INTRODUÇÃO: Injeções intravítreas de acetato de triancinolona são utilizadas no tratamento de uma série de doenças retinianas. Estudos in vitro demonstram toxicidade, mas não está ainda claro se está relacionada ao preservativo ácido benzílico. Recentemente, uma formulação sem preservativo (Triesence®) foi aprovada nos Estados Unidos da América para uso intraocular. Entretanto, não existem estudos avaliando os efeitos in vitro e in vivo desta formulação. OBJETIVOS: Avaliar os efeitos do Triesence® em culturas de células retinianas e em um modelo experimental animal. MÉTODOS: As culturas de células ARPE-­-19 e R28 foram tratadas por 24 horas com Triesence® em cristais (TRIc) nas doses de 1000, 500, 200 ou 100 g/mL, ou solubilizado (TRIs) nas doses de 1000, 500 ou 200 ?g/mL. O Triesence® foi solubilizado após a centrifugação da droga, descarte do sobrenadante contendo o veículo, e em seguida ressuspensão da droga em quantidade equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO). A porcentagem de viabilidade celular (VC) foi avaliada em ensaio de exclusão com azul de tripan. O potencial de membrana mitocondrial, foi analisado com o ensaio JC1. A atividade da caspase-­-3/7 foi mensurada por ensaio com fluoróforos. Trinta coelhos borboletas (Oryctolagus Cuniculum) foram divididos em três grupos e receberam 3 quantidades diferentes de Triesence® intravítreo: 1, 4, ou 8 mg. Após a anestesia, o olho direito (OD) recebeu a droga, enquanto o olho esquerdo (OE) recebeu o mesmo volume de solução salina balanceada. Ao final de 30 dias, o eletrorretinograma (ERG) foi registrado. Após realização do ERG, os animais foram sacrificados e os olhos coletados para análise morfológica. Doze outros coelhos foram submetidos somente a análise morfológica após 7 dias da aplicação. OS ERGs foram registrados com o sistema RETIport (Roland Consult, Alemanha), com um estimulador Ganzfeld Q450 SC. O teste de postos com sinais de Wilcoxon foi utilizado para comparar as amostras relacionadas. Para estímulos escotópicos, o valor logarítmico das amplitudes médias da onda b foi relacionado ao valor logarítmico da intensidade luminosa de cada estímulo, e a amplitude máxima da onda b (Vmax), a intensidade luminosa necessária para se atingir 50% do valor do Vmax (k), e a inclinação da curva (n) foram analisados utilizando-­-se os testes estatísticos ANOVA e t de Student pareado bicaudal. Resumo RESULTADOS: TRIc causa diminuição significativa na viabilidade celular em todas as concentrações e linhagens testadas, o que é minimizado pela solubilização da droga. Mesmo o TRIs demonstrou aumento da regulação da caspase 3/7, indicativo de apoptose in vitro, mas não houve aumento da atividade no ensaio JC1. O ERG escotópico evidenciou uma queda estatisticamente significativa de aproximadamente 7% no Vmax no grupo recebendo 8 mg a droga, mas não houve alteração significativa nos parâmetros k ou n em nenhuma concentração testada. O ERG fotópico evidenciou amplitudes de onda b significativamente reduzidas nos grupos que receberam 4 ou 8 mg, mas não no que recebeu 1 mg. Observou-­-se redução na amplitude do flicker para 24 ou 30 Hertz (Hz) no grupo que recebeu 8 mg, e para 30 Hz no grupo que recebeu 4 mg. Não foram notadas diferenças nos ensaios Hematoxilina-­-Eosina (H&E), Tunnel, Fluoro-­-Jade B ou GFAP (proteína glial fibrilar ácida) entre retinas tratadas e controle após 30 dias. Entretanto, após 7 dias, observou-­-se marcação positiva para proteína glial fibrilar ácida nas células de Müller. CONCLUSÃO: TRIc causa uma diminuição significativa na viabilidade celular em culturas de células retinianas. Após solubilizada, a droga não causa este efeito ou tampouco altera-o. Mesmo o TRIs causa aumento dos níveis de caspase 3/7, sugerindo apoptose. No modelo experimental em coelhos, foram observadas alterações morfológicas e eletrorretinográficas após a injeção intravítrea de Triesence®. Células de Müller apresentaram expressão de GFAP após 7 dias, mas não após 30 dias, sugerindo ativação transitória deste tipo celular. Não foram encontrados sinais de necrose ou apoptose, mesmo nas doses mais elevadas. Os resultados do ERG sugerem toxicidade retiniana após aplicação intravítrea de 4 ou 8 mg de Triesence® (4 a 8 vezes a dose clínica terapêutica) / INTRODUCTION: Intravitreous triancinolone acetonide is used to treat various retinal disorders. In vitro studies show toxicity, but it is not clear if that is related to the preservative benzyl alcohol. Recently, a formulation without preservative (Triesence®) was approved for intraocular use. However, no in vitro or in vivo studies with this formulation have been reported in literature so far. OBJECTIVES: To evaluate the effects of the exposure of Triesence® on retinal cells in culture and on an in-­-vivo rabbit model. METHODS: ARPE-­-19 and R28 cell cultures were treated for 24 hours with 1000, 500, 200 or 100 ?g/mL of crystalline (TRIc) or 1000, 500 or 200 g/mL of solubilized (TRIs) Triesence®. The drug was solubilized by centrifuging it, discarding the supernatant containing the vehicle and then resuspending the pellet in an equivalent amount of Dimethyl sulfoxide (DMSO). Percentage of cell viability (VC) was evaluated by a trypan blue dye-­-exclusion assay. The mitochondrial membrane potential was analyzed with the JC-­-1 assay. The caspase-­-3/7 activity was measured by a fluorochrome assay. Thirty pigmented rabbits (Oryctolagus Cuniculum) were assigned to 3 different intravitreal drug concentrations of Triesence®: 1, 4 or 8 mg. The animals were anesthetized and the right eye (OD) received drug, while the left eye (OS) received balanced salt solution. After 30 days, electroretinogram (ERG) was recorded. ERGs were recorded with the RETIport system (Roland Consult, Germany) with a Ganzfeld Q450 SC stimulator. Wilcoxon signed rank test was used to compare related samples. After the ERG, the animals were euthanized and the eyes were collected for morphological analysis. Twelve other rabbits had histology only analysis after 7 days of injection. Dark-­-adapted b-­-wave mean amplitudes were plotted as log response versus log light intensity curves, and the maximum The mitochondrial membrane potential was analyzed with the JC-­-1 assay. The caspase-­-3/7 activity was measured by a fluorochrome assay. Thirty pigmented rabbits (Oryctolagus Cuniculum) were assigned to 3 different intravitreal drug concentrations of Triesence®: 1, 4 or 8 mg. The animals were anesthetized and the right eye (OD) received drug, while the left eye (OS) received balanced salt solution. After 30 days, electroretinogram (ERG) was recorded. ERGs were recorded with the RETIport system (Roland Consult, Germany) with a Ganzfeld Q450 SC stimulator. Wilcoxon signed rank test was used to compare related samples. After the ERG, the animals were euthanized and the eyes were collected for morphological analysis. Twelve other rabbits had histology only analysis after 7 days of injection. Dark-­-adapted b-­-wave mean amplitudes were plotted as log response versus log light intensity curves, and the maximum

INTRODUÇÃO: Injeções intravítreas de acetato de triancinolona são utilizadas no tratamento de uma série de doenças retinianas. Estudos in vitro demonstram toxicidade, mas não está ainda claro se está relacionada ao preservativo ácido benzílico. Recentemente, uma formulação sem preservativo (Triesence®) foi aprovada nos Estados Unidos da América para uso intraocular. Entretanto, não existem estudos avaliando os efeitos in vitro e in vivo desta formulação. OBJETIVOS: Avaliar os efeitos do Triesence® em culturas de células retinianas e em um modelo experimental animal. MÉTODOS: As culturas de células ARPE-­-19 e R28 foram tratadas por 24 horas com Triesence® em cristais (TRIc) nas doses de 1000, 500, 200 ou 100 g/mL, ou solubilizado (TRIs) nas doses de 1000, 500 ou 200 ?g/mL. O Triesence® foi solubilizado após a centrifugação da droga, descarte do sobrenadante contendo o veículo, e em seguida ressuspensão da droga em quantidade equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO). A porcentagem de viabilidade celular (VC) foi avaliada em ensaio de exclusão com azul de tripan. O potencial de membrana mitocondrial, foi analisado com o ensaio JC1. A atividade da caspase-­-3/7 foi mensurada por ensaio com fluoróforos. Trinta coelhos borboletas (Oryctolagus Cuniculum) foram divididos em três grupos e receberam 3 quantidades diferentes de Triesence® intravítreo: 1, 4, ou 8 mg. Após a anestesia, o olho direito (OD) recebeu a droga, enquanto o olho esquerdo (OE) recebeu o mesmo volume de solução salina balanceada. Ao final de 30 dias, o eletrorretinograma (ERG) foi registrado. Após realização do ERG, os animais foram sacrificados e os olhos coletados para análise morfológica. Doze outros coelhos foram submetidos somente a análise morfológica após 7 dias da aplicação. OS ERGs foram registrados com o sistema RETIport (Roland Consult, Alemanha), com um estimulador Ganzfeld Q450 SC. O teste de postos com sinais de Wilcoxon foi utilizado para comparar as amostras relacionadas. Para estímulos escotópicos, o valor logarítmico das amplitudes médias da onda b foi relacionado ao valor logarítmico da intensidade luminosa de cada estímulo, e a amplitude máxima da onda b (Vmax), a intensidade luminosa necessária para se atingir 50% do valor do Vmax (k), e a inclinação da curva (n) foram analisados utilizando-­-se os testes estatísticos ANOVA e t de Student pareado bicaudal. Resumo RESULTADOS: TRIc causa diminuição significativa na viabilidade celular em todas as concentrações e linhagens testadas, o que é minimizado pela solubilização da droga. Mesmo o TRIs demonstrou aumento da regulação da caspase 3/7, indicativo de apoptose in vitro, mas não houve aumento da atividade no ensaio JC1. O ERG escotópico evidenciou uma queda estatisticamente significativa de aproximadamente 7% no Vmax no grupo recebendo 8 mg a droga, mas não houve alteração significativa nos parâmetros k ou n em nenhuma concentração testada. O ERG fotópico evidenciou amplitudes de onda b significativamente reduzidas nos grupos que receberam 4 ou 8 mg, mas não no que recebeu 1 mg. Observou-­-se redução na amplitude do flicker para 24 ou 30 Hertz (Hz) no grupo que recebeu 8 mg, e para 30 Hz no grupo que recebeu 4 mg. Não foram notadas diferenças nos ensaios Hematoxilina-­-Eosina (H&E), Tunnel, Fluoro-­-Jade B ou GFAP (proteína glial fibrilar ácida) entre retinas tratadas e controle após 30 dias. Entretanto, após 7 dias, observou-­-se marcação positiva para proteína glial fibrilar ácida nas células de Müller. CONCLUSÃO: TRIc causa uma diminuição significativa na viabilidade celular em culturas de células retinianas. Após solubilizada, a droga não causa este efeito ou tampouco altera-o. Mesmo o TRIs causa aumento dos níveis de caspase 3/7, sugerindo apoptose. No modelo experimental em coelhos, foram observadas alterações morfológicas e eletrorretinográficas após a injeção intravítrea de Triesence®. Células de Müller apresentaram expressão de GFAP após 7 dias, mas não após 30 dias, sugerindo ativação transitória deste tipo celular. Não foram encontrados sinais de necrose ou apoptose, mesmo nas doses mais elevadas. Os resultados do ERG sugerem toxicidade retiniana após aplicação intravítrea de 4 ou 8 mg de Triesence® (4 a 8 vezes a dose clínica terapêutica) / INTRODUCTION: Intravitreous triancinolone acetonide is used to treat various retinal disorders. In vitro studies show toxicity, but it is not clear if that is related to the preservative benzyl alcohol. Recently, a formulation without preservative (Triesence®) was approved for intraocular use. However, no in vitro or in vivo studies with this formulation have been reported in literature so far. OBJECTIVES: To evaluate the effects of the exposure of Triesence® on retinal cells in culture and on an in-­-vivo rabbit model. METHODS: ARPE-­-19 and R28 cell cultures were treated for 24 hours with 1000, 500, 200 or 100 ?g/mL of crystalline (TRIc) or 1000, 500 or 200 g/mL of solubilized (TRIs) Triesence®. The drug was solubilized by centrifuging it, discarding the supernatant containing the vehicle and then resuspending the pellet in an equivalent amount of Dimethyl sulfoxide (DMSO). Percentage of cell viability (VC) was evaluated by a trypan blue dye-­-exclusion assay. The mitochondrial membrane potential was analyzed with the JC-­-1 assay. The caspase-­-3/7 activity was measured by a fluorochrome assay. Thirty pigmented rabbits (Oryctolagus Cuniculum) were assigned to 3 different intravitreal drug concentrations of Triesence®: 1, 4 or 8 mg. The animals were anesthetized and the right eye (OD) received drug, while the left eye (OS) received balanced salt solution. After 30 days, electroretinogram (ERG) was recorded. ERGs were recorded with the RETIport system (Roland Consult, Germany) with a Ganzfeld Q450 SC stimulator. Wilcoxon signed rank test was used to compare related samples. After the ERG, the animals were euthanized and the eyes were collected for morphological analysis. Twelve other rabbits had histology only analysis after 7 days of injection. Dark-­-adapted b-­-wave mean amplitudes were plotted as log response versus log light intensity curves, and the maximum The mitochondrial membrane potential was analyzed with the JC-­-1 assay. The caspase-­-3/7 activity was measured by a fluorochrome assay. Thirty pigmented rabbits (Oryctolagus Cuniculum) were assigned to 3 different intravitreal drug concentrations of Triesence®: 1, 4 or 8 mg. The animals were anesthetized and the right eye (OD) received drug, while the left eye (OS) received balanced salt solution. After 30 days, electroretinogram (ERG) was recorded. ERGs were recorded with the RETIport system (Roland Consult, Germany) with a Ganzfeld Q450 SC stimulator. Wilcoxon signed rank test was used to compare related samples. After the ERG, the animals were euthanized and the eyes were collected for morphological analysis. Twelve other rabbits had histology only analysis after 7 days of injection. Dark-­-adapted b-­-wave mean amplitudes were plotted as log response versus log light intensity curves, and the maximum

A organização do sistema nervoso que controla as funções digestórias dos moluscos gastrópodes tem sido estudada quanto à constituição dos circuitos neurais subjacentes ao ritmo de deglutição alimentar. Existe, entretanto, uma lacuna no conhecimento da organização do sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP) que regulam o segmento médio e posterior do trato digestório. A posição filogenética intermediária, atribuída ao sistema nervoso (SN) do caracol Megalobulimus abbreviatus, entre as espécies de Helicidae e os basomatófaros pode constituir uma via para o entendimento do controle da atividade do trato gastrointestinal (tGI) de gastrópodes. Assim sendo, o caracol pulmonado M. abbreviatus foi utilizado em um estudo morfológico e neuroquímico que buscou descrever o padrão da inervação central e periférica em um modelo experimental amplamente utilizado na pesquisa neurobiológica. A anatomia macroscópica revelou que o intestino médio constituiu-se pelo estômago, dividido em pró-ventrículo e moela, e intestino, dividido em pró-intestino ou tiflossolear, médio e pós-intestino, enquanto que o intestino posterior constituiu-se pelo reto e ânus. A análise da organização da parede, empregando microscopia óptica, revelou a presença de quatro túnicas constituindo a parede destes órgãos: (i) mucosa, que se constituía por um epitélio colunar intermitente ciliado e lâmina própria; (ii) submucosa, representada pelo tecido conjuntivo frouxo, contendo muitos espaços hemais; (iii) muscular, dividida em camadas circular interna e longitudinal externa, contudo a moela apresentou uma camada disposta obliquamente e as regiões cárdica e pilórica apresentaram esfíncteres muito organizados (iv) serosa, constituída por tecido conjuntivo frouxo delimitado por um mesotélio. O intestino médio recebe inervação central por meio do ramo gastro-intestinal (rG) do nervo visceral comum (nV), enquanto que o intestino posterior foi inervado pelo nervo reto-anal (nR). A aplicação de marcações retrógradas com cloreto de cobalto acrescido de albumina sérica bovina, biocitina e Horseradish peroxidase no rG e no nR revelou que a maioria dos neurônios envolvidos no controle destes órgãos estão localizados no complexo ganglionar víscero-parietal. Ainda foi observada a presença de uma rede constituída por quatro gânglios (estomatogástrico, cárdico, gástrico e pilórico) interconectados por nervos e localizados sobre a parede do estômago, sendo denominado sistema nervoso estomatogástrico (SNEG). O traçamento anterógrado com Lúcifer Yellow revelou que fibras oriundas do SNEG se projetam para os plexos entéricos, submucoso (PS) e mioentérico (PM), localizados entre as túnicas do tGI. A organização do sistema nervoso entérico (SNE) foi estudada com a aplicação das técnicas de impregnação argentafínica e coloração com azul de metileno. Os plexos entéricos mostraram-se formados por uma extensa rede de axônios e muitos somas neuronais, dispostos em pequenos grupos ou isoladamente. As fibras axonais que inervavam as células da camada muscular longitudinal no estômago eram organizadas em feixes e acompanhavam o comprimento das fibras musculares. O MP distribuía-se por toda a camada muscular circular e longitudinal. No estômago, a região cárdica apresentou um plexo mais denso do que a pilórica, contudo as fibras nervosas dispunham-se entre e ao redor das fibras musculares de ambas as camadas O plexo entérico no intestino apresentou o mesmo arranjo observado na região pilórica, sendo uniforme até o ânus. As duas tiflossoles intestinais, no pró-intestino, apresentaram grande quantidade de fibras nervosas, no entanto não foram observados somas neuronais. Dentre os constituintes do SNE foram observados células nervosas intra-epiteliais (neuron like-intraepithelial cells), que possuem dois tipos morfológicos: aberto (que projeta um cílio para o lúmen intestinal) e fechado (localizado na base do epitélio digestório) e células fusiformes, cuja morfologia e posição lembram as células intersticiais de Cajal. A neuroanatomia química do SNEG e do SNE foi analisada mediante a aplicação de técnicas de histoquímica e imunohistoquímica para diferentes mediadores e transmissores. No intestino médio e posterior foi observado um rico plexo com atividade acetilcolinesterásica (AChE), constituído por fibras oriundas do SNC, via nervos periféricos, e do SNEG. Neurônios e fibras nervosas entéricas mostraram-se esparsos na submucosa e entre as camadas musculares, circular e longitudinal, do estômago, intestino e reto. A atividade de diaforase da nicotinamida adenina dinucleotódeo fosfato (NADPHd) revelou neurônios e fibras nervosas com maior atividade em toda a túnica muscular do que na submucosa. A fluorescência induzida pelo ácido glioxílico (AG) revelou a maior presença de fibras nervosas e varicosidades catecolaminérgicas na submucosa do reto, pós-intestino e moela do que nas outras porções do tGI. A imunorreatividade à serotonina (5HT-ir) foi observada em somas e fibras nervosas distribuídas predominantemente na submucosa do reto e intestino, sendo encontrados poucos neurônios e fibras 5HT-ir no pró-ventrículo e moela Os elementos nervosos FMRF-amida imunorreativos (FMRFa-ir) estavam presentes na mucosa, submucosa e muscular por toda extensão do intestino médio e posterior. As células nervosas intraepiteliais foram mais marcadas pela AChE, 5HT-ir e FMRFa-ir do que pela NADPHd e seus processos se anastomosam formando um extenso e organizado plexo subepitelial. As células fusiformes tiveram os corpos e prolongamentos marcados pelos métodos aplicados, à exceção do AG. Uma intensa imunorreatividade a proteína fibrilar acídica glial (GFAP-ir) por todos os plexos do intestino médio e posterior e nos gânglios do SNEG, sugerindo uma importante função para as células gliais no SNP do tGI de gastrópodes. Assim, pode-se concluir que o controle do tGI no caracol M. abbreviatus possui um controle nervoso extrínseco direto, por meio dos gânglios subesofageais, via rG e nR, e indireto, pelo SNEG para o intestino médio, e uma inervação intrínseca, representada pelos plexos PS e PM, associados às células nervosas intra-epiteliais, que formam o plexo subepitelial tanto no intestino médio como no posterior. A neuroanatomia química permite inferir que, os diferentes transmissores analisados, podem exercer controle sobre a motilidade ou sobre as funções sensoriais e secretomotoras no tGI. Finalizando, a reação ao GFAP é uma evidência da presença de células enterogliais permitindo inferir que exista uma interação entre os constituintes dos plexos neurais com a glia, tal qual ocorre no SNC de gastrópodes e outros invertebrados. / The organization of the nervous system that controls digestive functions of gastropods mollusks has been studied relative to the constitution of the neuronal circuit underlying the deglutition rhythm. However, there is a lacuna in the knowledge about the organization of the peripheral nervous system regulating the medium and posterior segments of the digestive tract. However, there is a lacuna in the knowledge about the organization of the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS) that regulates the medium and posterior segments of the digestive tract. The intermediate phylogenetic position attributed to the nervous system (NS) of the snail Megalobulimus abbreviatus, between Helicidae and basommatophoran species may constitute a via for understanding the control of the activity of the gastrointestinal (GI) tract of gastropods. Thus, the pulmonate snail M. abbreviatus was used in a morphological and neurochemical study that sought to describe the pattern of the central and peripheral innervation in an experimental model widely used in neurobiological research. Macroscopic anatomy revealed that the midgut was formed by the stomach, divided into pro-ventricle and gizzard, and intestine, divided into pro-intestine or tiflossolear, medium- and post-intestine, while the hindgut was formed by the rectum and anus. The light microscopy revealed that the GIt wall was constituted by four tunics: (i) the mucosa was constituted by a intermittent ciliated columnar epithelium and lamina propria; (ii) the submucosa was a loose connective tissue, containing a system of haemocoelic spaces; (iii) the muscular was formed by the internal circular and external longitudinal layers, while in the gizzard there was a third muscular layer disposed obliquely and the cardia and pylorus regions contained two sphincters (iv) the serosa display a loose connective tissue covered by a mesothelium. The midgut is innervated by the common visceral nerve, through gastrointestinal branch (Gb), while the hindgut is innervated by the rectum-anal nerve (Rn). Retrogradely backfilling with CoCl2 added with 0.1% bovine albumin, byocitin and horseradish peroxidase from the Gb and Rn is employed to reveal the neurons innervating these digestive regions which are located in all ganglia within the viscera-parietal ganglia complex. Although we observed the presence of a network of four ganglia: stomatogastric, gastric, cardic and pyloric, interconnected by nerves and located outer the surface of the stomach, which in the present study was referred to as the stomatogastric nervous system (STNS). Anterogradely labelin with Lucifer yellow which fibers of the STNS project to the submucous (SP) and myenteric plexuses (MP). The morphology of the enteric nervous system (ENS) was described using silver diammine impregnation and methylene blue staining. These plexuses were formed by extensive axonal networks and by several neuronal somata which are arranged in small clusters or as isolated cells. The axonal fibers innervating the longitudinal muscle cells in the stomach wall are organized in small bundles along the muscle length. The MP is distributed throughout the circular and longitudinal muscular layer. In the stomach, the cardic area plexus is denser than the pyloric plexus, while the nervous fibers of both are located between and around the muscular bundles The enteric plexus in the intestine is a continuity of the pyloric arrangement, staying uniform until the anus. In both typhlosoles of the pro-intestine nerve bundles are found in large numbers but none neuron is observed. In addition to the plexus were observed were observed neuron-like intraepithelial cells, which possess two types: open (a cilium projecting into the intestinal lumen) and closed (located at the base of the digestive epithelium) and fusiform cells whose morphology and position resembling interstitial cells of Cajal. The chemical neuroanatomy of the STNS and SNE was analyzed by histochemistry and immunohistochemistry methodos for different mediators and transmitters. In the midgut and hindgut, the plexus have a very intense AChE activity and it was constituted by fibers originated from the STNS or from the subesophageal complex through peripheral nerves. The enteric neurons and fibers with AChE activity were scattered in the submucosa and between the circular and longitudinal muscle layers of the stomach, intestine and rectum. Neuronal bodies and fibers with NADPHd activity are more abundant in the entire mass of smooth muscle elements than the submucosal layer. Fluorescent induced by GA revealed the presence of catecholaminergic nerve fibers and varicosities in the submucosal layer of the rectum, gizzard and post-intestine than in others organs of the GIt. The immunoreactivity to serotonin (5HTir) elements was predominantly distributed in the submucosal layer of the intestine and rectum. Few 5HTir fibers was verify in the proventricle and gizzard The FMRFa-immunoreactive elements were present in the mucosal, submucosal and muscular layers throughout the mid and hindgut. The neuron-like intraepithelial cells were more labeled by AChE, 5HT and FMRFa than for NADPHd and their processes were organized forming a subepithelial plexus. The bodies and processes of the fusiform cells were labeled by the methods applied extensions, except for the GA. It was found an intense glial fibrilary acidic protein immunorreaction (GFAP-ir) were visualized, throughout the midgut and hindgut plexuses and in the ganglia of the STNS. This intense immunoreaction to GFAP in intramural plexuses suggests important roles to glial cells in the peripheral nervous system of digestive tract of this pulmonate snail. Therefore, the gastrointestinal tract is controlled directly by extrinsic innervation from the subesophageal ganglia or indirectly via STNS (for the midgut) and by an intrinsic innervation, represented by the MP and SP for both mid and hindgut. The data obtained from the neurochemical approaches utilized in the GIt we infer that these different transmitter systems could exert putative roles in the motility or the secretomotor or sensorial functions of GIt. Finally, as an evidence of the enteric glial cells, the neural constituents of the snail GIt wall have a interaction with glia similar to have been described to invertebrate CNS represent a new approach to study of the ENS in gastropod and other invertebrates.

A cafeína é o psicoestimulante mais consumido em todo o mundo, cujos efeitos benéficos nas funções cognitivas têm sido observados em diferentes condições e modelos animais. O consumo de cafeína é difundido entre adultos, idosos, gestantes e mais recentemente, entre crianças e adolescentes. Alguns estudos clínicos e pré-clínicos sugerem que a exposição pré-natal à cafeína apresenta efeitos prejudiciais, como prematuridade, malformações congênitas, baixo peso ao nascer e mesmo teratogenicidade, enquanto outros estudos não demonstraram efeitos deletérios a longo prazo da cafeína. Além disso, poucos estudos têm abordado os efeitos da cafeína nas diferenças de sexo durante a puberdade e/ou adolescência. Devido ao alto consumo de bebidas contendo cafeína por crianças e adolescentes, existe uma grande preocupação a respeito dos seus potenciais efeitos nocivos nessas subpopulações. Assim, considerando que o consumo de cafeína tem crescido nesta população, no primeiro capítulo desta tese investigamos as alterações comportamentais e de proteínas sinápticas em ratos machos e fêmeas púberes expostos à cafeína pelo consumo materno durante a gestação, lactação e na água de beber até o início da puberdade. Ratas Wistar adultas receberam cafeína na água de beber (0.1 e 0.3 g/L) durante o seu ciclo ativo, em dias úteis, duas semanas antes do acasalamento até o desmame, quando então os filhotes passaram a consumir a cafeína até o início da sua puberdade (30-34 dias de idade) A análise comportamental e os níveis de proteínas sinápticas (pró-BDNF, BDNF, GFAP e SNAP-25) foram analisados no hipocampo e córtex cerebral. As fêmeas púberes apresentaram uma atividade locomotora maior e comportamento menos ansioso que os machos. Em ambos os sexos, a cafeína causou hiperlocomoção no campo aberto. Enquanto a cafeína em doses moderadas causou um prejuízo na memória de reconhecimento em fêmeas, foi observado uma melhora na memória de longo prazo em ambas as doses em ratos machos. O comportamento relacionado à ansiedade foi atenuado pela cafeína (0,3 g/L) apenas em fêmeas. Paralelamente com a melhora da memória nos machos, a cafeína aumentou os níveis de pró-BDNF e BDNF no hipocampo e córtex. As fêmeas apresentaram um aumento do pró-BDNF em ambas as regiões avaliadas em comparação aos machos. Embora a proteina GFAP não tenha sido alterada pelas diferenças de sexo e pelo tratamento com cafeína, a cafeína em doses moderadas aumentou o imunoconteúdo de SNAP-25 no córtex das fêmeas. Os resultados demonstram que o consumo de cafeína altera de forma distinta a memória de reconhecimento e o comortamento do tipo ansioso em ratos machos e fêmeas púberes. Além disso, o BDNF e proteínas relacionadas também foram modificados de uma forma dependente do sexo, sugerindo que alterações sinápticas ou de plasticidade podem estar associadas aos efeitos comportamentais Além dos efeitos da cafeína durante a gravidez e a puberdade, têm sido observados efeitos benéficos da cafeína sobre a memória no envelhecimento normal e no prejuízo observado em em modelos animais de doenças neurodegenerativas. Tendo em vista que os mecanismos subjacentes a estes efeitos da cafeína ainda permanecem desconhecidos, no segundo capítulo investigamos se a administração crônica de cafeína poderia melhorar o desempenho na tarefa de memória avaliada pelo teste da esquiva inibitória em ratos adultos e de meia-idade. Como o BDNF está associado com a formação da memória e as ações do BDNF são moduladas pelos receptores de adenosina, os alvos moleculares para as ações psicoestimulantes da cafeína, neste estudo avaliamos os efeitos da administração crônica de cafeína (1 g/L na água de beber durante 30 dias) na memória de curta e longa duração e nos níveis de pró- BDNF, BDNF maduro,o receptor TrkB e o fator de transcrição CREB no hipocampo de ratos machos adultos (3 meses de idade) e de meia-idade (12 meses) Ambos os gruposforam submetidos a tarefa de campo aberto e esquiva inibitória. Os ratos de meia-idade apresentaram diminuição da atividade locomotora em relação aos adultos e a cafeína não teve efeitos sobre a locomoção em ambas idades Na tarefa de esquiva inibitória, avaliou-se a memória de curta e longa duração. Ratos de meia-idade apresentaram um comprometimento total da memória de curta duração, e parcial da memória de longa duração em comparação com ratos adultos. O consumo de cafeína foi capaz de reverter o prejuízo decorrente da idade tanto para a memória de curta quanto de longa duração. O aumento do BDNF hippocampal causado pelo envelhecimento foi prevenido pelo consumo de cafeína, juntamente com um aumento no imunoconteúdo de pró-BDNF e CREB em ambas as idades. Além disso, os níveis de CREB aumentaram com o envelhecimento. Houve uma diminuição no imunoconteúdo de TrkB no hipocampo de ratos de meia-idade quando comparados aos adultos, e a cafeína diminuiu a densidade de TrkB em ambas as idades. Os dados encontrados indicam uma estreita associação entre a modificação do desempenho da memória e imunoconteúdo BDNF. Em conjunto, esses resultados apresentam novos indícios de que o consumo de cafeína promove desfechos comportamentais sexo-específicos em ratos púberes, além de ser capaz de normalizar o desempenho em tarefas de memória e alterações na sinalização do BDNF causadas pelo envelhecimento. / Caffeine is the most consumed psychostimulant worldwide, and the beneficial effects of chronic caffeine administration on cognitive function have been observed in different conditions and animal models. Caffeine consumption is widespread among adults, eldery, pregnant women and more recently, children and adolescents. Some clinical and preclinical studies suggest that prenatal exposure to caffeine presents harmful effects, such as prematurity, congenital malformations, low birth weight and even teratogenicity, whereas others studies demonstrated no long-term harmfull effects of caffeine. Besides that, few studies have addressed the effects of caffeine in a sex dependent manner during puberty and/or adolescence. Also, due to the increase in the consumption of caffeine containing drinks by children and adolescents, the potential harmful effects of caffeine in these subpopulations need to be investigated. Considering that caffeine intake has grown in this population, in the first chapter of the this thesis we investigated the behavioral and synaptic proteins changes in pubescent male and female rats after maternal consumption of caffeine. Adult female Wistar rats started to receive caffeine in drinking water (0.1 and 0.3 g/L; low and moderate dose, respectively) during the active cycle in weekdays, two weeks before mating. The treatment lasted up to weaning (21 days) and offspring continued receiving caffeine until the onset of puberty (30-34 days old). Behavioral analysis and synaptic proteins levels (proBDNF, BDNF, GFAP and SNAP-25) were immunodetected in the hippocampus and cerebral cortex. Pubescent females showed hyperlocomotion and less anxiety behavior as compared to males. In both sexes caffeine caused hyperlocomotion in the open field. While moderate caffeine worsened recognition memory in females, an improvement for long-term memory in both doses was observed in male rats Anxiety-related behavior was attenuated by caffeine (0.3 g/L) only in females. Also, in parallel with memory improvement in males, caffeine increased pro- and BDNF in the hippocampus and cortex. Females presented increased proBDNF in both brain regions as compared to males. While GFAP was not different according to sex or altered by caffeine consumption, moderate caffeine increased SNAP-25 in the cortex of female rats. Our findings revealed that caffeine differently affects recognition memory and anxietyrelated behaviors in pubescent male and female rats. In addition, BDNF and related proteins have also changed in a sex dependent manner, suggesting an association with behavioral outcomes. Beyond caffeine effects during pregnancy and puberty, beneficial effects of caffeine on memory processes have been observed in animal models relevant to neurodegenerative diseases and aging, although the underlying mechanisms remain unknown. In the second chapter we investigated whether chronic caffeine consumption could improve the performance in inhibitory avoidance memory task in adult and middle-aged rats. Because brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is associated with memory formation and BDNF’s actions are modulated by adenosine receptors, the molecular targets for the psychostimulant actions of caffeine, we here compare the effects of chronic caffeine (1 mg/mL drinking solution for 30 days) on short- and long term memory and on levels of hippocampal proBDNF, mature BDNF, TrkB and CREB in young (3 month old) and middle-aged (12 month old) male rats. Both groups were submitted to open field and inhibitory avoidance tasks. Middle-aged rats presented decreased locomotor activity as compared to adults and caffeine was devoid of effect at any age. In the inhibitory avoidance task, short- and long-term memory was evaluated Middle-aged rats presented impaired performance compared to adult ones for short-term memory. When long-term memory was evaluated, middle-aged rats showed a decreased in their perfomances compared to adult rats, and caffeine treatment was able to improveit. Western blot analysis showed that BDNF and CREB imunocontent increased in the hippocampus of aged rats and caffeine consumption was able to prevent the changes in BDNF levels. In addition, caffeine treatment increased the pro-BDNF and CREB immunocontent in both ages. Furthermore, CREB densities increased with aging. TrkB immunocontent was decreased in the hippocampus from middle-aged rats when compared to adult ones, and caffeine decreased the density of TrkB in both ages. The present findings indicate a close association between the modification of memory performance and BDNF immunocontent. Therefore, our data suggest caffeine normalyze memory performance upon aging and may be related to the ability of caffeine to normalyze the levels of BDNF. Taken together, these results present new evidence that caffeine consumption promotes sex-specific behavioral outcomes in addition to being able to normalize memory performance during aging and that changes could be related to a modification in BDNF signaling.

O núcleo medial (Me) é parte superficial do complexo amigdaliano e ainda muito pouco se conhece de seus constituintes celulares em seres humanos. Neste estudo desenvolveu-se uma adaptação do método de Golgi do tipo “single-section” para tecido nervoso humano fixado e conservado em formalina por tempo variável. Além disso, descreveu-se a densidade de neurônios e células da glia no Me, sua morfologia geral, incluindo detalhes de espinhos dendríticos e terminações axonais, a imunorreatividade à proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e a ultraestrutura sináptica local. Como resultados demonstrou-se que as células da glia são maioria neste núcleo (cerca de 72% do total de células) e que há significativamente mais neurônios no Me do hemisfério esquerdo (1.53 X 105 neurônios/mm3). Os somas neuronais impregnados pelo método de Golgi demonstraram-se redondos/ovais, fusiformes ou poligonais (diâmetros entre 10-30 μm), os dendritos estenderam-se por distâncias variadas e contiveram espinhos pleomórficos, caracterizando neurônios com menos e mais espinhos dendríticos (densidades de 1,5 até 5,2 espinhos/μm), e os axônios revelaram terminações desde simples até muito complexas. Os neurônios multipolares foram classificados em Tipos 1, 2 ou 3 de acordo com trabalhos prévios, ou ainda em tipos morfológicos ainda não classificados Observaram-se astrócitos protoplasmáticos com muitos prolongamentos reativos à GFAP, isolados ou em grupos. Esses, no estudo ultra-estrutural, compuseram sinapses “tripartites” e “tetrapartites”, considerando-se o quarto elemento o da matriz extracelular situada entre os elementos pré- e pós-sinápticos. As sinapses axodendríticas apresentaram-se tanto assimétricas (com vesículas redondas pequenas e elétron-lúcidas) como simétricas (com vesículas pleomórficas pequenas e claras e, adicionalmente, com vesículas redondas grandes ou pequenas de centro escuro). Terminais axonais estabelecendo múltiplas sinapses assimétricas, classificados como de tipo “glomérulo”, também foram observados. A presente tese contribui com dados descritivos e quantitativos inéditos sobre a morfologia das células do Me, o que pode servir de base para o entendimento e novas investigações sobre o funcionamento desse núcleo em situações normais ou patológicas em seres humanos. / The medial nucleus (Me) is a superficial component of the amygdaloid complex. Little is currently known about its cellular composition in humans. Here is reported an adaptation of the “single-section” Golgi method for formalin fixed and stored human brain for diversified periods. Furthermore, the density of neurons and glial cells in the Me, their general morphology including dendritic spines and axonal terminals details, the glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunoreactivity, and features of local cells under electron microscopy are described. Our results show that Me had an estimated mean neuronal density around 1.53 X 105 neurons/mm3 (higher in the left hemisphere), more glia (72% of all cells) than neurons, and a nonneuronal/neuronal ratio of 2.7. Golgi-impregnated neurons had cell bodies with a round/ovoid, fusiform or polygonal shape (diameters ranging from 10 to 30 μm), dendrites with varying lengths and pleomorphic spines that characterized neurons more or less spiny (density varying from1.5 to 5.2 spines/μm), and ranging from simple to very complexes terminal axons. Neurons appeared as “bitufted” or stellate multipolar cells, or classified in “Types 1 to 3” according to previous immunohistochemical observations, or other still unclassified morphologies. Protoplasmic astrocytes, either isolated or forming small clusters, were observed and showed multiple branches immunoreactive for GFAP, being equally distributed between right and left hemispheres They were found composing tripartite synapses or, together with an evident extracellular matrix between pre- and postsynaptic elements, tetrapartite ones. Axo-dendritic synapses were both asymmetrical (with various small, round electron-lucent vesicles) and symmetrical (with small pleomorphic vesicles and, occasionally, few intermingled large dense-core vesicles). Terminal axons with a glomerular-like structure were also found forming various asymmetric contacts. The present thesis add novel descriptive and qualitative information about neuronal and glial population of the human Me, which provide a basic contribution to our understanding, and to further research, of the functional implications of the Me in the brain organization both in normal and pathological conditions .

O diabetes mellitus tipo I é uma enfermidade autoimune relacionada com anormalidades genéticas, influenciada por fatores ambientais, que resultam na destruição de células β-pancreáticas, mediadas por células T. O diabetes durante a gravidez aumenta o risco a alterações no sistema nervoso central. O processo de gliogênese é importante para o desenvolvimento e funcionamento do SNC e começa na segunda semana de gestação, em ratos. A glia é composta por astrócitos, oligodendrócitos, células ependimais e microglia. Os astrócitos são as células mais abundantes e responsáveis pela integração do cérebro com o sistema vascular e imunológico, estando relacionados com as funções cognitivas, além de uma importância física e estrutural na barreira hemato-encefálica. Duas proteínas astrocíticas foram estudadas aqui: a proteína glial fibrilar acida e a S100B, uma proteína ligante de cálcio, produzida e secretada por astrócitos. A S100B está envolvida na comunicação neurônio-glia, possuindo propriedades neurotróficas ou neurotóxicas de acordo com a concentração extracelular. A expressão da proteína glial fibrilar ácida é essencial para a estrutura encefálica e para a integridade da barreira hemato-encefálica. Assim avaliamos essas proteínas gliais na prole oriunda de mães diabéticas (PoD) no desenvolvimento corporal e do sistema nervoso central. Foram utilizadas ratas Wistar-Kyoto diabéticas induzidas por estreptozotocina para obtenção da prole. As fêmeas diabéticas induzidas apresentaram ninhadas menores do que o controle, e os filhotes apresentam menor peso ao nascer A hiperglicemia materna induz aumento da produção insulínica no feto, que leva a um quadro de hipoglicemia pós-natal. Os níveis glicêmicos do PoD foram superiores ao controle (PoC) com 1 dia, e inferiores com 21 dias. A mensuração da proteína S100B no soro de animais PoD14 apresentou diminuição em relação ao controle. A S100B no líquor mostrou valores foram maiores no PoD7. Já a S100B no hipocampo mostrou um crescimento progressivo, com diminuição no PoD14 e um aumento no PoD28. Na quantificação da proteína glial fibrilar acida os animais do grupo PoD7 e PoD14 apresentaram valores menores, em seguida os níveis começaram a subir. No teste de campo aberto os animais PoD apresentaram comportamento ansioso. Já no reconhecimento de objetos os ratos PoD exploraram menos o objeto novo, tanto na memória de curta como de longa duração. As mudanças astrogliais observadas nos animais do grupo PoD estão muito provavelmente relacionadas a alterações da plasticidade neuroglial e ao déficit cognitivo observado. / The type I diabetes mellitus is an autoimmune disease associated with genetic abnormalities, influenced by environmental factors which result in the destruction of pancreatic β-cells, mediated by T cells. Diabetes during pregnancy increases the risk of changes in the central nervous system. The gliogenesis process is important to the development and functioning of the central nervous system and starts the second week of rat gestation. The glia is composed of astrocytes, oligodendrocytes, ependymal cells and microglia. The astrocytes are more abundant cells and responsible for the integration of the brain with vascular and immune systems, being connected with the cognitive functions, as well as a physical and structural importance of the blood-brain barrier. Two astrocity proteins were studied: glial acidic fribrilar protein and S100B, a binding protein of calcium produced and secreted by astrocytes. S100B is involved in neuron-glia communication, having neurotoxic or neurotrophic properties according to the extracellular concentration. Expression of glial acidic fribrilar protein is essential for brain structure and integrity of the blood-brain barrier. So we evaluated this glial proteins the offspring derived from diabetic mothers (PoD) on body development and central nervous system. Wistar-Kyoto rats with diabetes induced by streptozotocin to obtain offspring. Induced diabetic females had smaller litters then the control, and the offsprig have a lower birth weigth Maternal hyperglycemia induces increased insulin production in the fetus. Blood glucose levels were higher in PoD than the control (PoC) with 1 day and less than 21 days. The measurement of S100B protein in PoD14 animal serum showed a decrease compared to the control. The S100B in cerebrospinal fluid showed values were higher in PoD7. Since S100B in the hippocampus showed a progressive increase with decrease in PoD14 and increase in PoD28. Glial acidic fribrilar protein quantification in animals of PoD7 and PoD14 group showed lower values, and then levels began to rise. In the open field test the PoD animals showed anxious behavior. Since the object recognition (RO) least rats explored the new object in both short and long term memory. Induced diabetic females had smaller litters than the control, and the chicks have a lower birth weight. Maternal hyperglycaemia induces increased insulin production in the fetus, which leads to a postnatal hypoglycemia. The variations observed in the animals of group PoD caused biochemical changes related to astroglial plasticity, which caused cognitive impairment.

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.

Evidências sugerem que o aprendizado e a realização de tarefas motoras de habilidade podem induzir mudanças comportamentais e neurofisiológicas, o que ocorre tanto em animais intactos quanto naqueles submetidos às lesões do SNC. Nesse sentido, alguns trabalhos evidenciam uma possível participação dos astrócitos GFAP+ na plasticidade induzida por experiências comportamentais. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o desempenho sensório-motor e aspectos morfológicos de astrócitos GFAP+ em estruturas encefálicas importantes para o controle motor, tais como o córtex sensório-motor (área de representação do membro anterior) e o estriado dorsolateral, em ratos controles ou submetidos à HIC e aos treinamentos de habilidade do alcance (TH) ou ao treinamento de não-habilidade (TNH). Para tanto, ratos Wistar adultos foram inicialmente adaptados às diferentes tarefas motoras empregadas ao longo de três semanas. Após, os mesmos foram submetidos às cirurgias de indução da hemorragia intracerebral (HIC) por meio da administração intra-estriatal de colagenase tipo IV ou sham. Em seguida, os animais dos grupos S-TH e HIC-TH foram submetidos ao treinamento da tarefa de habilidade do alcance e preensão, os animais dos grupos S-TNH e HIC-TNH foram submetidos ao treinamento da tarefa de não-habilidade e os animais S-ST e HIC-ST não receberam nenhum tipo de treinamento durante 4 semanas. Ao longo desse período, os animais foram testados quando ao desempenho sensório-motor ao final de cada semana de treinamento (exceto o teste do cilindro, realizado apenas nos períodos pré-cirurgia, pós-cirurgia e póstreinamento). Encerrado o período de treinamento, os animais foram profundamente anestesiados, perfundidos e tiveram seus encéfalos processados para a análise morfológica. Os resultados demonstram que a realização da tarefa de habilidade do alcance e preensão foi capaz de aumentar o comprimento dos processos primários em astrócitos GFAP+, o que ocorreu em estruturas cerebrais importantes para o controle motor, tais como o córtex sensório-motor (bilateralmente) e o estriado dorsolateral (perilesional), tanto em animais lesados pela HIC quanto em animais nãolesados. De modo particular, essas modificações astrogliais foram aumentadas quando ocorreu a associação da HIC com o treinamento de habilidade do alcance. Além disso, a referida tarefa de habilidade, mas não o treinamento de não-habilidade, foi capaz de promover uma melhor recuperação sensório-motora, avaliada pelos testes comportamentais. Sendo assim, nossos resultados sugerem que as modificações morfológicas em astrócitos GFAP+ poderiam fazer parte dos mecanismos neurobiológicos que medeiam a plasticidade induzida pela tarefa de habilidade, tanto em animais que sofreram uma HIC quanto em animais não-lesados, além de possivelmente contribuírem para a recuperação sensório-motora.

Evidências sugerem que o aprendizado e a realização de tarefas motoras de habilidade podem induzir mudanças comportamentais e neurofisiológicas, o que ocorre tanto em animais intactos quanto naqueles submetidos às lesões do SNC. Nesse sentido, alguns trabalhos evidenciam uma possível participação dos astrócitos GFAP+ na plasticidade induzida por experiências comportamentais. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o desempenho sensório-motor e aspectos morfológicos de astrócitos GFAP+ em estruturas encefálicas importantes para o controle motor, tais como o córtex sensório-motor (área de representação do membro anterior) e o estriado dorsolateral, em ratos controles ou submetidos à HIC e aos treinamentos de habilidade do alcance (TH) ou ao treinamento de não-habilidade (TNH). Para tanto, ratos Wistar adultos foram inicialmente adaptados às diferentes tarefas motoras empregadas ao longo de três semanas. Após, os mesmos foram submetidos às cirurgias de indução da hemorragia intracerebral (HIC) por meio da administração intra-estriatal de colagenase tipo IV ou sham. Em seguida, os animais dos grupos S-TH e HIC-TH foram submetidos ao treinamento da tarefa de habilidade do alcance e preensão, os animais dos grupos S-TNH e HIC-TNH foram submetidos ao treinamento da tarefa de não-habilidade e os animais S-ST e HIC-ST não receberam nenhum tipo de treinamento durante 4 semanas. Ao longo desse período, os animais foram testados quando ao desempenho sensório-motor ao final de cada semana de treinamento (exceto o teste do cilindro, realizado apenas nos períodos pré-cirurgia, pós-cirurgia e póstreinamento). Encerrado o período de treinamento, os animais foram profundamente anestesiados, perfundidos e tiveram seus encéfalos processados para a análise morfológica. Os resultados demonstram que a realização da tarefa de habilidade do alcance e preensão foi capaz de aumentar o comprimento dos processos primários em astrócitos GFAP+, o que ocorreu em estruturas cerebrais importantes para o controle motor, tais como o córtex sensório-motor (bilateralmente) e o estriado dorsolateral (perilesional), tanto em animais lesados pela HIC quanto em animais nãolesados. De modo particular, essas modificações astrogliais foram aumentadas quando ocorreu a associação da HIC com o treinamento de habilidade do alcance. Além disso, a referida tarefa de habilidade, mas não o treinamento de não-habilidade, foi capaz de promover uma melhor recuperação sensório-motora, avaliada pelos testes comportamentais. Sendo assim, nossos resultados sugerem que as modificações morfológicas em astrócitos GFAP+ poderiam fazer parte dos mecanismos neurobiológicos que medeiam a plasticidade induzida pela tarefa de habilidade, tanto em animais que sofreram uma HIC quanto em animais não-lesados, além de possivelmente contribuírem para a recuperação sensório-motora.

Tanto a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) quanto a proteína S100B têm sido utilizadas como marcadores de plasticidade astroglial, particularmente em danos encefálicos; entretanto, elas não necessariamente sofrem alterações ao mesmo tempo ou no mesmo sentido. Neste trabalho, nós induzimos um modelo da doença de Parkinson (DP) através de injeções intraestriatais de 6-OHDA em ratos e investigamos as alterações em GFAP e S100B, por meio de ELISA, na substância negra (SN), estriado e líquido cefalorraquidiano (LCR), um, sete e 21 dias após a cirurgia. O modelo experimental foi validado por meio da medida do comportamento rotacional induzido por metilfenidato e conteúdo da enzima tirosina-hidroxilase (TH) na SN e estriado. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que se mostra a dosagem de S100B e GFAP no LCR no modelo de 6-OHDA. Foi identificada uma gliose no estriado (com base no aumento de GFAP), mas tal alteração não foi identificada na SN. Identificamos um aumento transitório de S100B e GFAP, no 1° e 7° dias após a cirurgia, respectivamente. Esta alteração inicial de S100B no LCR aparentemente está relacionada à lesão mecânica. Entretanto, em culturas de astrócitos, confirmamos a indução da secreção de S100B provocada por 6-OHDA. A toxina dopaminérgica MPTP também foi capaz de aumentar a secreção. Estes dados apontam para um efeito direto das toxinas 6-OHDA e MPTP nas células gliais. Também testamos o efeito destas toxinas em fatias estriatais frescas. Porém, neste tipo de preparação, não foram capazes de induzir a secreção de S100B, em 1h. O conteúdo intracelular de S100B e GFAP não foi alterado. Os dados apresentados reforçam a utilização destas toxinas em modelos da DP, além de indicar a importância da proteína S100B como um marcador útil nesta doença. / Both glial fibrillary acidic protein (GFAP) and S100B have been used as markers of astroglial plasticity, particularly in brain injury; however, they do not necessarily change in the same time frame or direction. Herein, we induced a Parkinson’s disease (PD) model via a 6-OHDA intrastriatal injection in rats and investigated the changes in GFAP and S100B using ELISA in the substantia nigra (SN), striatum, and cerebrospinal fluid on the 1st, 7th, and 21st days following the injection. The model was validated using measurements of rotational behaviour induced by methylphenidate and tyrosine hydroxylase in the dopaminergic pathway. To our knowledge, this is the first measurement of cerebrospinal fluid S100B and GFAP in the 6-OHDA model of PD. Gliosis (based on a GFAP increase) was identified in the striatum, but not in the SN. We identified a transitory increment of cerebrospinal fluid S100B and GFAP on the 1st and 7th days, respectively. This initial change in cerebrospinal fluid S100B was apparently related to the mechanical lesion. However, the 6-OHDA-induced S100B secretion was confirmed in astrocyte cultures. MPTP also increased S100B secretion in astrocyte cultures. These data point to a direct effect of the toxins 6-OHDA and MPTP on glial cells evaluated by S100B secretion. Under these conditions acute striatal slices did not secrete S100B in response to these toxins. No direct changes were observed in the cellular content of S100B or GFAP. In summary, these data reinforce the use of these toxins in PD models, as well as indicate the importance of the glial-derived protein S100B as useful marker in PD.