Nous avons recherché la base génétique de la prédisposition à la myopathie par surcharge en polysaccharides. C'est une des causes du syndrome « coup de sang » de certains chevaux lourds : baisse de performances, boiterie, crampes, myoglobinurie. L'étude du phénotype chez le Cob normand a précisé l'épidémiologie, les lésions et la pathogénie de cette affection. L'analyse fonctionnelle de l'expression des gènes dans les muscles atteints montre une inflammation, une inhibition de l'activité mitochondriale, une perturbation du métabolisme énergétique et une hypoxie. La caractérisation structurale et fonctionnelle du gène de l'enzyme débranchante du glycogène (AGL) a mis en évidence un nouveau transcrit équin. Une étude d'association entre le phénotype et les polymorphismes de quatre gènes candidats a confirmé l'origine de cette myopathie : une mutation ponctuelle du gène de la glycogène synthase (GYS1). Cette nouvelle forme de glycogénose se comporte selon un mode autosomique dominant.

La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie métabolique rare liée à une absence d'activité glucose‐6 phosphatase (G6Pase). La G6Pase est une enzyme clé de la production endogène de glucose (PEG) catalysant l'hydrolyse du G6P en glucose avant sa libération dans le sang. Cette fonction est restreinte au foie, aux reins et à l'intestin. La GSD1a est caractérisée par des hypoglycémies chroniques, une hépatomégalie associée à une stéatose hépatique et une néphromégalie. A plus longterme, la plupart des patients développent des adénomes. Un modèle murin de GSD 1a existe mais les souris ne survivent pas après le sevrage. Nous avons donc généré un modèle original de GSD1a, en invalidant le gène de la sous‐unité catalytique de la G6Pase spécifiquement dans le foie, grâce à une stratégie CRE‐LOX inductible (souris L‐G6pc‐/‐). Dans ce travail, nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont viables et reproduisent parfaitement la pathologie hépatique de la GSD1a, y compris le développement d'adénomes hépatiques après 9 mois d'invalidation. La viabilité des souris nous a permis de débuter des traitements par thérapie génique ciblant le foie à l'aide de vecteurs lentiviraux et AAV. La survie de ces souris, qui ne peuvent pas produire du glucose par le foie, repose la question du rôle relatif de la production hépatique de glucose dans la régulation de la glycémie Nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont capables de réguler leur glycémie, même au cours d'un jeûne prolongé. Ce maintien de l'homéostasie glucidique est due à une induction rapide de la néoglucogenèse rénale et intestinale, principalement par un mécanisme dépendant du glucagon

Première partie: Les adénomes hépatocellulaires (AHC) sont des tumeurs bénignes qui se développent le plus souvent chez la femme jeune suite à la prise de contraceptifs oraux. Ils sont classés, sur le plan moléculaire, en: 1) AHC inflammatoires (AHCI), caractérisés par des mutations de différents gènes (IL6ST, GNAS ou STAT3) entrainant une activation de la voie de signalisation de l'interleukine 6; 2) les AHC avec mutations biallèliques inactivatrices d'HNF1A (H-AHC); 3) les AHC mutés pour CTNNB1 (bAHC) qui présentent un risque accru de transformation maligne et 4) les AHC non classés (UAHC). La glycogénose de type I (GSD I) est une maladie métabolique héréditaire rare qui prédispose au développement des AHC. Cependant les principales études moléculaires des AHC ont été réalisées sur des tumeurs sporadiques, et le profil moléculaire des AHC associée à la GSDI reste à déterminer.L'objectif de notre a été de caractériser, par des techniques de séquencage et de PCR quantitative, les altérations moléculaires d'une série d'AHC développés chez les patients atteints de GSD. Nous avons mis en évidence que le profil des AHC développés dans un contexte de GSDI était différent de celui des AHC sporadiques, avec aucun H-AHC et une tendance vers une augmentation de la fréquence des mutations de CTNNB1. Nous avons également observé que les foies non tumoraux des patients atteints de GSDI présentaient différentes anomalies métaboliques (répression de la néoglucogenèse et activation de la glycolyse et de la synthèse des acides gras) également retrouvées dans les H-AHC sporadiques. Ces anomalies sont d'autre connues pour favoriser la cancérogénèse. Notre étude a ainsi démontré que la GSDI prédisposait à des AHC de sous type moléculaire particulier, elle a également identifié diverses anomalies métaboliques observées dans les foies non tumoraux des patients atteints de GSDI qui pourraient contribuer au développement des tumeurs. Deuxième partie: Le carcinome hépatocellulaire (CHC), développé à partir des hépatocytes, est la tumeur maligne hépatique primitive la plus fréquente. Il représente le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde et la troisième cause de mortalité liée au cancer. Il se développe dans environ 80% des cas dans un contexte d'hépatopathie chronique, sur parenchyme cirrhotique. Le processus de transformation maligne de la cirrhose en CHC est séquentiel, et passe par différentes étapes prénéoplasiques, comme les macronodules de bas ou haut grade. Il a récemment été mis en évidence que l'anomalie moléculaire la plus fréquente dans le CHC était les mutations du promoteur de TERT, gène codant pour la télomérase. Le but de notre étude a été d'étudier si ces mutations étaient également présente dans une série de 96 nodules développés sur cirrhose. Dans 31 cas, nous avons également déterminer le statut mutationnel de 10 gènes fréquemment mutés dans le CHC. L'ensemble des nodules a fait l'objet d'une relecture par 6 anatomopathologistes spécialisés en pathologie hépatique, et l'expression de marqueurs immunohistochimiques de malignité (Glypican 3, heat Shock protein 70, Glutamine Synthetase) a été évaluée. Nous avons identifié des mutations dans 6% des macronodules de bas grade, 20% des macronodules de haut grade, et dans environ 50% des nodules transformés en CHC. L’existence de mutations était corrélée à plusieurs critères morphologiques et immunohistochimiques de malignité. Aucune mutation dans un des 10 autres gènes fréquemment mutés dans le CHC n’a été retrouvée. Nos résultats démontrent que la fréquence des mutations du promoteur de TERT augmente au cours de la carcinogénèse hépatique, et qu’il s’agit d’une anomalie très précoce qui pourrait constituer un biomarqueur d'évaluation du risque de transformation des lésions prénéoplasiques développées sur cirrhose. / First Part: Hepatocellular adenomas (HCA) are benign tumors which most often develop in young women taking oral contraceptives. They are classified as : 1) inflammatory HCA (IHCA), characterized by mutations of genes (IL6ST, GNAS, STAT3) involved in the interleukin 6 pathway; 2) HCA with biallelic inactivating mutations of HNF1A (H-HCA) ; 3) CTNNB1 mutated HCA (bAHC), which harbour a high risk of malignant transformation and 4) unclassified HCA (UHCC). Glycogen storage disease type 1 (GSD1) is a rare hereditary metabolic disease that predispose to HCE development. The main molecular studies of HCA were pervformed on sporadic cases, and the molecular profile of HCA associated to GSDI remains to be investigated. The aim of our study was to characterize, by gene sequencing and gene expression profiling, a series of HCA developed in patients with GSD1. The molecular profile of GSD1 HCA was different to that of sporadic HCA, with a lack of H-HCA and a high frequency of b-HCA. We also observed that non tumoral livers of GSD1 patients featured several metabolic alterations (gluconeogenesis repression, glycolysis and fatty acid synthesis activation) that were also observed in sporadic H-HCA and may favor carcinogenesis. Alltogether, our study demonstrated that GSD1 predispose to particular HCA subtypes and the metabolic alterations observed in non tumorl liver of GSD1 patients may contribute to tumor formation. Second Part: Hepatocellular carcinoma (HCCIt is the fifth most frequent cancer and the third cause of cancer related death worldwide. If TERT promoter mutations are, so far, the most frequent recurrent molecular alterations of HCC, genetic determinants of the early steps of carcinogenesis on cirrhosis are still poorly understood. We aimed to evaluate the occurrence of telomerase reverse transcriptase (TERT) promoter mutations in a series of 96 macrondouels developed in a cirrhotic background. For 30 cases, 10 genes frequently mutated in HCC were also screeened. Six liver pathologists reviewed all the samples, and mmunohistochemistry (IHC) analyses were performed for glypican 3, glutamine synthase, and heat shock protein 70. TERT promoter mutations were highly related to the step-wise hepatocarcinogenesis because mutations were identified in 6% of low grade dysplastic nodules, 19% of high grade dysplastic nodules, 61% of high grade nodules with foci of transformation into HCC, and 42% of small HCC. Mutations in the 10 genes recurrently mutated in HCC were only identified in 28% of the small HCC. In conclusion, Frequency of TERT promoter mutations rapidly increases during the different steps of the transformation of premalignant lesions into HCC on cirrhosis. Consequently, somatic TERT promoter mutation is a new biomarker predictive of transformation of premalignant lesions into HCC.

La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare causée par une déficience en glucose-6-phosphatase (G6Pase), due à des mutations de la sous-unité catalytique (G6PC). Cette enzyme confère au foie, aux reins et à l’intestin la capacité de produire du glucose. Les patients atteints de GSDIa sont donc incapables de produire du glucose et souffrent d’hypoglycémies sévères lors de jeûnes courts. De plus, la déficience en G6Pase provoque une accumulation de glucose-6 phosphate dans le foie et les reins, conduisant à l’accumulation de glycogène et de lipides. A long terme, la plupart des patients souffre d’une maladie chronique rénale (MCR), qui peut évoluer en insuffisance rénale, nécessitant une mise sous dialyse ou une transplantation rénale. Cette MCR se caractérise par une fibrose, ainsi que par le développement de kystes dans les stades tardifs. Au niveau du foie, les patients développent une hépatomégalie et une stéatose hépatique qui peut évoluer vers le développement d’adénomes ou carcinomes hépatocellulaires. Le but de mes travaux de thèse a été d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’établissement de la pathologie rénale et la formation des kystes, à l’aide de modèles murins invalidés pour le gène G6pc spécifiquement dans les reins (souris K.G6pc-/-). Alors que la GSDIa est une maladie caractérisée par l’accumulation hépatique et rénale de glycogène, nous avons d’abord montré que le développement de la fibrose, à l’origine de la perte de la fonction rénale, était induit par l’accumulation de lipides, indépendamment du contenu en glycogène. De plus, l’utilisation d’un agoniste de PPARα, le fénofibrate, en diminuant le contenu lipidique rénal, a ralenti l’installation de la fibrose et l’évolution de la MCR. Le mécanisme moléculaire impliqué est l’activation du système rénine angiotensine par les dérivés lipidiques, qui induit l’expression du facteur profibrotique TGFβ1. De même, le fénofibrate en limitant l’accumulation de lipides hépatiques a prévenu le développement d’atteintes hépatiques caractéristiques de la GSDI. Ainsi, l’activation du catabolisme des lipides par des agonistes de PPARα semble une stratégie thérapeutique intéressante pour réduire la progression des maladies rénales et hépatique de la GSDI. La deuxième partie de mes résultats suggèrent que le développement de kystes rénaux chez les patients atteints de la GSDI pourrait être causé par une altération du cil primaire, organelle jouant un rôle clé dans le maintien d’une structure et fonction normale des reins. En effet, une augmentation de la longueur du cil primaire a pu être observée dans les reins des souris K.G6pc-/- associée à une dérégulation de différentes protéines impliquées dans sa structure et sa fonction, par rapport aux souris contrôles. Nous avons également mis en évidence une reprogrammation métabolique de type Warburg, caractérisée par une activation accrue de la glycolyse aérobie, une inhibition de l’oxydation mitochondriale du pyruvate et une production de lipides. Ainsi, l’ensemble de ces perturbations va favoriser la prolifération cellulaire et le développement de kystes, et pourrait mener au développement de tumeur rénale comme observée chez une souris K.G6pc-/-. En conclusion nous avons démontré que, dans le cadre de la GSDI, l’accumulation de lipides dans les reins et le foie, secondaire à la déficience en G6Pase, joue un rôle clé dans le développement des complications hépatiques et rénales à long terme. Également, la reprogrammation métabolique rénale de type Warburg, prenant place dans le cadre de la GSDI, associée à un défaut du cil primaire pourrait être à l’origine de la formation des kystes et de tumeurs rénales. Ces études, en permettant une meilleure compréhension de la physiopathologie des complications à long terme de la GSDIa, offrent de nouvelles perspectives concernant les stratégies thérapeutiques à développer pour une meilleure prise en charge des patients atteints de GSDIa / Glycogen storage disease type Ia (GSDIa) is a rare metabolic disease caused by glucose-6-phosphatase (G6Pase) deficiency, due to mutations on the gene encoding G6Pase catalytic subunit (G6PC). This enzyme confers to the liver, kidneys and intestine the ability to produce glucose. Thus, patients with GSDIa are unable to ensure endogenous glucose production and suffer from severe hypoglycemia during fasting in the absence of nutritional control. In addition, G6Pase deficiency causes intracellular accumulation of glucose-6 phosphate in the liver and kidneys, leading to metabolic defects and the accumulation of glycogen and lipids. Over time, most adult patients suffer from chronic kidney disease (CKD), which can progress to kidney failure, requiring dialysis or kidney transplantation. This nephropathy is characterized in particular by tubulo-interstitial fibrosis and glomerulosclerosis, as well as by the development of cysts in the late stages. Moreover, patients develop hepatomegaly and hepatic steatosis that may progress to the development of hepatocellular adenomas or carcinomas. The aim of my thesis was to identify the molecular mechanisms involved in the establishment of renal pathology and cyst formation in GSDIa, by using mouse models where G6pc gene is specifically deleted in the kidneys (K.G6pc-/- mice). While GSDIa is a disease characterized by glycogen accumulation in the liver and kidneys, we first showed that the development of fibrosis, which causes progressive loss of kidney function, was induced by intracellular accumulation of lipids, regardless of glycogen content. The molecular mechanism probably involved is the activation of the renin angiotensin system by lipid derivatives such as diacylglycerol, which induced the expression of the profibrotic factor TGFβ1 and an epithelial-mesenchymal transition. In addition, the use of a PPARα agonist, i.e. fenofibrate, by decreasing renal lipid content, reduced the development of fibrosis and CKD evolution. Similarly, fenofibrate treatment prevented the accumulation of lipids in the liver and the development of liver damages that cause tumor development. Thus, the activation of lipid catabolism by PPARα agonists such as fenofibrate seems to be an interesting therapeutic strategy to reduce the progression of renal and hepatic diseases of GSDIa. The second part of my results suggest that the development of renal cysts in GSDI patients may be caused by an alteration of the primary cilia, a non-motile organelle that plays a key role in maintaining normal kidney structure and function. Indeed, defects in the primary cilia are involved in many polycystic kidney diseases. In summary, an increase in the length of the primary cilia was observed in the kidneys of K.G6pc-/- mice, which could be explained by a deregulation of the expression of different proteins involved in cilia structure and function, compared to control mice. We also demonstrated a metabolic reprogramming leading to a Warburg metabolism, characterized by the increased activation of aerobic glycolysis and the inhibition of mitochondrial pyruvate oxidation and lipid production in K.G6pc-/- mice. Thus, all these disorders would promote cell proliferation and cyst development, and could lead to the development of renal tumor, as recently observed in one K.G6pc-/- mouse (out of 36 studied mice). In conclusion, we have shown that, in GSDI, the accumulation of lipids in the kidneys and liver that occurs secondary to G6Pase deficiency plays a key role in the development of hepatic and renal long-term complications. In addition, the Warburg like metabolic reprogramming taking place in the GSDIa kidneys, associated with a defect in the primary cilia, could be at the origin of cysts formation and renal tumors. These new studies, by providing a better understanding of the pathophysiology of long-term complications of GSDIa, offer new perspectives on therapeutic strategies to be developed for better management of patients

La glycogénose de type I (GSDI) est une maladie génétique rare, due à une déficience en glucose-6 phosphatase (G6Pase), enzyme clé de la production endogène de glucose. En plus des hypoglycémies sévères, la perte de l'activité G6Pase conduit à l'accumulation de glycogène, mais aussi de lipides dans le foie et les reins. A long-terme, la plupart des patients développent des tumeurs hépatiques et une maladie rénale chronique (MRC).Le but de cette thèse a été de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la carcinogenèse hépatique et la MRC grâce à des modèles murins viables et uniques, avec une délétion de la G6Pase spécifiquement dans le foie ou les reins, reproduisant respectivement toutes les caractéristiques de la pathologie hépatique ou rénale.Au niveau du foie, notre étude a permis de mettre en évidence une reprogrammation métabolique « Warburg-like » très similaire à celle des cellules cancéreuses, associée à une perte des défenses cellulaires et des suppresseurs de tumeur. De plus, nous avons montré que les adénomes hépatocellulaires, se transformant ensuite en carcinomes, se développent en absence de fibrose, en accord avec l'absence d'activation des voies pro-fibrotiques. Au niveau des reins, l'étude de la MRC a mis en évidence le développement de kystes rénaux chez les souris atteintes de GSDI, observés aussi chez les patients à un stade avancé de la MRC. Finalement, une dernière étude portant sur l'activation de l'oxydation des lipides, par un traitement des souris au fénofibrate, a permis de suggérer le rôle délétère de l'accumulation des lipides dans le développement des pathologies hépatique et rénale / Glycogen storage disease type I (GSDI) is a rare genetic disease, due to a deficiency in glucose-6 phosphatase (G6Pase), a key enzyme in the endogenous glucose production. Besides severe hypoglycemia, the loss of G6Pase leads to the accumulation of glycogen and lipids in the liver and kidneys. On the long term, most patients develop hepatic tumors and chronic kidney disease (CKD).The goal of this thesis was to characterize the molecular mechanisms involved in hepatic carcinogenesis and CKD, thanks to viable and unique mouse models with specific deletion of G6Pase in the liver or kidneys, which exhibit all hallmarks of hepatic and renal pathologies, respectively.On a hepatic level, our study allowed us to highlight a « Warburg-like » metabolic reprogramming, very similar to what is observed in cancer cells, associated with a loss of cellular defenses and tumor suppressors. Furthermore, we showed that formation of hepatocellular adenoma, which transform later in carcinoma, occurs in the absence of liver fibrosis, due to the fact that pro-fibrotic pathways are not activated. In the kidneys, the study of CKD highlighted the development of renal cysts in mice with GSDI, as well as in the patients presenting an advanced stage of CKD. Finally, the last study on the activation of the oxidation of lipids, by treating the mice with fenofibrate, allowed us to suggest a deleterious role of lipid accumulation in the development of the hepatic and renal pathologies

La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie métabolique rare liée à une absence d’activité glucose‐6 phosphatase (G6Pase). La G6Pase est une enzyme clé de la production endogène de glucose (PEG) catalysant l’hydrolyse du G6P en glucose avant sa libération dans le sang. Cette fonction est restreinte au foie, aux reins et à l’intestin. La GSD1a est caractérisée par des hypoglycémies chroniques, une hépatomégalie associée à une stéatose hépatique et une néphromégalie. A plus longterme, la plupart des patients développent des adénomes. Un modèle murin de GSD 1a existe mais les souris ne survivent pas après le sevrage. Nous avons donc généré un modèle original de GSD1a, en invalidant le gène de la sous‐unité catalytique de la G6Pase spécifiquement dans le foie, grâce à une stratégie CRE‐LOX inductible (souris L‐G6pc‐/‐). Dans ce travail, nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont viables et reproduisent parfaitement la pathologie hépatique de la GSD1a, y compris le développement d’adénomes hépatiques après 9 mois d’invalidation. La viabilité des souris nous a permis de débuter des traitements par thérapie génique ciblant le foie à l’aide de vecteurs lentiviraux et AAV. La survie de ces souris, qui ne peuvent pas produire du glucose par le foie, repose la question du rôle relatif de la production hépatique de glucose dans la régulation de la glycémie Nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont capables de réguler leur glycémie, même au cours d’un jeûne prolongé. Ce maintien de l’homéostasie glucidique est due à une induction rapide de la néoglucogenèse rénale et intestinale, principalement par un mécanisme dépendant du glucagon / Glycogen storage disease type 1a (GSD1a) is a rare metabolic disorder due to an absence of glucose‐6 phosphatase (G6Pase) activity. G6Pase is the key enzyme of endogenous glucose production (EGP) and catalyzes the last step before the glucose release into the bloodstream. This function to produce glucose is restricted to the liver, the kidneys and the intestine. GSD1a is characterized by chronic hypoglycemia, hepatomegaly associated with hepatic steatosis and nephromegaly. The longterm complications of G6Pase deficiency include hepatocellular adenomas. The available animal model of GSD1a rarely survive over three months of age and the study of mechanisms of hepatocellular adenomas development cannot be investigated. So, we generated an original mouse model of GSD1a with a liver‐specific invalidation of catalytic subunit of G6Pase gene by an inducible CRE‐LOX strategy (L‐G6pc‐/‐ mice). In this work, we demonstrated that L‐G6pc‐/‐ were viable and totally reproduced the liver pathology of GSD1a, including the late development of hepatocellular adenomas. Then, we have begun liver gene therapy treatment using lentiviral and AAV vectors to correct the hepatic pathology. Finally, concerning glucose homeostasis, we have demonstrated that L‐G6pc‐/‐ were able to regulate blood glucose, during prolonged fast, even in the absence of hepatic glucose production. Rapidly, L‐G6pc‐/‐ mice were able to induce renal and intestinal gluconeogenesis thanks to a key role of glucagon and the development of a metabolic acidosis. These results provide evidence that the major role of the liver for EGP during fasting requires re‐examination

La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare causée par un déficit en glucose-6- phosphatase (G6Pase), menant à l'absence de production endogène de glucose. Cette pathologie est caractérisée par des hypoglycémies sévères, une hépatomégalie et une stéatose hépatique ainsi qu'une néphromégalie. En absence de traitement curatif, la prise en charge de cette maladie repose actuellement sur des mesures diététiques très strictes. Cependant, des complications apparaissent avec l'âge comme le développement de tumeurs hépatiques et la progression de la néphropathie vers l'insuffisance rénale. Afin d'étudier l'évolution de cette pathologie à long terme, nous avons utilisé des modèles murins originaux présentant une invalidation du gène de la sous-unité catalytique de la G6Pase spécifiquement au niveau du foie ou des reins. Dans ce travail, nous avons démontré que la déficience en G6Pase uniquement au niveau des reins est suffisante pour entrainer le développement de la pathologie rénale de la GSDIa. Les souris déficientes en G6Pase hépatique nous ont permis de mettre en évidence les effets délétères d'une consommation modérée de fructose ou de galactose et d'une alimentation riche en lipides, de type « cafétéria », sur la pathologie hépatique de la GSDIa, en particulier sur le développement tumoral. Nous avons également démontré chez ces souris l'efficacité et l'innocuité d'un traitement par thérapie génique ciblant le foie. Le transfert de gène avec un vecteur lentiviral, permettant l'intégration du transgène au génome, semble plus efficace qu'avec un vecteur AAV pour prévenir le développement de la pathologie hépatique de la GSDIa et l'apparition des tumeurs / Glycogen storage disease type Ia (GSDIa) is a rare metabolic disease caused by glucose-6-phosphatase (G6Pase) deficiency, leading to the absence of endogenous glucose production. This pathology is characterized by severe hypoglycemia, hepatomegaly, hepatic steatosis and nephromegaly. In the absence of a curative therapy, the current treatments available consist in strict dietary management. However, various complications occur with aging, such as hepatic tumor development and progressive chronic renal disease leading to renal failure. In order to study the long term pathology development, we used original mouse models, presenting an invalidation of the gene encoding the G6Pase catalytic subunit, specifically in the liver or in the kidneys. In this work, we demonstrated that renal G6Pase deficiency alone is sufficient to induce the development of the GSDIa nephropathy. Mice with liver-specific G6Pase deficiency allowed us to highlight the deleterious effects of high-fat diet, such as « fast-food » diet, as well as moderate consumption of fructose or galactose on the hepatic GSDIa pathology, particularly on tumor development. Furthermore, we demonstrated the efficiency and innocuity of gene therapies targeting the liver in these mice. Gene transfer with a lentiviral vector, allowing transgene integration into the genome, seems to be more efficient than an AAV vector in preventing the development of hepatic GSDIa pathology and tumor formation