma resposta do tipo corpo estranho à ceratina produzida pelas células tumorais