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Thèse de doctorat : Pharmacologie : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

L’effet de proximité est essentiel à la réussite de la stratégie thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) dans le traitement du cancer. Cette propriété correspond au transfert de GCV phosphorylé des cellules tumorales HSV-tk+ vers les cellules tumorales HSV-tk–, et est essentiellement médiée par les jonctions gap (JGs) constituées de molécules de connexine (Cx). Une perte d’expression et/ou une localisation périnucléaire des connexines est souvent décrite dans les tumeurs, ce qui pourrait conduire, en théorie, à une diminution de l’efficacité du traitement HSV-tk/GCV. L’approche HSV-tk/GCV a été testée au cours d’essais cliniques pour le traitement du glioblastome bien que l’expression de la Cx43 (principal constituant des JGs dans les astrocytes) ne soit parfaitement définie. Au cours de mes travaux, l’expression de la Cx43, sa localisation et sa fonctionnalité ont été étudiées dans des lignées établies, des biopsies et des cultures primaires de glioblastome. Dans les trois lignées immortalisées de glioblastome étudiées, la Cx43 se retrouve essentiellement localisée dans les endosomes et les lysosomes comparativement aux cellules HeLa/Cx43 qui présentent une localisation membranaire de la Cx43. Des JGs ont été observées dans la lignée U87, mais très peu dans les lignées SKI-1 et U251. De façon surprenante, les lignées SKI-1 et U87 présentent une capacité jonctionnelle supérieure à celle des cellules HeLa/Cx43. De plus, un important effet de proximité a pu être mesuré dans les cellules SKI-1 et U87 suite au traitement par le GCV. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la perméabilité des JGs a confirmé que l’effet de proximité induit dans ces lignées est principalement dû aux JGs. De plus, la transfection d’un mutant dominant négatif de la Cx43 ou de siARN spécifiques des ARNm de la Cx43 a permis d’identifier la Cx43 comme le principal constituant des JGs dans ces lignées de glioblastome. L’expression de la Cx43 a été mesurée sur soixante-quatorze biopsies de glioblastome. Si son expression est souvent plus faible que dans le tissu sain, seulement 23% des échantillons sont dépourvus de Cx43. Huit lignées primaires ont été dérivées de résections de patients, et sept d’entre elles expriment la Cx43, cependant à différents niveaux d’intensité. Quatre lignées démontrent une localisation cytoplasmique de la Cx43. Malgré la localisation cytoplasmique prédominante de la Cx43, ces cellules sont capables de communiquer entre elles efficacement comme l’essai de double marquage en cytométrie de flux l’a démontré. Un vecteur lentiviral contenant le gène HSV-tk a été construit afin de mener les tests d’effet de proximité. Il a ainsi été mis en évidence que quelle que soit la localisation de la Cx43, l’effet de proximité est significatif dans toutes les lignées exprimant la Cx43 et inexistant lorsque la Cx43 n’est pas présente. Ces résultats démontrent que la Cx43 est exprimée dans la majorité des glioblastomes. La Cx43 peut être exprimée dans les lignées établies et les lignées primaires de glioblastome au niveau de la membrane plasmique ou dans le cytoplasme. Cette localisation aberrante ne bloque pas le transfert intercellulaire de molécules, ce qui suggère que les rares JGs présentes à la surface sont hautement fonctionnelles. Ces résultats indiquent que l’approche HSV-tk/GCV est un candidat valable pour le traitement du glioblastome, contrairement à d’autres tumeurs pour lesquelles la perte d’expression de Cx est bien documentée. Il serait ainsi intéressant que l’expression de la Cx43 soit étudiée dans les biopsies utilisées lors du diagnostic et constitue ainsi un prérequis pour le recrutement des patients lors d’essais cliniques. / The bystander effect is essential to the success of the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk)/ganciclovir (GCV) strategy for cancer therapy. It consists of the transfer of phosphorylated GCV from HSV-tk+ cells to neighboring HSV-tk- cells, and it is mainly mediated via gap junctions that are made up of connexin molecules (Cx). Down-regulation and/or perinuclear localization of Cxs are common in tumors, and in theory it should decrease the efficacy of the HSV-tk/GCV treatment. The HSV-tk/GCV approach has been tested in glioblastoma patients although the status of Cx43 expression (the Cx member expressed in astrocytes) is unclear in this tumor type. In this study, we have carefully evaluated the Cx43 expression, specific localization and functionality in glioblastoma cell lines, biopsies and primary glioblastoma cell cultures. In the glioblastoma cell lines studied (SKI-1, U251 and U87), Cx43 accumulated mainly in late endosomes and lysosomes as compared to HeLa/Cx43 transfected cells that displayed Cx43 at the cellular membrane. Gap junctions were observed in U87 cells, but very few or rare plaques were present at the surface of SKI-1 and U251 cells, respectively. Surprisingly, calcein, a dye commonly used to assess the functionality of gap junctions, was able to diffuse more efficiently within U87 and SKI-1 cells than in HeLa/Cx43 cells. Furthermore, a strong bystander effect was mediated by HSV-tk+ SKI-1 and U87 cells treated with GCV. The use of a specific inhibitor of gap junction permeability, confirmed that the bystander effect in these cell lines was mainly due to gap junctions. Moreover, transfection of a Cx43 dominant negative mutant and specific siRNA against Cx43 mRNA defined this Cx subtype as the major component of gap junctions in these glioblastoma cell lines. The level of Cx43 expression was next assessed in seventy-four glioblastoma biopsies. Cx43 expression was mainly lower than in normal tissue, but only 23% of the glioblastoma samples studied lacked Cx43 expression. Eight glioblastoma primary cultures were derived from surgical resection, and seven of them expressed Cx43, although at different levels. A cytoplasmic localization of Cx43 was also observed in four primary cultures. Despite this predominant intracellular accumulation of Cx43, cells were able to communicate in an efficient manner as demonstrated with a dye transfer assay. A lentiviral vector containing HSV-tk has been constructed and bystander effect experiments with these primary glioblastoma cells were carried out. We noticed that the bystander effect was significative in primary cells expressing Cx43 wherever the Cx43 was localized, and no bystander effect was detected in cells without Cx43 expression. Our results indicate that Cx43 is expressed in the majority of glioblastomas. Cx43 can be found in glioblastoma cell lines and primary cultures at the cell surface, but also in perinuclear areas. This aberrant localization of Cx43 did not prevent the diffusion of molecules, suggesting that the few gap junction plaques present in glioblastoma cells are highly functional. These results suggest that glioblastoma is a suitable candidate for the HSV-tk/GCV approach contrary to some other tumor types in which the lack of Cx has been well documented. According to these results, the level of Cx43 should be tested in patient biopsies used for diagnostics and considered for patient enrollment in clinical trials.

Sur le plan neuropathologique, les glioblastomes sont des lésions complexes, composées de cellules tumorales pléomorphes et migrantes, de vaisseaux anormaux en prolifération, de macrophages associés aux tumeurs et de plages de nécrose. Plus récemment, la démonstration de lexistence de cellules de glioblastome présentant des propriétés de cellules souches permit de relier ces éléments ensemble en suggérant pour la première fois une vision globale de la tumeur et de son interaction parfois fine avec son microenvironnement (Singh et al., 2004), puisque ces cellules sont même capables dadopter un destin endothélial et vasculaire (Bautch, 2010). Lexistence de ces cellules-initiatrices de gliome suggèrent en effet une hiérarchie cellulaire générant une organisation complexe et adaptative de la tumeur. Les mécanismes moléculaires à la base de lapparition, de la croissance et de la résistance thérapeutique de ces cancers ne sont cependant pas encore clairs et la compréhension de leur biologie reste donc une priorité. Dans ce travail, nous sommes partis de lhypothèse originale que les CIGs pourraient avoir des relations privilégiées avec les zones neurogéniques dans un cerveau adulte. Cest la raison pour laquelle nous avons réalisé une injection striatale droite de 50.000 cellules de glioblastome humain dans le cerveau de souris immunodéficientes adultes. Une fraction limitée des cellules injectées envahit spécifiquement les ZSVs de lhôte. Nous navons par contre jamais observé une migration vers le GD, lautre région neurogénique du cerveau adulte. Tout comme les progéniteurs neuronaux de la ZSV migrent le long du RMS vers le BO, ces cellules tumorales peuvent gagner le BO via la même route. De plus, ces cellules localisées dans la ZSV répondent aux principaux critères didentification dune CIG. Il semble donc y avoir une attirance particulière de la ZSV vis-à-vis de CIGs localisées à distance. Etant donné cette activité migratoire spécifique, nous avons tenté de caractériser le rôle éventuel de lOPN dans des cellules souches de gliome. Dans les cellules cancéreuses en général, lOPN est impliquée dans lactivité migratoire, lenvahissement tissulaire et la propagation des métastases. En collaboration avec le laboratoire de Vincent Castronovo, nous avons pu montrer que linhibition de lexpression de lOPN dans des cellules U87MG en culture maintenait lexpression des ARNm codant pour Sox2, Oct3/4 et Nanog à leur niveau de base et empêchait la formation de sphères en présence dun milieu de culture constitué de DMEM F12/B27 suppléé de EGF et bFGF. Ces premiers résultats obtenus in vitro suggérant un rôle de lOPN dans l'acquisition dun phénotype «souche» ont été confirmés par une étude in vivo, puisque la xénogreffe de cellules U87MG déficientes pour lOPN conduit à la perte de leur capacité à initier une tumeur. Enfin, toujours dans ce contexte de répartition de rôles pour différentes cellules au sein de la tumeur (hiérarchie), nous avons également étudié certains aspects des rapports existant entre les cellules tumorales. En collaboration avec le laboratoire de Pierre Robe, nous avons ainsi pu suggérer un rôle de «suppresseur de tumeur» pour une protéine impliquée dans le couplage cellulaire, en loccurrence la Cx30. En plus de la diminution de la prolifération tumorale dans des modèles expérimentaux in vitro et in vivo induite par une expression forcée de la Cx30, nous avons observé que le nombre de copie du gène codant pour la Cx30, soit GJB6 sur le chromosome 13q12, était fréquemment diminué dans les glioblastomes. De même, lexpression du transcrit de la Cx30 est plus faible dans les glioblastomes que dans les gliomes de bas grade ou encore chez les patients sains et son absence est corrélée à une altération des voies PI3K/Akt et ERK-MAPK.

Les glioblastomes sont, de par leur caractère invasif et infiltrant, des tumeurs cérébrales extrêmement résistantes aux thérapies classiques. Nous avons étudié les propriétés anti-cancérigènes de polyphénols extraits de produits naturels, notamment l'acide chlorogénique (CHL). Le CHL est un puissant inhibiteur fonctionnel du transporteur microsomale de glucose-6-phosphate (G6PT) responsable de l'étape limitante de la conversion du glucose-6-phosphate en glucose (Glc) et en phosphate inorganique par la glucose-6-phosphase (G6Pase) lors de la glyconéogenèse et de la glycogénolyse. En émettant l'hypothèse selon laquelle le système G6Pase se localise exclusivement dans les tissus glyconéogéniques tels que le foie et les reins, nos travaux ont alors pour objectif d'élucider le rôle de G6PT dans des tissus non producteurs de Glc tels les cellules gliales, et particulièrement dans la progression tumorale des glioblastomes. Au cours de notre étude, nous avons testé l'impact de l'inhibition de G6PT soit fonctionnelle par le CHL, soit génique par un siRNA spécifique, sur différents processus impliqués dans la survie et l'invasion tumorale tel que la migration cellulaire et la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC) par les métalloprotéases (MMPs). Expérimentalement, les mesures des niveaux d'ARNm par RT-PCR, démontrent que l'expression génique de G6PT est plus élevée dans les glioblastomes U87, que dans toute autre lignée tumorale cérébrale testée. Le CHL inhibe la sécrétion de la MMP-2, et la migration cellulaire des U87, deux pré-requis pour l'invasion tumorale. La migration induite par G6PT recombinant suite à une transfection des cellules à l'aide du cDNA codant pour ce transporteur est aussi inhibée par le CHL. De plus, le CHL inhibe la migration cellulaire et la phosphorylation de ERK induite en réponse à la sphingosine-1-phosphate, un lysophospholipide abondant dans la MEC cérébrale. Nous démontrons, de plus, que le 2-deoxy-D-Glc et le 5-thio-Glc, deux analogues non métabolisables du Glc et menant à la déplétion de l'ATP intracellulaire, inhibent la sécrétion de MMP-2. Par ailleurs, l'inhibition de G6PT par un siRNA induit une mort cellulaire par apoptose détectée par cytométrie de flux. Une surexpression de la métalloprotéase membranaire de type 1 (MT1 -MMP) conduit à une diminution de l'expression génique de G6PT. De manière globale, nos résultats suggèrent que G6PT régulerait certaines fonctions invasives des cellules cancéreuses, et pourrait avoir une implication dans la signalisation intracellulaire de ces dernières, d'où son potentiel comme nouvelle cible pour les thérapies anti-cancer. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Glucose-6-phosphase, Acide chlorogénique, Glioblastomes.

Thèse doctorat : Neurosciences : Paris 12 : 2003. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 349 réf.

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus agressive. L’échec thérapeutique s’explique par son caractère hétérogène. Nous étudions l’intégrine α5β1, le récepteur de la fibronectine, dont les travaux du laboratoire ont montré l'implication dans l’agressivité du GBM. Il a été observé que l’expression de l’intégrine α5 est hétérogène entre patients et au sein d’une même tumeur. Nous avons émis l’hypothèse que cette hétérogénéité peut être expliquée par l’existence de différentes cellules souches de GBM (CSGs). Nos travaux montrent que certaines CSGs expriment l’intégrine après différentiation, démontrant une hétérogénéité intertumorale. Une expression hétérogène a également été mise en évidence au sein d’une même lignée, indiquant une hétérogénéité intratumorale. Nos résultats démontrent que les CSGs programmées à exprimer l’intégrine forment des cellules différenciées agressives. Nos données montrent que l’intégrine α5 est impliquée dans l’expansion tumorale mais aussi dans la survie et la migration en présence de fibronectine. Ce travail permet de mieux comprendre l’origine de foyers plus agressifs et souligne l’intérêt de l’intégrine α5β1 comme cible thérapeutique pour une sous-population de patients. / Glioblastoma (GBM) is the most aggressive primary brain tumor. Treatment failure is explained by inter and intratumoral heterogeneity. Our previous results showed that the α5β1 integrin, the fibronectin receptor, is implicated in GBM aggressiveness. We observed that its expression was heterogeneous between patients' tumors but also between different areas in a given tumor. We hypothesized that this heterogeneity may be linked to different glioma stem cells (GSC). We confirmed that α5 expression is induced after differentiation in about half of the cell lines supporting the notion of inter-tumoral heterogeneity. We also observed with single cell-derived clone analysis that intra-tumoral GICs heterogeneity exists. We noticed that when GICs are programmed to express α5 integrin, differentiated cells become more aggressive. Our data support that differentiated cells expressing the integrin have an increased capacity of proliferation and acquire a fibronectin-dependent motility and a resistance phenotype. This work provides a better understanding of the origin of more aggressive foci and highlights the interest of α5β1 integrin as a therapeutic target for a subpopulation of patients.

c-MYC est un facteur de transcription oncogénique dont l’expression est dérégulée dans 78% des gliomes. On observe d’ailleurs une corrélation positive entre sa surexpression et le grade des gliomes. De plus, cette surexpression serait essentielle à la survie des cellules souches tumorales, cellules qui seraient davantage résistantes à la chimiothérapie et à la radiothérapie en plus d’avoir un caractère plus invasif. Il a aussi été démontré que l’inhibition de c-MYC par ARN interférents peut sensibiliser les cellules cancéreuses à l’apoptose et réduire leur prolifération. Sa surexpression relative dans les glioblastomes (GBM) est signe de la malignité et l’espérance de vie des patients atteints par ces tumeurs est réduite chez les patients plus âgés. c-MYC doit s’hétérodimériser avec MAX, son partenaire obligatoire afin de se lier aux promoteurs de ses gènes cibles contenant des EBox (CANNTG) et ainsi activer leur transcription. Cependant, il a été proposé que MAX pourrait homodimériser et agir comme antagoniste en compétitionnant pour les mêmes sites de reconnaissance que l’hétérodimère c-MYC/MAX sur l’ADN. Notre étude vise donc à évaluer l’effet dose-dépendant d’un traitement exogène de MAX*WT, correspondant à une version tronquée du facteur de transcription MAX, sur différentes lignées cellulaires de GBM. Nous avons d’abord étudié les capacités de la protéine à transloquer dans les cellules par microscopie. Ceci a permis de déterminer que le peptide s’internalise rapidement (15 minutes) pour ensuite s’accumuler au niveau nucléaire (24 h, 48 h). Par la suite, des analyses de FACScan ont démonté qu’un traitement de 72 heures provoque une inhibition de la prolifération cellulaire. À l’aide de chambres de Boyden et d’essais de croissance en sphéroïdes dans une matrice de Matrigel(indice supérieur TM]), nous avons observé une diminution importante du caractère invasif des lignées de gliomes malins suite au traitement avec MAX*WT. Ces résultats démontrent que la protéine MAX*WT semble avoir un effet antinéoplasique sur plusieurs lignées de gliomes malins et que la voie de signalisation de c-MYC pourrait constituer une cible thérapeutique intéressante.

Les glioblastomes sont des tumeurs fatales du fait de leur agressivité et du manque de traitements efficaces. La prolifération accrue, le caractère invasif et la résistance à la mort cellulaire leur confèrent une croissance rapide et une invasion du parenchyme cérébral environnant, à l’origine de leur systématique récidive. Exprimée par la composante tumorale en hypoxie mais également par la composante vasculaire, l’AM participe de façon autocrine et paracrine au développement des glioblastomes en favorisant la croissance des cellules tumorales et l’angiogenèse tumorale.Il a été montré que des anticorps polyclonaux dirigés contre les récepteurs de l’AM inhibent in vitro la croissance, la migration et la formation de pseudo-capillaires des cellules endothéliales, suggérant une neutralisation par ces anticorps de certaines étapes de l’angiogenèse. De même, il a été montré in vivo que ces anticorps inhibent la croissance tumorale en supprimant l’angiogenèse et la croissance des cellules tumorales suggérant ainsi que les récepteurs de l’AM constitueraient une bonne cible thérapeutique. Des anticorps capables de reconnaître et neutraliser à la fois l’AM, les CLR, RAMP2 et RAMP3 agissant de la même manière sur la croissance tumorale et l’angiogenèse représenteraient un bénéfice thérapeutique majeur. Des anticorps dirigés contre un peptide chimérique constitué de l’enchainement de séquences peptidiques des protéines CLR, RAMP2, RAMP3 et du peptide AM sont en cours. Le traitement par ces anticorps diminue la croissance des cellules tumorales ainsi que leurs migration et invasion. Ces résultats très encourageants nous permettent pour le moment de valider la faisabilité du concept d’anticorps développés à partir d’un peptide chimérique pour neutraliser le système AM/AMR dans le but d’envisager dans le futur une application thérapeutique. / Glioblastoma are fatal tumors because of their aggressiveness and lack of effective treatments. The increased proliferation, the invasiveness and resistance to cell death gives them a rapid growth and invasion of brain parenchyma surrounding the origin of their systematic recurrence. Expressed by the tumoral component in hypoxia but also by the vascular component, the AM participate by an autocrine and paracrine way, the development of glioblastoma by promoting tumor ell growth and tumor angiogenesis.It was shown that polyclonal antibodies directed against the AM receptor inhibit in vitro growth, migration and the formation of pseudo-capillary of endothelial cells, suggesting neutralization by theses antibodies in certain stages of angiogenesis. Similarly, it has been shown in vivo that these antibodies inhibit tumor growth by suppressing angiogenesis and tumor cell growth, suggesting that the AM receptor would be a good therapeutic target. Antibodies that recognized and neutralized both the AM, the CLR, RAMP2 and RAMP3 acting the same way on tumor growth and angiogenesis represent a major therapeutic benefit. Antibodies against a chimeric peptide consisting of peptide sequence of CLR, RAMP2, RAMP3 and AM peptide are in progress. Treatment with these antibodies decreases the growth of tumor cells, their migration and invasion. These encouraging results allow us the time to validate the feasibility of the concept of antibodies developed from a chimeric peptide to neutralize the AM/AMR system in order to consider in the future therapeutic application.

Les travaux présentés dans ce manuscrit proposent plusieurs contributions dans le développement de modèles algorithmiques du cerveau et de ses pathologies. Le point commun entre tous ces travaux est un modèle dit de "seconde génération", spécifique à la géométrie du patient et capable de simuler le comportement mécanique du cerveau. La première partie de cette thèse présente l'utilisation de ce modèle pour l'estimation des déformations du cerveau au cours de deux opérations : l'électrostimulation pour le traitement de la maladie de Parkinson et la résection de tumeur. Dans le premier cas, le pouvoir prédictif du modèle est utilisé pour simuler les déplacements du cerveau à partir des données disponibles avant l'opération. Dans le second, le modèle est utilisé conjointement avec de l'imagerie par résonance magnétique per-opératoire pour estimer les déplacements observés dans les images. Dans la deuxième partie, nous abordons une classe de modèles faisant intervenir les pathologies cérébrales. Ainsi nous proposons un nouveau modèle 3D d'hydrocéphalie consécutive à une hémorragie méningée. Ce modèle permet d'introduire sous la forme d'un couplage entre modèles scalaires et volumiques une composante temporelle dynamique nécessaire en simulation de chirurgie. Ensuite, nous nous intéressons à la modélisation de la croissance du glioblastome. L'évolution de la densité de cellules tumorales dans le parenchyme est simulée par une équation de réaction-diffusion anisotrope prenant en compte la direction des fibres. Enfin, une nouvelle relation d'équilibre est introduite pour modéliser le couplage entre la densité de cellules tumorales et le modèle mécanique.