Legionella pneumophila ist ein Gram-negatives, ubiqitär verbreitetes Proteobakterium, das als Auslöser der Legionärskrankheit gilt. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Serin eine wichtige Kohlenstoffquelle für Aminosäuren darstellt und dass L. pneumophila für die Aminosäuren Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Prolin und Valin auxotroph ist. Innerhalb der Replikationsvakuole greift L. pneumophila auf Aminosäuren des Wirts zurück und inkorporiert diese in Proteine. Die untersuchte Spezies besitzt die Fähigkeit zur de novo-Biosynthese von Serin. Die vorliegende Arbeit zeigt zudem erstmals, dass Glukose für die Biosynthese von Aminosäuren sowie Polyhydroxybutyrat (PHB) verwendet wird. Der Entner-Doudoroff-Weg (EDW) kann als Haupt-Katabolismusroute von Glukose identifiziert werden. Ein Deletionsstamm des EDW zeigt gegenüber dem Wildtypstamm in nährstoffarmer Umgebung deutlich verminderte Fitness nach erfolgreicher Replikation innerhalb A. castellanii. Die Glukoamylase GamA wird in dieser Arbeit erstmals als verantwortliches Enzym für die Stärke- und Glykogenhydrolyse von L. pneumophila charakterisiert. Der putative Transkriptionsaktivator YozG bindet sowohl im 5’-DNA-Bereich von gamA als auch im eigenen putativen Promotorbereich und reguliert die Hydrolyseaktivität von GamA. Es werden zudem Argumente für die Hypothese erbracht, dass YozG auch als cis-aktives Element fungiert. Die Biosynthese von Polyhydroxybutyrat (PHB) aus Glukose findet während des spät-exponentiellen Wachstums statt und steigert sich in der stationären Phase. Eine verminderte PHB-Menge im EDW-Deletionsstamm wird als Erklärung für die verminderte Fitness in nährstoffarmer Umgebung diskutiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass L. pneumophila neben Aminosäuren auch Glukose sowie die natürlich vorkommenden Glukosepolymere Glykogen und Stärke als Kohlenstoffquellen zur Biosynthese von Aminosäuren und PHB nutzt und dass diese Synthese zur Fitness der Spezies beiträgt. / Legionella pneumophila is a Gram-negative proteobacterium causing Legionnaires’ disease. The results of this study confirm that serine is a carbon source for amino acids and that L. pneumophila is auxotrophic for the amino acids isoleucine, leucine, phenylalanine, tyrosine, histidine, proline, and valine. L. pneumophila uses amino acids of the host cells to incorporate them into proteins. Serine is synthesized de novo. Furthermore, this work demonstrates for the first time that glucose is used for the biosynthesis of amino acids and polyhydroxybutyrate (PHB). The Entner-Doudoroff pathway is identified as the predominant pathway for the catabolism of glucose. In a nutrient-depleted environment, after replication has taken place in A. castellanii, a deletion strain of the Entner-Doudoroff pathway exhibits strongly reduced fitness as compared to the wildtype. The glucoamylase GamA is characterized as the enzyme responsible for the starch and glycogen degrading activity of L. pneumophila for the first time. The putative transcription activator YozG binds to the 5’ region of gamA as well as to his own putative promoter region and regulates GamA activity. Furthermore, arguments are provided to support the hypothesis that YozG also acts as a cis-active element. The biosynthesis of polyhydroxybutyrate (PHB) from glucose starts in the late exponential phase and increases in the stationary growth phase. As an explanation for reduced fitness of the Entner-Doudoroff deletion strain in nutrient-depleted environment, a reduced amount of PHB is proposed. The results of this work prove that L. pneumophila uses not only amino acids but also glucose and the natural glucose polymers starch and glycogen as carbon sources for the biosynthesis of amino acids and PHB and that thereby the fitness of the species is increased.

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas. / The yeast Saccharomyces cerevisiae is the eukaryotic system with the most extensively studied genetics, it is generally recognized as safe, and it has broadly been used as a host system for the expression of heterologous genes of biotechnological interest. In Brazil, the vast majority of industrial processes, which include the production of fuel ethanol, utilize wild-type strains because of their higher resistance to adverse conditions, their adaptation to industrial processes in large scale, and because they exhibit higher growth rates than laboratory strains. In the present work, a genetic transformation system was developed for the chromosomal integration of heterologous genes of commercial interest in both haploid and polyploid industrial strains. This system utilizes an integrative shuttle vector, YIpC, which contains a CAN1 gene fragment (L-arginine permease and L-canavanine toxic analogous), bearing an internar restriction site (BstEII), where the gene expression cassette can be inserted. The resultant plasmid is then digested with HindlIII, releasing a linear DNA fragment containing the expression cassette flanked by CAN1 sequences. Following the introduction of the transforming fragment into yeast cells, the wild-type CAN1 gene is interrupted by the expression cassette, thus allowing positive selection of the recombinant clones by their resistance to the toxic properties of L-canavanive. To analyze the efficiency of this system, glucoamylase of Aspergillus awamori was used as reporter. An expression cassette containing the structural and signal sequences of A. awamori glucoamylase, under the control of the S. cerevisiae PGK1 transcriptional promoter and termination sequences, was subcloned in YIpC to obtain the plasmids YIpCGC and pUCGc. Both vectors, when digested with HindlIII, released a fragment (CGC) which was subsequently used for yeast transformation. Spore analysis and DNA PCR amplification indeed confirmed that the CGC fragment was inserted in both CAN1 chromosomal alleles of transformed diploid laboratory strains. Most importantly, 10 out of 20 industrial yeast strains submitted to transformation with the CGC fragment resulted in recombinant clones and, like observed for the diploid laboratory strains, the additional information was 100% stable. In concluding, this system also seems to be suitable for the construction of diploid heterozygote CGC+/CGC yeast strains, which in turn can be used for the detection of inductor substances of mitotic recombination that, as known, are potentially carcinogenic.

Sistemas do tipo cell surface display vêm sendo desenvolvidos para expressão de proteínas heterólogas ancoradas à superfície celular de microrganismos. Várias aplicações foram reportadas destes sistemas, incluindo o emprego como biocatalizador celular, desenvolvimento de vacinas e biosorventes celulares. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema que permite ancoragem da proteína glicoamilase de Aspergillus awamori à superfície da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador da glicoamilase com sua seqüência sinal foi fusionado ao fragmento do gene codificador da região C-terminal da proteína Flo1p (Flo428), que foi utilizada como âncora (fragmento CG*FC). As células de levedura foram transformadas com o fragmento híbrido CG*FC e os transformantes foram capazes de degradar amido e liberar glicose. A atividade da glicoamilase não foi detectada no meio de cultura, porém está presente no sedimento celular. Estes resultados demonstram que a glicoamilase foi ancorada à parede celular da nova linhagem recombinante de levedura. / Cell surface display systems have being developed for expression of heterologous proteins anchored to the cell surface of microorganisms. Several applications of these systems have been reported, including employment as whole-cell biocatalysts, development of vaccines and cellular biosorvents. In this work it was developed a system that allows the anchoring of the Aspergillus awamori glucoamylase protein to the cell wall surface of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The gene encoding glucoamylase with its secretion signal was fused to the gene fragment encoding the C-terminal region of Flo1 protein, used as an anchor (CG*FC fragment). Yeast cells were transformed with hybrid CG*FC fragment and transformants were able to degrade starch and release glucose. Glucoamylase activity was not detected in the culture medium, but only in sedimented cells. These results demonstrate that glucoamylase was anchored to the cell wall of the new yeast recombinant strain.

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 genoveva.pdf: 386984 bytes, checksum: e0637e197abae91403267eddf66d5e0f (MD5) Previous issue date: 2006-08-21 / Many types of agroindustrial wastes may be employed as substrate for enzyme production. Glucoamylase is an enzyme used by the food industry to elaborate, for example, glucose syrup. The glucoamylase production by fermentation processes may be done by Aspergillus awamori, because this microorganism is considered safe to be used in food industries. In the solid estate fermentation (SSF), the microorganism is inoculated in a substrate where the activity of water allows the growth and cellular metabolism; however that doesn´t exceed the maximum water holding capacity of the solid substrate. In this work it was studied the possibility of employing agroindustrial wastes (potato, carrot processing redidues and mixes of these residues), for glucoamylase production by the Aspergillus awamori NRRL 3112. The experiments were mde varying the following conditions: moisture levels of 90, 92 e 98%, fermentation time and agitation; moisture levels of 30, 50, 70 and 90%; supplementation with sources of nitrogen (level of 2,20g (NH4)SO4/Kg of substrate, with and without pH correction) and phosphorous (levels of 3,8, 7,6 and 11,4g Na2HPO4/Kg of substrate); determination of the enzymatic activity in different buffers: pH 4,2, 0,1M citrate-phosphate buffer pH 4,2, 0,02M acetate buffer. In the tested conditions, the time of 72 hours was the most apropriate for the fermentation and production of glucoamylase, being obtained up to 725,00 U/mL when potato processing wastes used. The agitation, as tested, was not efficient in the increment of the enzymatic activity. There were not great differences in the results of enzymatic activity with the studied moisture levels (90, 92 and 98%). In the experiments with moisture levels of 30, 50, 70 and 90%, the highest enzymatic activities verified were of 65,98 with 50% moisture for the carrot processing waste, 141,38 U/mL with moisture of 30% and use of the potato processing waste and 55,77 U/mL when teh substrate was prepared by mixing 50% of each wastes with moisture of 70%. In the experiments with substrate supplmented with sources of phosphorous, the best results of enzymatic activity obtanied they were 318,33% U/mL, with addition of 0,19 g of Na2HPO4/Kg for the substrate with potato processing waste, 33,33 U/mL when the carrot processing waste was ued with addition of 0,19 g of Na2HPO4/Kg for the substrate; and 125 U/mL was obtained when the substrate was a mix of 50% of each waste with addition of 0,19 g of Na2HPO4/Kg for the substrate. When phosfhorous and nitrogen sources was added, the best results obtained were of 875 U/mL with potato waste, without pH correction, being added 0,38 g of Na2HPO4/Kg for the substrate and without addition of nitrogen, 141,66 U/mL, with carrot waste, being added 0,38 g of Na2HPO4/Kg for the substrate, without addition of nitrogen and without pHcorrection. In the experiments with different buffer solutions, best results of enzymatic activity were of 51,66, 401,66 and 176, 66 U/mL, with carrot, potato wastes and their mix, respectively, being used the pH 4,2, 0,1 M citrate-phosphate buffer. It can be concluded that the use of those wastes as sources for production of glucoamylase is technically viable, contributing with the process of value aggregation to sub-products of the agroindustrial processing and avoiding the discard of these in the nature. / RESUMO Muitos resíduos gerados na agroindústria podem ser utilizados como substrato para produção de enzimas. A amiloglucosidase (AMG) é uma enzima utilizada pela indústria de alimentos para a fabricação de xaropes de glucose. A produção de AMG por processos fermentativos pode ser feita com o uso do Aspergillus awamori, pelo fato de ser considerado um microrganismo seguro para a indústria alimentícia. Na fermentação em estado sólido (FES), o microorganismo é inoculado em um substrato onde a atividade de água assegure o crescimento e metabolismo celular e não excede à capacidade máxima de ligação de água com a matriz sólida. Neste trabalho foi estudada a possibilidade da utilização de resíduos agroindustriais (gerados a partir do processamento da batata, cenoura e mistura desses resíduos) para a produção da enzima amiloglucosidase (AMG) pelo microorganismo Aspergillus awamori NRRL 3112. Foram realizados ensaios variando as seguintes condições: teor de umidade de 90, 92 e 98%, relacionados ao tempo de fermentação e à agitação; teor de umidade de 30, 50, 70 e 90%; suplementação com fontes de nitrogênio (nível de 2,20 g(NH4)2SO4/Kg de meio, com e sem correção de pH) e fósforo (níveis de 3,8, 7,6 e 11,4 g Na2HPO4/Kg de meio); determinação da atividade enzimática em diferentes soluções tampão, citrato-fosfato 0,1M e pH 4,2 e tampão acetato 0,02M e pH 4,2. Dentro das condições empregadas, o tempo de 72 horas foi o mais adequado para a fermentação e produção de AMG, obtendo-se até 725,00 U/mL quando se utilizou resíduo do processamento de batata. A agitação, dentro dos níveis empregados, não se mostrou eficiente no incremento da atividade enzimática. Não houve grandes diferenças nos resultados de atividade enzimática em relação aos teores de umidade de 90, 92 e 98% utilizados. Nos ensaios com meios com teor de umidade de 30, 50, 70 e 90% as maiores atividades enzimáticas constatadas foram de 65,98 U/mL com emprego de umidade de 50% para o resíduo do processamento de cenoura, 141,38 U/mL com umidade de 30% na utilização do resíduo do processamento de batata e 55,77 U/mL onde se fez mistura de 50% de cada resíduos com umidade de 70%. Nos ensaios com meios suplementados apenas com fontes de fósforo, os melhores resultados de atividade enzimática obtidos foram 318,33 U/mL, com adição de 0,19 g de Na2HPO4/50g de meio para o resíduo do processamento de batata, 33,33U/mL quando se utilizou resíduo do processamento de cenoura com adição de 0,19 g de Na2HPO4/50g de meio, 125 U/mL foi obtido quando se fez a mistura de 50% de cada resíduo com adição de 0,19 g de Na2HPO4/50g de meio. Quando se adicionou fontes de fósforo e nitrogênio, os melhores resultados obtidos foram de 875 U/mL com resíduo de batata, sem correção de pH, adicionando-se 0,38 g de Na2HPO4/50g de meio, sem adição de fonte de nitrogênio, 141,66 U/mL com resíduo de cenoura adicionando-se 0,38g de Na2HPO4/50g de meio, sem adição de fonte de nitrogênio e sem correção de pH. Nos ensaios com diferentes soluções tampão obteve-se os melhores resultados de atividade enzimática, de 51,66, 401,66 e 176,66U/mL, com resíduos do processamento de cenoura, batata e mistura desses, respectivamente, utilizando-se o tampão citrato-fosfato 0,1M, pH 4,2. Pode-se concluir que a utilização desses resíduos como fonte para produção de AMG é tecnicamente viável, contribuindo com o processo de agregação de valor econômico a sub-produtos da agroindústria e evitando o descarte destes na natureza.

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-29 / Glucoamylase is one of main enzymes responsible for the hydrolysis of starch to form the glucose syrup, raw material used by the food industry for the production of cool drinks, ice creams, sauces, breads and as carbon source in fermentations. The enzyme is normally produced by filamentous fungi. In the present work glucoamylase was produced by Aspergillus niger through solid-state fermentation, using the industrial waste of potato processing, during a period of 48 h at 32 ºC. The biochemical characterization of the rude enzymatic preparation showed as the optimum performance pH band near 5,0 and as the optimum temperature 60 ºC, with an average activity of 11,87 U/mL. After 26 hours of incubation of this preparation, the glucoamylase kept 58,75 % (9,70 U/mL) and 60,33 % (9,96 U/mL) of its activity at 35 and 60 ºC respectively; after 28 hours of incubation in pH 4,6, it kept 72,87 % (8,88 U/mL) of residual activity. The kinetic parameters for the hydrolysis of soluble starch were Km = 1,68 mg/mL and Vmáx = 41,15 U/mL. The enzyme was partially purified through i) precipitation with ammonium sulphate between 60-85 % of saturation ii) anion-exchange chromatography in Q-Sepharose and iii) gel filtration chromatography in Sephadex G-100, with a purification factor of 109,23 fold and a yield of 11,71 %. The eletrophoretic analyses demonstrated that the studied glucoamylase presents molar mass around 130,88 kDa. After submitted to the purification steps, the enzyme kept the same optimum conditions of pH and temperature of the raw preparation, with 152,85 U/mL of average activity. With regard to stability, after 4 hours of incubation in pH 5,0, the glucoamylase presented 83 % (124,99 U/mL) of residual enzymatic activity, whereas after 8 hours only 22,72 % (34,22 U/mL) remained. Concerning temperatures, greater stability was observed at 35 and 15 ºC, in which after 24 hours of incubation 87 % (131,14 U/mL) and 85 % (127,77 U/mL) of the catalytic capacity remained, respectively. The values of Km and Vmáx for the partially purified glucoamylase were 0,049 mg/mL and 163,93 U/mL. / A glucoamilase, enzima normalmente produzida por fungos filamentosos, é uma das principais responsáveis pela hidrólise do amido para a formação de xarope de glucose,matéria-prima utilizada pela indústria de alimentos na produção de refrigerantes, sorvetes, molhos, pães e como fonte de carbono em fermentações. No presente trabalho, a lucoamilase foi produzida por Aspergillus niger através de fermentação em estado sólido, utilizando como substrato resíduo de uma indústria de processamento de batata, por um período de 48 horas a 32 ºC. A caracterização bioquímica da preparação enzimática bruta mostrou como faixa de pH ótimo para atuação, valores próximos a 5,0 e temperatura ótima 60 ºC, com atividade média de 11,87 U/mL. Ensaios de estabilidade térmica indicaram que após 26 horas de incubação a glucoamilase manteve 58,75 % (9,70 U/mL) e 60,33 % (9,96 U/mL) de sua atividade a 35 ºC e 60 ºC respectivamente. Ensaios de pH mostraram como o de maior estabilidade 4,6, no qual após 28 horas obteve-se 72,87 % (8,88 U/mL) de atividade residual. Os parâmetros cinéticos para a hidrólise do amido solúvel foram Km = 1,68 mg/mL e Vmáx = 41,15 U/mL. A enzima foi parcialmente purificada através de i) precipitação com sulfato de amônio entre 60-85 % de saturação, ii) cromatografia de troca aniônica em Q-Sepharose e iii) cromatografia de filtração em gel em Sephadex G-100 com um fator de purificação de 109,23 vezes e rendimento de 11,71 %. As análises eletroforéticas estimaram a massa molecular da glucoamilase estudada em torno de 130,88 kDa. Após ser submetida às etapas de purificação, a enzima manteve as condições ótimas de pH entre 4,5 e 5,0 e de temperatura 60 ºC, com atividade média de 152,85 U/mL. Com relação à estabilidade, após 4 horas de incubação em pH 5,0, a glucoamilase apresentou 83 % (124,99 U/mL) de atividade enzimática residual e após 8 horas no mesmo pH apenas 22,72 % (34,22 U/mL). Foram testadas e encontradas como temperaturas de estabilidade 15 e 35 ºC, remanescendo após 24 horas de incubação 85 % (127,77 U/mL) e 87 % (131,14 U/mL) da capacidade catalítica, respectivamente. Os valores de Km e Vmáx para a glucoamilase parcialmente purificada foram 0,049 mg/mL e 163,93 U/mL.

Sistemas do tipo cell surface display vêm sendo desenvolvidos para expressão de proteínas heterólogas ancoradas à superfície celular de microrganismos. Várias aplicações foram reportadas destes sistemas, incluindo o emprego como biocatalizador celular, desenvolvimento de vacinas e biosorventes celulares. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema que permite ancoragem da proteína glicoamilase de Aspergillus awamori à superfície da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador da glicoamilase com sua seqüência sinal foi fusionado ao fragmento do gene codificador da região C-terminal da proteína Flo1p (Flo428), que foi utilizada como âncora (fragmento CG*FC). As células de levedura foram transformadas com o fragmento híbrido CG*FC e os transformantes foram capazes de degradar amido e liberar glicose. A atividade da glicoamilase não foi detectada no meio de cultura, porém está presente no sedimento celular. Estes resultados demonstram que a glicoamilase foi ancorada à parede celular da nova linhagem recombinante de levedura. / Cell surface display systems have being developed for expression of heterologous proteins anchored to the cell surface of microorganisms. Several applications of these systems have been reported, including employment as whole-cell biocatalysts, development of vaccines and cellular biosorvents. In this work it was developed a system that allows the anchoring of the Aspergillus awamori glucoamylase protein to the cell wall surface of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The gene encoding glucoamylase with its secretion signal was fused to the gene fragment encoding the C-terminal region of Flo1 protein, used as an anchor (CG*FC fragment). Yeast cells were transformed with hybrid CG*FC fragment and transformants were able to degrade starch and release glucose. Glucoamylase activity was not detected in the culture medium, but only in sedimented cells. These results demonstrate that glucoamylase was anchored to the cell wall of the new yeast recombinant strain.