Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.

Na agricultura moderna, formas alternativas de alcançar maior produtividade de modo sustentável são prioridades. Entretanto, o sucesso agrícola é ainda excessivamente dependente do emprego de fertilizantes químicos e de defensivos agrícolas. A severidade de algumas doenças é um fator preocupante na produção de várias culturas. Dentre alguns patógenos de planta, destaca-se o gênero Fusarium, o qual apresenta uma expressiva importância na agricultura por ser patógeno em várias culturas de interesse econômico.. Por outro lado, a utilização de microrganismos endofíticos como agentes de biocontrole vem se tornando cada vez mais atrativa, pois, surge como uma alternativa capaz de amenizar gastos excessivos com controle químico e danos ao meio ambiente. Dentre esses microrganismos, destaca-se o gênero Burkholderia, conhecidamente capaz de produzir uma vasta gama de antimicrobianos, com diferentes níveis de especificidade. Essas bactérias vivem em interações com diversos microrganismos e plantas, em um ambiente altamente competitivo, resultando em uma fonte de metabólitos secundários, bacteriocinas dentre outros pepitideos A linhagem TC3.4.2R3 Burkholderia seminalis, isolada endofiticamente de raízes de cana-de-açúcar, é capaz de controlar vários fungos e bactérias fitopatogênicas. Apartir dessa linhagem foi construída uma biblioteca de mutantes randômicos por meio de transposon. Assim, por meio dessa biblioteca, o objetivo do trabalho foi selecionar mutantes defectivos no controle de diferentes espécies de Fusarium, identificar e caracterizar os genes nocauteados, visando o melhor entendimento do controle da fusariose. Os resultados obtidos por meio da caracterização do teste de antagonismo demonstrou que a linhagem TC3.4.2R3 selvagem produz metabólitos capazes de inibir in vitro o crescimento de Fusarium spp. A partir da biblioteca de mutantes, foram obtidos 8 mutantes defectivos para o controle de Fusarium verticilioides FV-01-CTC que não apresentaram alta especificidade quando avaliados contra outros Fusarium spp. Dentre os genes nocauteados foram identificadas sequências codificadoras para a proteína glutamato sintase, TolB e FAD. Até o momento não foi encontrado relatos sobre o glutamato como um biocontrolador de patógenos, entretanto o uso de mutantes sítio dirigido para esse gene confirmou o papel do mesmo no controle de FV-01-CTC. TolB é uma proteína relacionada ao transporte de substâncais e pode ter seu papel de controle relacioanado à secreção de metabolítos secundários, visto que in silico, no genoma da TC3.4.2R3, foram encontrados 18 clusters resposáveis pela produção de metabólitos secundários. Assim, o presente trabalho abre novas perspectivas de estudo, visto que, os mecanismos de controle da fusariose por B. seminalis TC3.4.2R3 são amplos e sinergisticos. Há uma enorme perspectiva em desvendar o papel do glutamato e TolB no controle de fitopatógenos. Os mutantes caracterizados, pode ser fonte de novos estudos para o complexo entendimento da interação microrganismo-planta-patógeno, visto que há a possibilidade de verificar por exemplo o papel do glutamato proveniente da linhagem TC3.4.2R3 na promoção de crescimento vegetal. / In modern agriculture, alternative ways of achieving high productivity with sustainability are priority. However, agricultural success is still excessively dependent on the use of chemical fertilizers and pesticides. The severity of some diseases are worrying factor in the production of differents crops. Among plant pathogens, the genus Fusarium stands out, which has an important role in agriculture being disease causer in several crops such as: sugarcane, corn, passion fruit, tomato, banana, rice, and others. Fusarium can be found inhabiting soil in the most diverse geographical regions of the world, especially in tropical and subtropical climates. On the other hand, studies using endophytic microorganisms as biocontrol agents has become increasingly attractive, since they appear as an alternative to chemical control. Among these microorganisms, the genus Burkholderia stands out. This genis is able to produce a wide range of antimicrobials, with different levels of specificity. Moreover, Burkholderia has been received special attention because its potential plant growth promoter, bioremediation agents and recent studies aimed at biocontrol of diseases. These bacteria live in interactions with diverse microorganisms and plants in a highly competitive environment representing significant source of new bioactive secondary metabolites, bacteriocins among other pepitides. The B. seminalis strain TC3.4.2R3, endofitically isolated from sugarcane roots, is able to control diverse phytopathogenic fungi and bacteria. By Tn5 randomic mutations, it was obtained a library of TC3.4.2R3 mutantes. Thus, using this library, the objective of this work was select defective mutants to control of Fusarium spp., with the aimed the better understand the fusariose control by identificayion and characteriazation of knockouted genes. The results obtained through the characterization of the antagonism assays allowed us to conclude that wild-type TC3.4.2R3 produces many metabolites with antifungal activity under in vitro conditions, being able to control the growth Fusarium spp. From the mutants library we found 8 defectives mutants to control of F. verticilioides FV-01-CTC. Among the knockouted genes we found sequences enconding glutamato syntase, TolB and FAD. To date no reports have been found on glutamate as a pathogen biocontroller, however the use of mutant site directed to this gene confirmed the role of the same in the control of FV-01-CTC. TolB is a protein related to the transport of substances and may have its biocontrol role related to the secretion of secondary metabolites, since in silico analisys in the genome of TC3.4.2R3, 18 clusters were found as responsible for the production of secondary metabolites. Thus, the present work opens new perspectives of study, confirming that the mechanisms of control of fusariosis by B. seminalis TC3.4.2R3 are ample and synergistic. There is a huge prospect in unraveling the role of glutamate and TolB in controlling of plant pathogens. The characterized mutants may be the source of new studies for understanding the complex interaction among microorganism-plant-pathogen, since it is possible to verify, for example, the role of glutamate from the TC3.4.2R3 strain in the plant growth-promotion.