京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22725号 / 医博第4643号 / 新制||医||1045(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 伊藤 貴浩, 教授 岩田 想 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21340号 / 医博第4398号 / 新制||医||1031(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妹尾 浩, 教授 岩井 一宏, 教授 横出 正之 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

HNF1α (hepatocyte nuclear factor-1α) est un facteur de transcription exprimé dans le foie, le pancréas, les reins, l’estomac, l’intestin grêle et le côlon. Il a été démontré que des mutations du gène codant pour cette protéine sont associées à un diabète non insulinodépendant MODY3. De plus, les souris déficientes pour l’expression de Hnf1α souffrent d’hyperglycémie. Ces animaux mutants semblent produire de l’insuline mais présentent cependant une altération de la sécrétion de cette hormone au niveau du pancréas. Dans une précédente étude, nous avons démontré que certains marqueurs de cellules entéroendocrines impliqués dans l’homéostasie du glucose étaient modulés chez les animaux mutants comparativement aux animaux contrôles notamment la ghréline, le Gip, la somatostatine. Notre hypothèse de recherche est que la perte de Hnf1α conditionne la promotion du diabète par l’intermédiaire d’hormones intestinales. Nous avons observé, chez les animaux mutants, une augmentation de l’expression du transcrit, du nombre de cellules positives ainsi que des taux plasmatiques de ghréline. Cette hormone étant reliée à l’homéostasie du glucose, nous avons suivi les variations de la glycémie et des taux d’insuline chez nos animaux. Nous avons observé une hyperglycémie accompagnée d’une diminution des taux d’insuline chez nos animaux mutants. Ces souris présentent une prise alimentaire augmentée, une polyurie et une polydipsie élevées, symptômes connus du diabète. Le traitement de 6 jours sur les souris Hnf1α[indice supérieur -/-] avec un antagoniste commercial du récepteur à la ghréline GHSR1a, le (D-Lys3)-GHRP-6 de BACHEM®, montre un rétablissement de la glycémie proche des valeurs normales, de même qu’une augmentation significative des taux d’insuline plasmatiques des souris traitées, une diminution de la polyurie, de la polydipsie et de la glycosurie. Les souris mutantes traitées avec cet antagoniste voient leur tolérance au glucose améliorée même en cas de choc glycémique. Nous avons, enfin, documenté la régulation possible de Hnf1α vis-à-vis du gène codant pour la ghréline. Des infections lentivirales, réalisées sur des cellules MIN6 avec un shARN dirigé contre le transcrit Hnf1α, montrent une augmentation des taux d’expression du transcrit ghréline. Nous avons également mis en évidence l’interaction physique entre Hnf1α et le promoteur ghréline en plusieurs sites par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine. L’ensemble de ces résultats suggère que la perte de Hnf1α chez la souris joue un rôle dans la promotion de l’hyperglycémie par l’intermédiaire d’une dérégulation de la production de ghréline.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22313号 / 医博第4554号 / 新制||医||1040(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 浅野 雅秀, 教授 濵﨑 洋子, 教授 横出 正之 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19604号 / 医博第4111号 / 新制||医||1014(附属図書館) / 32640 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 妹尾 浩, 教授 松田 道行, 教授 川口 義弥 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM

El proceso postcosecha desarrollado en el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) de Moncada (Valencia) ha permitido la comercialización del caqui como una fruta no astringente, mantiendo la firmeza del fruto y posibilitar así la exportación a otros países. Este hecho ha provocado un gran aumento del cultivo, tanto en producción como en superficie cultivada. Su repentino y exponencial crecimiento ha ido asociado a un aumento de los problemas derivados de la presencia organismos fitófagos así como a un aumento del uso de productos químicos para gestionar su control. La falta de información sobre los organismos plaga asociados al cultivo del caqui así como de sus enemigos naturales, sus niveles poblacionales y su impacto económico en el mismo han imposibilitado el desarrollo de un adecuado programa de gestión integrada de plagas (GIP) en este cultivo y hacía necesario e imperante un trabajo que facilitara la implementación de una estrategia sostenible de control. Por ello, el objetivo general de esta tesis doctoral ha sido sentar las bases para el desarrollo de una estrategia de GIP en el cultivo de caqui. Para llevar a cabo un estudio de estas características se seleccionaron cuatro campos de caqui (tres de ellos son parcelas comerciales y una pertenece a la estación experimental de la cooperativa agrícola de L’Alcudia) en dos de las principales zonas productoras de la Comunidad Valenciana: La Ribera Alta, en la provincia de Valencia, y Plana Baixa, en la de Castellón. Dos de estas parcelas se mantenían con un manejo convencional del cultivo, mientras que las otras dos se mantenían con un manejo ecológico; ambos se mantuvieron así durante este trabajo de tesis. En todos los casos, se muestrearon las parcelas quincenalmente durante tres años. En las parcelas con manejo convencional, se seleccionaron tres filas que fueron marcadas para evitar que recibieran tratamientos fitosanitarios y los árboles a muestrear pertenecían a estas filas; en el caso de las parcelas con manejo ecológico, los árboles a muestrear se seleccionaron al azar de toda la parcela. De los fitófagos más importantes, se estudió la ocupación de los frutos y el destrío provocado por éstos en un total de once campos, por lo que se seleccionaron siete campos adicionales para este fin. Los estudios de abundancia relativa de cada uno de los grupos de los fitófagos no mostraron una relación entre abundancia e importancia en el cultivo. El grupo más abundante fue el de los pseudocóccidos, seguido por los cóccidos. En último lugar en cuanto a abundancia se encontraron los lepidópteros, grupo considerado junto con los pseudocóccidos uno de los principales problemas económicos en el cultivo. Debido a que no existe una correlación entre abundancia e importancia, se decidió dedicarle atención especial a los organismos fitófagos con un mayor impacto económico: los pseudocóccidos y los lepidópteros; y debido a su gran abundancia en el cultivo de caqui, y gran impacto en otros cultivos, también se dedicó especial atención a un grupo de organismos auxiliares presentes en el cultivo, los fitoseidos. Los pseudocóccidos estuvieron presentes en el cultivo desde el verano hasta el momento de la cosecha. Las especies encontradas fueron: Planococcus citri, Pseudococcus viburni, Pseudococcus longispinus y Delottococcus aberiae. La ocupación de frutos y el destrío en cosecha producido por los pseudocóccidos desaconsejan la recomendación de tratamientos fitosanitarios generalizados. Debido a la imposibilidad de identificar mofológicamente de manera correcta las ninfas de pseudocóccidos, para la identificación de los estados inmaduros se puso a punto una identificación específica mediante el gen mitocondrial COI. Las especies de lepidópteros encontradas fueron: Cryptoblabes gnidiella y Anatrachyntis badia. Los adultos de C. gnidiella se capturaron a partir de los meses de junio en los tres años de trabajo, y es en el mes de septiembre cuando se empezaron a observar las primeras larvas, junto con las de A. badia, en el cultivo. La ocupación de frutos durante todo el año y el destrío en cosecha por parte de este grupo no superaron en la mayoría de los casos el 5%. Los fitoseidos estuvieron presentes en el cultivo desde final de primavera hasta la caída de las hojas, a final de año. A pesar de que no se pudo establecer una correlación entre una especie en concreto de fitoseido, o entre el complejo de estos, y una especie o grupo de fitófagos, sí que se halló una relación entre el número de fitoseidos y la suma de las presas potenciales. Las especies encontradas fueron: Amblyseius andersoni, Euseius stipulatus, Typhlodromus phialatus y Paraseiulus talbii. En las parcelas con manejo convencional, las especies que predominaron fueron E. stipulatus y T. phialatus. La visión holística que aporta el trabajo al haber muestreado durante tres años todos los organismos presentes ha permitido identificar futuros problemas del cultivo. Esto se aprecia al analizar los resultados en su conjunto, los cuales mostraron que el impacto económico en el cultivo de los diferentes organismos no está ligado, en la mayoría de los casos, a su abundancia en el mismo. Por otra parte, si bien las especies encontradas son las mismas que las descritas en cítricos, la abundancia y daños de cada una de ellas no se corresponden a los encontrados en cítricos, presumiblemente por las diferencias intrínsecas existentes entre los dos cultivos. Con todo ello, se han podido establecer los pilares de la gestión integrada para los diferentes organismos presentes en el cultivo en la Comunidad Valenciana y perfilar las futuras líneas de investigación para desarrollar completa y satisfactoriamente el programa GIP en el cultivo de caqui.

Enteroendocrine hormones released from the intestine following food intake have several roles in the control of metabolism, some of which are exploited therapeutically for the treatment of type 2 diabetes. Within this thesis, focus has been on the receptors of the gut hormones glucagon-like peptide-1 (GLP-1), glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-2 (GLP-2). In recent years there has been a surge of interest in the enteroendocrine hormones particularly due to the success of GLP-1 mimetics in the treatment of type 2 diabetes. GLP-1 is an incretin hormone, which enhances glucose induced insulin secretion by binding GLP-1 receptors (GLP1R) on pancreatic β-cells. Despite the therapeutic success, several extra-pancreatic clinical effects of GLP-1 remain unexplained. Here, a GLP1R monoclonal antagonistic antibody that can block GLP1R signalling in vivo has been developed and characterised, providing a new tool for the study of GLP1R physiology. GIP is the second incretin hormone, initially referred to as the 'ugly duckling' incretin hormone due to it's ineffectiveness in inducing insulin secretion in type 2 diabetic patients. Aside from the incretin actions, GIP is thought to be involved in the regulation of high-fat diet (HFD) induced obesity. A new transgenic mouse model expressing a fluorescent reporter under the control of the Gipr promoter has been used here to identify GIPR expressing cells. This model showed GIPR expression in the pancreas, adipose tissue, duodenum and nodose ganglia. Surprisingly GIPR expressing cells were found centrally, in areas of the hypothalamus involved in the regulation of food intake and energy expenditure. We consequently sought to investigate the function of GIPR expressing hypothalamic cells. GLP-2, unlike GLP-1 and GIP, is not an incretin hormone. Rather, GLP-2 has been implicated in the regulation of epithelial cell proliferation and apoptosis within the intestine. Therapeutically, an analogue of GLP-2 is used for the treatment of short bowel syndrome. A common missense mutation in the GLP-2 receptor (GLP2R), D470N, has been found to be associated with type 2 diabetes, and here we sought to understand the mechanism underlying this association. The D470N mutant has decreased β-arrestin recruitment, though the significance of this finding will need further research. Overall; the new monoclonal antagonistic GLP1R antibody will help to further understand GLP1R physiology, the new transgenic GIPR mouse model has contributed to the understanding of GIPR localisation, and cell based assays have identified functional implications of a polymorphism in the GLP2R associated with an increased risk of diabetes. It is hoped that further understanding of the physiology of these gut hormone receptors will be critical in the development of new therapeutics for diabetes and obesity.

Mechanisms to augment the cellular function and mass of beta-cells may be effective means of treating type 2 diabetes. Important in the physiological control of beta-cell function and nutrient disposal are factors released from gut enteroendocrine cells during nutrient digestion. In enteroendocrine L-cells, post-translational processing of proglucagon gives rise to a number of proglucagon-derived peptides. One such peptide, glucagon-like peptide-1 (GLP-1), acts via its own receptor (GLP-1R) to stimulate beta-cell insulin secretion, proliferation and survival. Another, oxyntomodulin (OXM), weakly activates the GLP-1R and inhibits food intake in a GLP-1R-dependent manner in rodents, which led us to hypothesize that OXM modulates GLP-1R-dependent glucoregulation. While OXM did not mimic the inhibitory effect of GLP-1 on gastric emptying in mice, OXM stimulated insulin secretion, beta-cell survival and improved glucose tolerance in a GLP-1R-dependent manner. In a similar manner to GLP-1, glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP), secreted from enteroendocrine K-cells, physiologically stimulates insulin secretion via a distinct GIP receptor (GIPR) in beta-cells. Beyond the beta-cell, GIP and GLP-1 appear to exert divergent actions for the control of glucose homeostasis. Moreover, I illustrate that physiological and pharmacological GLP-1R signalling may be comparatively more important for the preservation of beta-cell mass and glucose homeostasis in murine streptozotocin-induced diabetes. Lastly, studies in rodents and humans have showed that metformin increases circulating levels of GLP-1, leading us to hypothesize that GIP and GLP-1 may be involved in the glucoregulatory effects of metformin. Interestingly, transcripts for the Glp1r and Gipr were significantly increased within islets of metformin-treated mice, and metformin treatment enhanced the sensitivity of cultured beta-cells to GIP and GLP-1. In summary, these studies illustrate mechanisms by which enteroendocrine peptides compare and contrast with respect to beta-cell survival and function and the control of glucose homeostasis.

Mechanisms to augment the cellular function and mass of beta-cells may be effective means of treating type 2 diabetes. Important in the physiological control of beta-cell function and nutrient disposal are factors released from gut enteroendocrine cells during nutrient digestion. In enteroendocrine L-cells, post-translational processing of proglucagon gives rise to a number of proglucagon-derived peptides. One such peptide, glucagon-like peptide-1 (GLP-1), acts via its own receptor (GLP-1R) to stimulate beta-cell insulin secretion, proliferation and survival. Another, oxyntomodulin (OXM), weakly activates the GLP-1R and inhibits food intake in a GLP-1R-dependent manner in rodents, which led us to hypothesize that OXM modulates GLP-1R-dependent glucoregulation. While OXM did not mimic the inhibitory effect of GLP-1 on gastric emptying in mice, OXM stimulated insulin secretion, beta-cell survival and improved glucose tolerance in a GLP-1R-dependent manner. In a similar manner to GLP-1, glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP), secreted from enteroendocrine K-cells, physiologically stimulates insulin secretion via a distinct GIP receptor (GIPR) in beta-cells. Beyond the beta-cell, GIP and GLP-1 appear to exert divergent actions for the control of glucose homeostasis. Moreover, I illustrate that physiological and pharmacological GLP-1R signalling may be comparatively more important for the preservation of beta-cell mass and glucose homeostasis in murine streptozotocin-induced diabetes. Lastly, studies in rodents and humans have showed that metformin increases circulating levels of GLP-1, leading us to hypothesize that GIP and GLP-1 may be involved in the glucoregulatory effects of metformin. Interestingly, transcripts for the Glp1r and Gipr were significantly increased within islets of metformin-treated mice, and metformin treatment enhanced the sensitivity of cultured beta-cells to GIP and GLP-1. In summary, these studies illustrate mechanisms by which enteroendocrine peptides compare and contrast with respect to beta-cell survival and function and the control of glucose homeostasis.

Glycemic control in patients with type 2 diabetes (T2D) can be achieved through potentiation of the signalling by glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP). Both incretin hormones have been traditionally characterized to be secreted by distinct enteroendocrine cells within the gut in response to nutrients. Signalling through the incretin receptors stimulates islet hormone release by potentiating glucose-stimulated insulin secretion from the β-cell and decreasing glucagon secretion from the α-cell. However, the bioactivity of GLP-1 and GIP is controlled by post-translational, N-terminal cleavage by the widely expressed serine protease dipeptidyl peptidase 4 (DPP4). As such, DPP4 inhibitors (DPP4i) have been successfully used to treat millions of patients with T2D. DPP4i target the catalytic active site of DPP4 and prevent the cleavage of the incretin hormones, thus prolonging their action. Recently, studies in genetically modified mice have demonstrated that GLP-1 is not solely an intestinally-derived peptide hormone and proposed that islet-derived GLP-1 is required for proper glucose homeostasis. Therefore, with the current study, we sought to assess whether β-cell-derived DPP4 is an important target for the regulation of glycemia. Treatment of Glp1r/Gipr^(β-cell-/-) mice with the DPP4 inhibitor sitagliptin demonstrated that β-cell incretin receptor signaling is required to mediate the beneficial effects of this class of drugs on glucose homeostasis. Additionally, Dpp4^(-/-) mice exhibited a significant reduction in hepatic glucose production during hyperinsulinemic-euglycemic clamps. Dpp4 mRNA, DPP4 protein and activity are present in isolated mouse islets, further supporting the islet as an important potential site of DPP4i action. In this study, we show that both DPP4i-treated wildtype islets and islets isolated from Dpp4^(β-cell-/-) mice exhibit increased glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) during perifusion after a high-fat diet feeding. Genetic elimination of Dpp4 from islet β-cells also improved oral glucose tolerance and insulin sensitivity in female mice, but had no effects on circulating DPP4 or incretin levels. Finally, eliminating Dpp4 from β-cells or the whole pancreas did not improve whole-body glucose tolerance, response to DPP4i, insulin tolerance, or body weight in male mice fed chow or a high-fat diet. Therefore, we provide evidence for islet-derived DPP4 to have a role in local hormone responses to glucose; however, its role in systemic glucose metabolism is shown to be sex-dependent.