MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas envolvidos na regulação pós-transcricional da expressão gênica. Análises de expressão em larga escala identificaram aumento da expressão de miR-146b-5p no carcinoma papilífero (PTC), o subtipo mais prevalente do câncer de tiróide. Uma análise in silico apontou SMAD4, um membro da via de sinalização de TGFbeta, como potencial alvo de miR-146b-5p. A via de TGFbeta é uma via inibitória da proliferação da célula folicular, contudo o mecanismo de escape do sinal inibitório de TGFbeta pela célula tumoral tiroideana permanence não esclarecido. A expressão de miR-146b-5p em linhagem normal PCCL3 diminuiu os níveis de SMAD4, conferindo resistência ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta e aumentando a proliferação celular. A inibição de miR-146b-5p em linhagens de PTC aumentou os níveis de SMAD4, restaurou a resposta ao sinal anti-proliferativo de TGFbeta, diminuindo a proliferação celular. Os dados obtidos neste trabalho revelam o papel oncogênico de miR-146b-5p como um regulador negativo da via de TGFbeta. / MicroRNAs are small non-coding RNAs involved in post-transcriptional gene regulation. Large-scale analyses revealed that miR-146b-5p is overexpressed in papillary carcinomas (PTC), the most prevalent form of thyroid cancer. A computational analysis indicated SMAD4, an important member of the TGF-<font face=\"Symbol\">b signaling pathway, as a putative target of miR-146b-5p. The TGFbeta pathway is a negative regulator of thyroid follicular cell growth, and the mechanism by which thyroid cancer cells evade its inhibitory signal remains unclear. The overexpression of miR-146b-5p in normal follicular PCCL3 cells decreased SMAD4 levels, conferred resistance to TGFbeta anti-proliferative signal and increased cell proliferation. The specific inhibition of miR-146b-5p in papillary carcinoma cell lines significantly increased SMAD4 levels, restored the TGFbeta signal transduction and decreased cell growth. Altogether, our data confirm the oncogenic role of miR-146b-5p in thyroid follicular cells as a negative regulator of TGFbeta signaling pathway.

O carcinoma diferenciado de tireóide (CDT) abrange 95% de todas as doenças malignas da tireóide. Nos EUA, aumentou em 2,4 vezes nos últimos anos (1973-2002). O seu tratamento inclui tireoidectomia total, seguido por terapia com radioiodo e supressão do TSH com L-tiroxina. A doença pode recidivar em ~20% dos casos, sendo necessária avaliação periódica através de exames de imagens e dosagem de tireoglobulina sérica (TGs). Os Anticorpos (Acs) anti-TG podem ser detectados em 15 a 25% dos pacientes, comprometendo, parcialmente, o uso da TGs como marcador de recidiva do câncer. Um método alternativo proposto para monitorar os pacientes é a detecção de células tireoidianas em sangue periférico, através da mensuração do RNA mensageiro de TG (RNAm-TG) pela técnica de RTPCR em tempo real. Esta nova metodologia aumenta a sensibilidade da detecção desta molécula. O objetivo deste estudo é verificar a significância da quantificação do RNAm-TG, como método diagnóstico complementar no acompanhamento a longo prazo de pacientes com CDT. Amostras de sangue de 45 pacientes (25 sem metástase, 14 com metástase ganglionar e 6 com metástase à distância) foram coletadas nos tempos: antes e 24, 48, 72 horas, 7 dias, 1, 3, 6, 9 meses, 1, 2, 4, 5, 6 e 7 anos após a dose ablativa de radioiodo. Foi realizada extensiva padronização da técnica com a finalidade de excluir interferências metodológicas, empregando dois genes controles interno (GAPDH e HPRT1) para o cálculo da concentração do RNAm-TG. Concomitantemente foi realizada a mensuração de TGs, perfil hormonal e de anticorpos anti-TG. A pesquisa de corpo inteiro, realizada 7 dias após a dose terapêutica, estabeleceu o estadio clínico inicial dos pacientes. Não foi possível estabelecer um valor de corte para o RNAm-TG. O RNAm-TG não diferenciou os estadios clínicos da doença ao longo do tempo, independente do gene controle interno utilizado, e tampouco quando analisaram-se os dados na presença de Acs anti-TG e TSH30ng/mL. A TGs diferenciou os estadios clínicos ao longo do tempo. Concluiu-se que, o RNAm-TG não é um bom marcador de recidiva do CDT, mesmo quando considerou-se critérios de padronização da técnica, avaliação em longo prazo e presença de Acs anti-TG, sendo assim não poderia ser utilizado como método diagnóstico complementar no acompanhamento de pacientes com CDT. Este estudo demonstra que a técnica de RT-PCR em tempo real é muito sensível perdendo especificidade, inviabilizando sua utilização no acompanhamento dos pacientes com CDT / The differentiated thyroid carcinoma (DTC) encloses 95% of all thyroid malignant disease. In USA, it increased 2,4 times in recent years (1973- 2002). The treatment includes total thyroidectomy, ablation with radioiodine (RAI) followed by TSH suppression with L-Thyroxine. The cancer recurrence occurs in 20% of the cases. Periodic evaluation through imaging examinations and serum thyroglobulin (TG) measurements by imunoassays method is recommended for careful follow-up of these patients. The anti-TG antibodies prevalence is 15-25% and would impair, partially, the serum TG use as a tumor marker. An alternative method to identify the recurrence of the tumor is the thyroid cells detection in peripheral blood, through the TG messenger RNA quantification (mRNA-TG) by real time RT-PCR. This new methodology increases the sensitivity detection for this molecule. The objective of this study was to verify the mRNA-TG peripheral blood quantification significance, as a complementary diagnostic method in the long term follow up of patients with DTC. Fourty five blood samples from patients with DTC have been collected before and 24, 48, 72 hours, 7 days, 1, 3, 6, 9 months, 1, 2, 4, 5, 6 and 7 years after the ablation therapy. Extensive technique standardization for mRNA-TG measurements was carried out to exclude methodological interventions and two housekeeping genes (GAPDH and HPRT1) were used to calculate the mRNA-TG concentrations. Concomitantly, serum TG measurements, hormonal profile and antibodies anti-TG assays were performed. The whole body scan was performed 7 days after RAI ablation to determine the stage of the disease. It was not possible to establish a cut-point value for mRNA-TG. The mRNA-TG did not differentiated the clinical stage of the disease in the long term follow-up and neither in the presence of anti-TG antibodies and TSH30ng/mL. Serum TG was able to differentiate the clinical stage of the patients during the follow-up. In conclusion mRNA-TG is not a good marker for the DCT recurrence, even when technical standardization, long term evaluation and the presence of antibodies anti-TG were considered. Thus it could not be used as a complementary diagnostic method in the DTC patients follow-up. This study confirmed the high sensivity of the real time RT-PCR whereas with very low specificity, consequently is unviable to be used in the DTC patients follow-up

INTRODUÇÃO: Os carcinomas papilífero e folicular são neoplasias malignas primárias da glândula tireóide. Em conjunto, recebem o nome de carcinoma bem diferenciado. Determinar o risco individual da ocorrência de metástase nesses casos auxilia na seleção da terapêutica que é atualmente baseada na classificação de acordo com fatores prognósticos, aos quais pode ser associada a pesquisa de marcadores biológicos. Dentre eles, destaca-se a galectina-3, cujas funções exercidas nos compartimentos celulares foram descritas em uma variedade de neoplasias. Entretanto, seu papel no carcinoma tireóideo permanece controverso. Com o intuito de investigar se a galectina-3 pode auxiliar na predição do risco individual da ocorrência de metástase e se está associada aos critérios de malignidade do carcinoma bem diferenciado, a presente pesquisa objetivou verificar as seguintes hipóteses: 1) se há diferença da imunoexpressão da galectina-3 nos compartimentos do tireócito maligno entre os doentes com e sem metástase e se é possível predizer o risco de metástase em função da quantificação digital desse marcador; 2) se há diferença da imunoexpressão da galectina-3 entre o tecido tireóideo maligno e o não neoplásico; conforme a presença de invasão tecidual; e conforme a sobrevivência; 3) se há indício do envolvimento da galectina-3 com apoptose, indução da proliferação celular e angiogênese. MÉTODO: Trata-se de estudo retrospectivo de caso-controle que envolveu 109 doentes operados por carcinoma bem diferenciado da tireóide e seguidos por mais de cinco anos, distribuídos em dois grupos equivalentes: com e sem metástase. Foram feitos coleta de dados clínicos, avaliação anátomo-patológica e análise imunohistoquímica digital dos biomarcadores galectina-3, Ki-67, caspase-3 e CD-34. RESULTADOS: 1) A média do índice de positividade nucleolar da galectina-3 foi maior no grupo de doentes com metástase linfática cervical (1,78 ± 0,41 nucléolos/CGA contra 0,35 ± 0,13, p=0,004). A expressão nucleolar da galectina-3 apresentou especificidade de 75% para identificação da ocorrência de metástase e foi fator independente associado à ocorrência metástase linfática (p=0,01). A equação logística obtida permitiu calcular o risco individual de desenvolvimento de metástase linfática cervical que é próximo a 100% quando a galectina-3 está imunoexpressa em quatro ou mais nucléolos por campo microscópico de grande aumento. 2) não houve expressão da galectina-3 no tireócito não neoplásico; o índice de expressão citoplasmático foi fator independente associado à presença de invasão linfática (p=0,013) e a média desse índice foi maior nos casos com extensão extratireóidea (52,7 ± 3,9 uo/µm2 contra 41,0 ± 4,0, p=0,037); não houve associação dos índices de imunoexpressão da galectina-3 e sobrevivência; 3) no grupo de doentes com metástase, a expressão nucleoplasmática da galectina-3 correlacionou-se de forma positiva com o índice de positividade do Ki-67 e, nos dois grupos, a expressão citoplasmática com o índice de expressão da caspase-3. CONCLUSÕES: Foi possível predizer o risco individual da ocorrência de metástase linfática cervical em função da quantificação digital da imunoexpressão nucleolar da galectina-3. O presente estudo sugere que alta expressão citoplasmática está associada com algumas características de invasão local. Houve indícios do envolvimento da galectina-3 com indução da proliferação celular e apoptose no grupo de doentes com metástase. / INTRODUCTON: Papillary and follicular carcinomas are primary malignant neoplasias of the thyroid gland and are classified as well-differentiated carcinoma. In these cases, determination of individual risk of metastasis allows offering an adequate treatment. Nowadays therapy is chosen based on classification according to prognostic factors and biomarkers can be associated with them. Galectin-3 is one of these markers and has been thoroughly studied. A wide range of functions that it carries out in the subcellular compartments have been described in several neoplasms. However, its role in thyroid carcinomas remains controversial. In order to investigate if galectin-3 can be used to predict the individual risk of metastasis and if this marker is associated with malignant criteria of well-differentiated carcinoma, this study was proposed to verify the following hypotheses: 1) if galectin-3 immunostaining in subcellular compartments of the malignant thyrocyte is different when comparing patients with and without metastasis and if it is possible to predict the individual risk of metastasis based on digital quantification of the galectin-3 immunostaining; 2) if galectin-3 immunoexpression is different from malignant and benign thyroid tissue; according to tissue invasion and survival; 3) if there are indications that galectin-3 plays a role in apoptosis and cell proliferation or angiogenesis induction. METHODS: It was performed a retrospective case-control study involving 109 patients treated for well-differentiated thyroid carcinoma and followed up for more than five years. They were divided into two equivalent groups: with and without metastasis. The search of clinical data, morphological evaluation and digital immunohistochemical analysis with galectin-3, Ki-67, caspase-3 and CD-34 antibodies were done. RESULTS: 1) the average of the nucleolar galectin-3 positive index was higher in lymph node metastasis group (1.78 ± 0.41 nucleoli/HPF versus 0.35 ± 0.13, P=.004). Nucleolar staining was an independent factor associated with lymph node metastasis (P=.01) and its specificity to identify metastasis was 75%. The logistic model allowed predicting the individual risk of cervical lymph node metastasis. It was almost 100% for carcinomas displaying more than four galectin-3 immunostained nucleoli by microscopic high power field. 2) There was no galectin-3 immunostaining in non-neoplasic thyrocyte; the cytoplasmic galectin-3 expression index was an independent factor associated with lymphatic invasion (P=.013) and these index average was higher in cases with extrathyroidal extension (52.7 ± 3.9 uo/µm2 versus 41.0 ± 4.0, P=.037); there was no association of galectin-3 immunostaining indexes with survival; 3) in the metastasis group, there was positive correlation between nucleoplasmic staining of galectin-3 and Ki-67 positive index; there was positive correlation between cytoplasmic staining of galectin-3 and caspase-3 positive index in both groups. CONCLUSION: It was possible to predict the individual risk of cervical lymph node metastasis based on digital quantification of the nucleolar galectin-3 immunostaining. This study suggests that there is association of high cytoplasmic expression with local tissue invasion. In the metastasis group there were indications that galectin-3 plays a role in cell proliferation and apoptosis induction.

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Os mecanismos etiopatogênicos que levam ao desenvolvimento dos nódulos e tumores da tireoide ainda não são bem conhecidos. É fato estabelecido que a prevalência dessas lesões é maior nas mulheres. Dessa forma, o que nos motivou a realizar esta Tese foi avaliar se os hormônios sexuais femininos tem efeito direto sobre as células de tireoide humanas normais podendo contribuir para a sua etiopatogenia. Este estudo teve como objetivos padronizar um modelo de cultura primária de células foliculares de tireoide humana normal e nesse modelo validar um gene normalizador após tratamento com estradiol e progesterona, avaliar os efeitos da progesterona na expressão dos genes NIS, TG e TPO bem como avaliar a expressão gênica e proteíca e a possível localização intracelular do receptor de membrana GPR30 nestas células. Em nosso modelo de cultura primária em monocamada, as células foliculares mantiveram sua morfologia cubóide característica e permaneceram diferenciadas o que foi evidenciado pela dosagem de tireoglobulina e T4 livre, no sobrenadante do meio de cultura, e pela identificação das proteínas TG e TPO por imunocitoquímica. A estimulação com progesterona aumentou a expressão dos genes NIS, TG e TPO, respectivamente, 1.78 (p=0.003), 1.50 (p=0.034) e 1.64 (p=0.018) vezes, quando comparadas ao grupo tratado somente com TSH. Essa estimulação da progesterona foi inibida por mifepristona sugerindo que a progesterona tem efeito direto nas células foliculares da tireoide e que esse efeito é mediado por seu receptor nuclear. A normalização da expressão gênica foi realizada pelo gene β-actina, o qual demonstrou uma maior estabilidade entre os grupos analisados. Demonstramos também que as células normais da tireoide expressam tanto o gene como a proteína do receptor de membrana GPR30 com possível localização na membrana celular e no espaço perinuclear. / The mechanisms leading to the development of thyroid nodules and tumors are not well established. As these lesions are more common in women, female sex hormones could be involved in the pathogenesis of these disorders. The objectives of this study were to establish a model of primary culture of normal human thyroid follicular cells, to validate a normalizing gene for qRT-PCR after treatment with estradiol and progesterone, to evaluate the effects of progesterone on the expression of genes NIS, TG and TPO, and to evaluate the GPR30 gene and protein expression as well as its possible intracellular location, in these cells. In our model of primary monolayer culture, follicular cells maintained their characteristic cuboid differentiated morphology; and had evidence of differentiated thyroid function: the production of thyroglobulin and free T4, and identification of TG and TPO proteins by immunocytochemistry . Adding progesterone to TSH increased NIS, TG and TPO mRNA, respectively, 1.78 (p=0.003), 1.50 (p=0.034) and 1.64 (p=0.018) folds, compared to the group treated with only TSH. This stimulation was inhibited by mifepristone, suggesting that progesterone has a direct effect on the thyroid follicular cells. Normalization of gene expression was performed using β-actin as reference gene. We have also demonstrated that normal thyroid cells expressed GPR30 gene and protein, which is possibly localized in the plasma membrane and the perinuclear region.

Os mecanismos etiopatogênicos que levam ao desenvolvimento dos nódulos e tumores da tireoide ainda não são bem conhecidos. É fato estabelecido que a prevalência dessas lesões é maior nas mulheres. Dessa forma, o que nos motivou a realizar esta Tese foi avaliar se os hormônios sexuais femininos tem efeito direto sobre as células de tireoide humanas normais podendo contribuir para a sua etiopatogenia. Este estudo teve como objetivos padronizar um modelo de cultura primária de células foliculares de tireoide humana normal e nesse modelo validar um gene normalizador após tratamento com estradiol e progesterona, avaliar os efeitos da progesterona na expressão dos genes NIS, TG e TPO bem como avaliar a expressão gênica e proteíca e a possível localização intracelular do receptor de membrana GPR30 nestas células. Em nosso modelo de cultura primária em monocamada, as células foliculares mantiveram sua morfologia cubóide característica e permaneceram diferenciadas o que foi evidenciado pela dosagem de tireoglobulina e T4 livre, no sobrenadante do meio de cultura, e pela identificação das proteínas TG e TPO por imunocitoquímica. A estimulação com progesterona aumentou a expressão dos genes NIS, TG e TPO, respectivamente, 1.78 (p=0.003), 1.50 (p=0.034) e 1.64 (p=0.018) vezes, quando comparadas ao grupo tratado somente com TSH. Essa estimulação da progesterona foi inibida por mifepristona sugerindo que a progesterona tem efeito direto nas células foliculares da tireoide e que esse efeito é mediado por seu receptor nuclear. A normalização da expressão gênica foi realizada pelo gene β-actina, o qual demonstrou uma maior estabilidade entre os grupos analisados. Demonstramos também que as células normais da tireoide expressam tanto o gene como a proteína do receptor de membrana GPR30 com possível localização na membrana celular e no espaço perinuclear. / The mechanisms leading to the development of thyroid nodules and tumors are not well established. As these lesions are more common in women, female sex hormones could be involved in the pathogenesis of these disorders. The objectives of this study were to establish a model of primary culture of normal human thyroid follicular cells, to validate a normalizing gene for qRT-PCR after treatment with estradiol and progesterone, to evaluate the effects of progesterone on the expression of genes NIS, TG and TPO, and to evaluate the GPR30 gene and protein expression as well as its possible intracellular location, in these cells. In our model of primary monolayer culture, follicular cells maintained their characteristic cuboid differentiated morphology; and had evidence of differentiated thyroid function: the production of thyroglobulin and free T4, and identification of TG and TPO proteins by immunocytochemistry . Adding progesterone to TSH increased NIS, TG and TPO mRNA, respectively, 1.78 (p=0.003), 1.50 (p=0.034) and 1.64 (p=0.018) folds, compared to the group treated with only TSH. This stimulation was inhibited by mifepristone, suggesting that progesterone has a direct effect on the thyroid follicular cells. Normalization of gene expression was performed using β-actin as reference gene. We have also demonstrated that normal thyroid cells expressed GPR30 gene and protein, which is possibly localized in the plasma membrane and the perinuclear region.

O carcinoma diferenciado de tireóide (CDT) abrange 95% de todas as doenças malignas da tireóide. Nos EUA, aumentou em 2,4 vezes nos últimos anos (1973-2002). O seu tratamento inclui tireoidectomia total, seguido por terapia com radioiodo e supressão do TSH com L-tiroxina. A doença pode recidivar em ~20% dos casos, sendo necessária avaliação periódica através de exames de imagens e dosagem de tireoglobulina sérica (TGs). Os Anticorpos (Acs) anti-TG podem ser detectados em 15 a 25% dos pacientes, comprometendo, parcialmente, o uso da TGs como marcador de recidiva do câncer. Um método alternativo proposto para monitorar os pacientes é a detecção de células tireoidianas em sangue periférico, através da mensuração do RNA mensageiro de TG (RNAm-TG) pela técnica de RTPCR em tempo real. Esta nova metodologia aumenta a sensibilidade da detecção desta molécula. O objetivo deste estudo é verificar a significância da quantificação do RNAm-TG, como método diagnóstico complementar no acompanhamento a longo prazo de pacientes com CDT. Amostras de sangue de 45 pacientes (25 sem metástase, 14 com metástase ganglionar e 6 com metástase à distância) foram coletadas nos tempos: antes e 24, 48, 72 horas, 7 dias, 1, 3, 6, 9 meses, 1, 2, 4, 5, 6 e 7 anos após a dose ablativa de radioiodo. Foi realizada extensiva padronização da técnica com a finalidade de excluir interferências metodológicas, empregando dois genes controles interno (GAPDH e HPRT1) para o cálculo da concentração do RNAm-TG. Concomitantemente foi realizada a mensuração de TGs, perfil hormonal e de anticorpos anti-TG. A pesquisa de corpo inteiro, realizada 7 dias após a dose terapêutica, estabeleceu o estadio clínico inicial dos pacientes. Não foi possível estabelecer um valor de corte para o RNAm-TG. O RNAm-TG não diferenciou os estadios clínicos da doença ao longo do tempo, independente do gene controle interno utilizado, e tampouco quando analisaram-se os dados na presença de Acs anti-TG e TSH30ng/mL. A TGs diferenciou os estadios clínicos ao longo do tempo. Concluiu-se que, o RNAm-TG não é um bom marcador de recidiva do CDT, mesmo quando considerou-se critérios de padronização da técnica, avaliação em longo prazo e presença de Acs anti-TG, sendo assim não poderia ser utilizado como método diagnóstico complementar no acompanhamento de pacientes com CDT. Este estudo demonstra que a técnica de RT-PCR em tempo real é muito sensível perdendo especificidade, inviabilizando sua utilização no acompanhamento dos pacientes com CDT / The differentiated thyroid carcinoma (DTC) encloses 95% of all thyroid malignant disease. In USA, it increased 2,4 times in recent years (1973- 2002). The treatment includes total thyroidectomy, ablation with radioiodine (RAI) followed by TSH suppression with L-Thyroxine. The cancer recurrence occurs in 20% of the cases. Periodic evaluation through imaging examinations and serum thyroglobulin (TG) measurements by imunoassays method is recommended for careful follow-up of these patients. The anti-TG antibodies prevalence is 15-25% and would impair, partially, the serum TG use as a tumor marker. An alternative method to identify the recurrence of the tumor is the thyroid cells detection in peripheral blood, through the TG messenger RNA quantification (mRNA-TG) by real time RT-PCR. This new methodology increases the sensitivity detection for this molecule. The objective of this study was to verify the mRNA-TG peripheral blood quantification significance, as a complementary diagnostic method in the long term follow up of patients with DTC. Fourty five blood samples from patients with DTC have been collected before and 24, 48, 72 hours, 7 days, 1, 3, 6, 9 months, 1, 2, 4, 5, 6 and 7 years after the ablation therapy. Extensive technique standardization for mRNA-TG measurements was carried out to exclude methodological interventions and two housekeeping genes (GAPDH and HPRT1) were used to calculate the mRNA-TG concentrations. Concomitantly, serum TG measurements, hormonal profile and antibodies anti-TG assays were performed. The whole body scan was performed 7 days after RAI ablation to determine the stage of the disease. It was not possible to establish a cut-point value for mRNA-TG. The mRNA-TG did not differentiated the clinical stage of the disease in the long term follow-up and neither in the presence of anti-TG antibodies and TSH30ng/mL. Serum TG was able to differentiate the clinical stage of the patients during the follow-up. In conclusion mRNA-TG is not a good marker for the DCT recurrence, even when technical standardization, long term evaluation and the presence of antibodies anti-TG were considered. Thus it could not be used as a complementary diagnostic method in the DTC patients follow-up. This study confirmed the high sensivity of the real time RT-PCR whereas with very low specificity, consequently is unviable to be used in the DTC patients follow-up

Os mecanismos etiopatogênicos que levam ao desenvolvimento dos nódulos e tumores da tireoide ainda não são bem conhecidos. É fato estabelecido que a prevalência dessas lesões é maior nas mulheres. Dessa forma, o que nos motivou a realizar esta Tese foi avaliar se os hormônios sexuais femininos tem efeito direto sobre as células de tireoide humanas normais podendo contribuir para a sua etiopatogenia. Este estudo teve como objetivos padronizar um modelo de cultura primária de células foliculares de tireoide humana normal e nesse modelo validar um gene normalizador após tratamento com estradiol e progesterona, avaliar os efeitos da progesterona na expressão dos genes NIS, TG e TPO bem como avaliar a expressão gênica e proteíca e a possível localização intracelular do receptor de membrana GPR30 nestas células. Em nosso modelo de cultura primária em monocamada, as células foliculares mantiveram sua morfologia cubóide característica e permaneceram diferenciadas o que foi evidenciado pela dosagem de tireoglobulina e T4 livre, no sobrenadante do meio de cultura, e pela identificação das proteínas TG e TPO por imunocitoquímica. A estimulação com progesterona aumentou a expressão dos genes NIS, TG e TPO, respectivamente, 1.78 (p=0.003), 1.50 (p=0.034) e 1.64 (p=0.018) vezes, quando comparadas ao grupo tratado somente com TSH. Essa estimulação da progesterona foi inibida por mifepristona sugerindo que a progesterona tem efeito direto nas células foliculares da tireoide e que esse efeito é mediado por seu receptor nuclear. A normalização da expressão gênica foi realizada pelo gene β-actina, o qual demonstrou uma maior estabilidade entre os grupos analisados. Demonstramos também que as células normais da tireoide expressam tanto o gene como a proteína do receptor de membrana GPR30 com possível localização na membrana celular e no espaço perinuclear. / The mechanisms leading to the development of thyroid nodules and tumors are not well established. As these lesions are more common in women, female sex hormones could be involved in the pathogenesis of these disorders. The objectives of this study were to establish a model of primary culture of normal human thyroid follicular cells, to validate a normalizing gene for qRT-PCR after treatment with estradiol and progesterone, to evaluate the effects of progesterone on the expression of genes NIS, TG and TPO, and to evaluate the GPR30 gene and protein expression as well as its possible intracellular location, in these cells. In our model of primary monolayer culture, follicular cells maintained their characteristic cuboid differentiated morphology; and had evidence of differentiated thyroid function: the production of thyroglobulin and free T4, and identification of TG and TPO proteins by immunocytochemistry . Adding progesterone to TSH increased NIS, TG and TPO mRNA, respectively, 1.78 (p=0.003), 1.50 (p=0.034) and 1.64 (p=0.018) folds, compared to the group treated with only TSH. This stimulation was inhibited by mifepristone, suggesting that progesterone has a direct effect on the thyroid follicular cells. Normalization of gene expression was performed using β-actin as reference gene. We have also demonstrated that normal thyroid cells expressed GPR30 gene and protein, which is possibly localized in the plasma membrane and the perinuclear region.

INTRODUÇÃO: Os carcinomas papilífero e folicular são neoplasias malignas primárias da glândula tireóide. Em conjunto, recebem o nome de carcinoma bem diferenciado. Determinar o risco individual da ocorrência de metástase nesses casos auxilia na seleção da terapêutica que é atualmente baseada na classificação de acordo com fatores prognósticos, aos quais pode ser associada a pesquisa de marcadores biológicos. Dentre eles, destaca-se a galectina-3, cujas funções exercidas nos compartimentos celulares foram descritas em uma variedade de neoplasias. Entretanto, seu papel no carcinoma tireóideo permanece controverso. Com o intuito de investigar se a galectina-3 pode auxiliar na predição do risco individual da ocorrência de metástase e se está associada aos critérios de malignidade do carcinoma bem diferenciado, a presente pesquisa objetivou verificar as seguintes hipóteses: 1) se há diferença da imunoexpressão da galectina-3 nos compartimentos do tireócito maligno entre os doentes com e sem metástase e se é possível predizer o risco de metástase em função da quantificação digital desse marcador; 2) se há diferença da imunoexpressão da galectina-3 entre o tecido tireóideo maligno e o não neoplásico; conforme a presença de invasão tecidual; e conforme a sobrevivência; 3) se há indício do envolvimento da galectina-3 com apoptose, indução da proliferação celular e angiogênese. MÉTODO: Trata-se de estudo retrospectivo de caso-controle que envolveu 109 doentes operados por carcinoma bem diferenciado da tireóide e seguidos por mais de cinco anos, distribuídos em dois grupos equivalentes: com e sem metástase. Foram feitos coleta de dados clínicos, avaliação anátomo-patológica e análise imunohistoquímica digital dos biomarcadores galectina-3, Ki-67, caspase-3 e CD-34. RESULTADOS: 1) A média do índice de positividade nucleolar da galectina-3 foi maior no grupo de doentes com metástase linfática cervical (1,78 ± 0,41 nucléolos/CGA contra 0,35 ± 0,13, p=0,004). A expressão nucleolar da galectina-3 apresentou especificidade de 75% para identificação da ocorrência de metástase e foi fator independente associado à ocorrência metástase linfática (p=0,01). A equação logística obtida permitiu calcular o risco individual de desenvolvimento de metástase linfática cervical que é próximo a 100% quando a galectina-3 está imunoexpressa em quatro ou mais nucléolos por campo microscópico de grande aumento. 2) não houve expressão da galectina-3 no tireócito não neoplásico; o índice de expressão citoplasmático foi fator independente associado à presença de invasão linfática (p=0,013) e a média desse índice foi maior nos casos com extensão extratireóidea (52,7 ± 3,9 uo/µm2 contra 41,0 ± 4,0, p=0,037); não houve associação dos índices de imunoexpressão da galectina-3 e sobrevivência; 3) no grupo de doentes com metástase, a expressão nucleoplasmática da galectina-3 correlacionou-se de forma positiva com o índice de positividade do Ki-67 e, nos dois grupos, a expressão citoplasmática com o índice de expressão da caspase-3. CONCLUSÕES: Foi possível predizer o risco individual da ocorrência de metástase linfática cervical em função da quantificação digital da imunoexpressão nucleolar da galectina-3. O presente estudo sugere que alta expressão citoplasmática está associada com algumas características de invasão local. Houve indícios do envolvimento da galectina-3 com indução da proliferação celular e apoptose no grupo de doentes com metástase. / INTRODUCTON: Papillary and follicular carcinomas are primary malignant neoplasias of the thyroid gland and are classified as well-differentiated carcinoma. In these cases, determination of individual risk of metastasis allows offering an adequate treatment. Nowadays therapy is chosen based on classification according to prognostic factors and biomarkers can be associated with them. Galectin-3 is one of these markers and has been thoroughly studied. A wide range of functions that it carries out in the subcellular compartments have been described in several neoplasms. However, its role in thyroid carcinomas remains controversial. In order to investigate if galectin-3 can be used to predict the individual risk of metastasis and if this marker is associated with malignant criteria of well-differentiated carcinoma, this study was proposed to verify the following hypotheses: 1) if galectin-3 immunostaining in subcellular compartments of the malignant thyrocyte is different when comparing patients with and without metastasis and if it is possible to predict the individual risk of metastasis based on digital quantification of the galectin-3 immunostaining; 2) if galectin-3 immunoexpression is different from malignant and benign thyroid tissue; according to tissue invasion and survival; 3) if there are indications that galectin-3 plays a role in apoptosis and cell proliferation or angiogenesis induction. METHODS: It was performed a retrospective case-control study involving 109 patients treated for well-differentiated thyroid carcinoma and followed up for more than five years. They were divided into two equivalent groups: with and without metastasis. The search of clinical data, morphological evaluation and digital immunohistochemical analysis with galectin-3, Ki-67, caspase-3 and CD-34 antibodies were done. RESULTS: 1) the average of the nucleolar galectin-3 positive index was higher in lymph node metastasis group (1.78 ± 0.41 nucleoli/HPF versus 0.35 ± 0.13, P=.004). Nucleolar staining was an independent factor associated with lymph node metastasis (P=.01) and its specificity to identify metastasis was 75%. The logistic model allowed predicting the individual risk of cervical lymph node metastasis. It was almost 100% for carcinomas displaying more than four galectin-3 immunostained nucleoli by microscopic high power field. 2) There was no galectin-3 immunostaining in non-neoplasic thyrocyte; the cytoplasmic galectin-3 expression index was an independent factor associated with lymphatic invasion (P=.013) and these index average was higher in cases with extrathyroidal extension (52.7 ± 3.9 uo/µm2 versus 41.0 ± 4.0, P=.037); there was no association of galectin-3 immunostaining indexes with survival; 3) in the metastasis group, there was positive correlation between nucleoplasmic staining of galectin-3 and Ki-67 positive index; there was positive correlation between cytoplasmic staining of galectin-3 and caspase-3 positive index in both groups. CONCLUSION: It was possible to predict the individual risk of cervical lymph node metastasis based on digital quantification of the nucleolar galectin-3 immunostaining. This study suggests that there is association of high cytoplasmic expression with local tissue invasion. In the metastasis group there were indications that galectin-3 plays a role in cell proliferation and apoptosis induction.