Le diabète de type 2 se caractérise par une résistance à l’insuline dans les tissus périphériques, une déficience de sécrétion d’insuline et une augmentation de la production endogène de glucose. Notre but a été de démontrer le rôle spécifique de la production hépatique de glucose dans le développement du diabète. Nous avons développé un modèle de souris invalidées pour le gène codant pour la sous-unité catalytique de la G6Pase, enzyme clé de la production de glucose, spécifiquement dans le foie. Sous alimentation diabétogène, les souris transgéniques résistent au développement de l’hyperglycémie et l’hyperinsulinémie, et présentent une amélioration de la sensibilité à l’insuline et une augmentation du captage périphérique de glucose. Ces souris résistent également à l’obésité induite par ce régime déséquilibré, en liaison avec l’augmentation de la dépense énergétique, associée à l’induction des médiateurs de la thermogenèse dans les tissus adipeux brun et blanc, et au remodelage du muscle squelettique vers un phénotype oxydative. La délétion de la G6PC hépatique chez des souris rendues obèses et diabétiques résulte en une amélioration spectaculaire et rapide du métabolisme glucidique, et une stabilisation de la masse corporelle des souris obèses, associée à une induction des gènes du métabolisme oxydative dans les tissus périphériques.Ces effets bénéfiques pourraient être dus à l’augmentation de la sécrétion de facteurs hépatiques circulants connus pour réguler le métabolisme énergétique et glucidique dans les tissus périphériques. Ces travaux démontrent le rôle délétère de la production hépatique de glucose dans le développement du diabète et de l’obésité / Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance of glucose uptake by peripheral tissues, insulin secretion deficiency and increased endogenous glucose production. Our aim is to demonstrate the specific role of hepatic glucose production in triggering insulin resistance and diabetes. For that, we developed an inducible and liver-specific knock-out mouse model for the gene encoding the catalytic subunit of G6Pase, a key enzyme of glucose production. When fed a high fat/high sucrose diet, transgenic mice resisted to the development of fasting hyperglycemia and hyperinsulinemia, and even showed enhanced insulin sensitivity and glucose uptake in peripheral tissues. These mice are also resistant to diet induced obesity, due to the induction of basal metabolism, associated with increased brown and white adipose tissue thermogenesis machinery and remodeling of skeletal muscle towards a more oxidative phenotype. When liver G6pc deletion was realized in obese and diabetic mice, this resulted in a spectacular and early amelioration of glucose metabolism compared to that before liver G6pc deletion, and to stabilization of body mass of obese mice, which was associated with induction of oxidative genes in peripheral tissues. These beneficial effects could be explained by the secretion of hepatic circulating hormones known to control glucose and energy metabolism in peripheral tissues. This work underlines the deleterious role of hepatic glucose production in the development of obesity and diabetes, and sets the liver as a master-switch in the regulation of whole-body glucose and energy metabolism

G6Pase-alpha and G6Pase-beta share kinetic properties and active site structures, which lie on the luminal side of the endoplasmic reticulum (ER). For hydrolysis of G6P to glucose, G6Pase-alpha or G6Pase-beta must couple with an ubiquitously expressed ER-transmembrane protein, the G6P transporter (G6PT) that translocates G6P from the cytoplasm into the lumen of the ER. The primary role of the G6Pase/G6PT complex is therefore to provide endogenous glucose to the ER lumen. The essential role of the G6Pase-alpha/G6PT complex in glucose homeostasis has been well established, and the deficiencies in G6Pase-alpha and G6PT cause glycogen storage disease type Ia (GSD-Ia) and GSD-Ib, respectively. Both patients manifest the same metabolic phenotype of disturbed glucose homeostasis. While the metabolic abnormalities of GSD-Ia and GSD-Ib are almost identical, GSD-Ib patients exhibit neutropenia and myeloid dysfunctions which are not observed in GSD-Ia patients. Since G6Pase-beta and G6PT share an ubiquitous expression pattern, we hypothesized that the G6Pase-beta/G6PT complex might be functional in neutrophils and that the myeloid defects in GSD-Ib are due to the loss of activity of that complex. To test this hypothesis, we generated G6Pase-beta-deficient (G6pc3 --/--) mouse strains and showed that G6pc3--/-- mice manifest neutropenia; defects in neutrophil respiratory burst, chemotaxis, and calcium flux; and increased susceptibility to bacterial infection mimicking GSD-Ib patients. Consistent with this, G6pc3--/-- neutrophils exhibit enhanced ER stress and apoptosis. Taken together, the results demonstrate that endogenous glucose production in the ER via G6P translocation and metabolism are critical for normal neutrophil functions and that an ER stress-mediated neutrophil apoptosis is one mechanism underlying myeloid dysfunctions in the G6pc3--/-- mice. / Macrophages are the abundant leukocytes in the decidua throughout pregnancy and were thought to play a vital role in decidual homeostasis, placental development, and maintenance of a successful pregnancy. We hypothesized that endogenous glucose production in the ER might also be critical for normal macrophage function and G6pc3--/-- females manifesting neutropenia, neutrophil and macrophage dysfunctions might suffer from pregnancy-associated complications. Here we show that G6pc3--/-- macrophages exhibited impaired respiratory burst activity and repressed trafficking in vivo during an inflammatory response. The litter size and pregnancy frequency were markedly reduced in female G6pc3--/-- matings as compared to female G6pc3+/--/G6pc3+/+ matings, indicative of reduced fertility. The pregnancy-associated mortality risk was greatly increased in G6pc3--/--. Pathological analyses revealed that the sick or dying G6pc3--/-- mothers were emaciated and suffered from dental dysplasia and otitis media. Consistent with this, parental male and female G6pc3--/-- mice were more neutropenic than their age-matched virgin G6pc3 --/-- mice. Taken together, our results show that macrophage dysfunction, defective macrophage trafficking, neutrophil dysfunction, and enhanced neutropenia underlie the reduced fertility and increased mortality of G6pc3--/-- mothers. / Cheung, Yuk Yin. / Advisers: Janice Chou; Kam Bo Wong. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-03, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 92-107). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Lic.-avh. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 2 uppsatser.

La production endogène de glucose est une fonction cruciale au maintien de l’homéostasie glucidique dont les 2 dernières étapes sont la production de glucose par la glucose-6-phosphatase (G6Pase) et la sortie du glucose hors de la cellule par le transporteur facilité GLUT2. Les mécanismes dépendants de mouvements membranaires régulant ces deux étapes ont été étudiés. La régulation de la G6Pase par l’AMPc dépend de mouvements membranaires. Cependant les mécanismes moléculaires de cette régulation restaient à caractériser. Nous avons étudié l’hypothèse d’une phosphorylation directe des sous-unités de la G6Pase par la PKA. La PKA est capable d’induire l’activité G6Pase. Cependant, aucune phosphorylation des sous-unités G6Pase n’a pu être mise en évidence par phosphorylation in vitro, mutations dirigées de sites potentiels de phosphorylation ou analyse par spectrométrie de masse. En absence de Glut2, le glucose produit de novo sort des hépatocytes par une voie dépendante de mouvements membranaires, dont le mécanisme moléculaire n’est pas caractérisé. Cette voie vésiculaire n’est pas impliquée dans la sortie du glucose glycogénolytique. À l’inverse, 50% du glucose néoglucogénique sort des hépatocytes par une voie vésiculaire, probablement dépendante de la cavéoline-1. Par microscopie confocale à fluorescence, nous avons montré que la G6Pase se déplace dans la cellule vers la membrane plasmique et co-localise avec une partie de la cavéoline1 cellulaire. Les vésicules composées de cavéoline-1 et contenant la G6Pase pourrait donc constituer un lien entre le réticulum endoplasmique, lieu de production du glucose et la membrane plasmique, lieu de libération du glucose / Endogenous glucose production is a crucial function to maintain glucose homeostasis whose last two steps are glucose production by glucose-6-phosphatase (G6Pase) and glucose output by GLUT2. Regulations of both steps depend on membrane movements. In this work, we characterized the mechanisms of these regulations. Regulation of G6Pase by cAMP depends on membrane movements; however the molecular mechanisms of this regulation still have to be characterized. We hypothesized that PKA directly phosphorylated G6Pase subunits. We showed that PKA was able to enhance G6Pase activity. However, no phosphorylation of G6Pase subunits was evidenced by in vitro phosphorylation, directed mutagenesis of potentiel phosphorylation sites or mass spectrometry. In the absence of Glut2, the gluconeogenic glucose produced by hepatocytes is released through a pathway depending on membrane movements, which has not been characterised yet. This vesicular pathway was not involved in the output of glycogenolytic glucose. However, half of gluconeogenic glucose was released through a vesicular pathway, probably depending on caveolin-1. By confocal microscopy, we showed that G6Pase moved in cells and co-localized in part with cellular caveolin-1. Caveolin-1 vesicles containing G6Pase could thus constitute a link between the endoplasmic reticulum, site of glucose production, and the plasma membrane, site of glucose output

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La production hépatique de glucose dérive du glucose-6-phosphate (G6P) produit par la glycogénolyse et la néoglucogénèse et son hydrolyse subséquente par la glucose-6-phosphatase (G6Pase). C'est pourquoi la G6Pase joue un rôle crucial dans le maintien de la glycémie. La G6Pase est un système enzymatique à plusieurs composantes, situé dans le réticulum endoplasmique (RE) et est exprimé dans les deux organes néoglucogéniques, foie et rein, ainsi que dans l'intestin. Jusqu'à maintenant, deux composantes du système ont été clonées, l'unité catalytique qui est une protéine de 36 kDa (p36) et un transporteur putatif de G6P de masse moléculaire de 46 kDa (p46). Depuis le clonage du gène et de l' ADNc de p36, la régulation de l'expression de p36 a été étudiée en détail. Des effecteurs positifs qui augmentent l' ARNm de p36 comprennent le glucose, l' AMP cyclique, les glucocorticoïdes et les acides gras, tandis que l'insuline diminue l'abondance de l' ARNm de p36. Le glucose, l' AMP cyclique et les glucocorticoïdes ont également un effet positif sur l' ARN m de p46, tandis que l'insuline contrecarre ces effets. Deux modèles ont été proposés pour expliquer le mécanisme fonctionnel du système G6Pase : le modèle de transport du substrat et le modèle conformationnel. Le premier propose que la G6Pase est un système à plusieurs composantes, comprenant une unité catalytique dont le site actif est orienté vers la lumière du RE, un transporteur de G6P appelé Tl, un transporteur de phosphate inorganique (Pi) appelé T2 et un transporteur de glucose appelé T3. Tl serait l'étape limitante de la conversion de G6P en glucose et Pi. Il a été proposé que des mutations dans les gènes de ces quatres composantes causent des glycogènoses de type la, lb, le, and Id, respectivement. Le modèle conformationnel propose que la G6Pase est une protéine formant un canal dans la membrane du RE, où le site actif est enfoui dans une poche hydrophile. Le substrat a accès au site actif via le canal. Le processus hydrolytique a lieu dans la poche hydrophile et les produits sont délivrés dans la lumière et exportés dans le cytoplasme par l'intermédiaire du canal. Les cinétiques rapides d'hydrolyse du G6P indiquent une transition hystérétique dans le processus catalytique qui réduit la vitesse de la réaction au profit d'une spécifité accrue pour le G6P. Le phosphate inorganique (Pi) est une composante fondamentale de l'organisme par son implication dans de nombreuses fonctions physiologiques. L'homéostasie du Pi est règlée au niveau du rein par sa réabsorption par un co-transporteur de sodium et de phosphate (NaPi), essentiellement }'isoforme NaPi-2. Le contenu en Pi dans la diète, qui est important pour le maintien de la phosphatémie normale; affecte l'expression de la NaPi-2, de l'hormone parathyroïdienne, du Pi et du calcium sérique. L'hypophosphatémie liée au chromosome X est causée par une mutation dans le gène PHEX (pour : Phosphate-regulating gene with Homologies to Endopeptidase located on the X chromosome). Des travaux établissant que des perturbations dans l'homéostasie du phosphate pouvaient causer une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline suggèrent une association entre l'homéostasie du glucose et du phosphate. La nature même de cette association est néanmoins encore inconnue. Nous avons donc investigué le métabolisme du glucose hépatique lors d'une diète déficiente en phosphate ainsi que chez un modèle animal d'hypophosphatémie liée au chromosome X, la souris Hyp. Les résultats montrent que le phosphate plasmatique était diminué chez des rats nourris pendant 48h avec une diète déficiente en Pi (-Pi) comparés à une diète contrôle (+Pi). Dans le groupe (-Pi), l'activité de la G6Pase hépatique était augmentée lorsque mesurée dans des microsomes intacts ou perméabilisés au moyen de détergent, à des concentrations de substrat physiologiques ou saturantes. Cette activité accrue était due à une stimulation de l'expression de l'unité catalytique, comme en témoigne l'augmentation de l'abondance de l' ARN m et de l'immunoréactivité de p36. L' ARNm de p46 était également augmentée dans le groupe (-Pi), mais sans changement dans la quantité de protéine. Nos études subséquentes montrèrent que dans le foie des animaux du groupe (-Pi), la pyruvate kinase était inactivée et le phosphoenolpyruvate augmenté, et que le fiuctose-2,6- bisphosphate, un inhibiteur de la néoglucogénèse, était réduit de moitié. L'activité de la glucokinase n'était pas modifiée et celle de la phosphoenolpyruvate kinase était marginalement augmentée par la diète (-Pi), L'ensemble de ces résultats peuvent s'expliquer par l'augmentation de la concentration de l' AMP cyclique observée dans le foie des rats nourris avec la diète (-Pï). Ces résultats suggèrent que la néoglucogénèse hépatique pourrait être stimulée dans des conditions d'hypophosphatémie et qu'une production accrue de glucose pourrait contribuer à une altération du métabolisme du glucose. Cette possibilité est renforcée par l'observation que la glycémie des rats nourris avec la diète (-Pi) était nettement augmentée, tandis que la concentration de l'insuline plasmatique était diminuée. Un test de tolérance intravéneuse au glucose n'a pas permis d'observer de différence au niveau de la normalisation de la glycémie, mais a cependant indiqué une légère intolérance au glucose dans la mesure ou le pic de glucose atteint après le test était plus élevé dans le groupe (-Pi). Par ailleurs, la production endogène de glucose était nettement moins inhibée après un bolus de glucose au cours du test de tolérance intravéneuse au glucose. Afin d'élucider d'avantage la relation entre homéostasie du glucose et du :?i, le système G6Pase de foie et de rein furent examinés chez la souris Hyp. Les résultats montrent que l'activité de la G6Pase était augmentée dans ces organes des souris Hyp, semblablement à l'augmentation observée chez les rats nourris avec la diète (­Pi). Cette activité accrue de la G6Pase chez la souris Hyp s'explique par une plus grande quantité d' ARNm et de protéine p36, aussi bien dans le foie que dans le rein. Contrairement au modèle diététique d'hypophosphatémie, chez la souris Hyp l'abondance de l' ARNm et l'immunoréactivité du p46 hépatique et rénal sont nettement diminués. Globalement, l'hypophosphatémie résultant soit d'une carence alimentaire ou due à un défaut génétique a pour effet d'augmenter de façon consistante l'activité de la G6Pase, elle-même causée par une stimulation de l'expression de son unité catalytique, p36. L'expression de p46 est différemment règlée par la diète déficiente en Pi ou dans le modèle génétique, indicant que d'autres facteurs que l'hypophosphatémie affectent ce gène dans ces conditions. Il apparaît que la régulation de l'expression de p3 6 et de p46 est distincte. Bien que le système G6Pase a été étudié depuis vo1c1 cinquante ans, son organisation et son mécanisme fonctionnel restent à être définis. Les propriétés cinétiques de transport du substrat, le G6P, et des produits, le glucose et le Pï, ne sont pas encore élucidés. Ces propriétés ont été investiguées au moyen d'un appareil à collection et filtration rapide (FSRF A). Le transport microsomal du Pi montre des valeurs identiques de T v. à différentes concentrations de KH2P04. Le HgCh et des inhibiteurs potentiels de la G6Pase n'affectent pas les propriétés cinétiques du transport de Pi. On n'a également pas trouvé d'échange accéléré de Pi ou de saturation du transport de celui-ci. Ces résultats ne sont pas compatibles avec l'existence d'un transporteur spécifique pour le Pi dans la membrane du RE. Des conclusions similaires ont été tirées d'études du transport microsomal du glucose. L'accumulation intramicrosomale de radioactivité à partir de [U-14C]G6P ou de [32P]G6P correspond à des paramètres cinétiques différents, indicant que les substances accumulées dans les microsomes à partir de G6P sont les produits de la réaction de la G6Pase plutôt que le substrat. Cette observation suggère que l'étape de transport du G6P, si tant est qu'elle existe, n'est pas l'étape limitante au cours de la conversion du G6P en glucose et Pï, Les paramètres cinétiques d'accumulation de radioactivité à partir de [32P]G6P et les effets des inhibiteurs de la G6Pase démontrent que cette accumulation est étroitement couplée à l'activité hydrolytique de la G6Pase. De plus, nous n'avons pas observé d'échange de transport entre le G6P et le Pi ou le glucose, en accord avec l'absence présumée de transporteur spécifique pour le Pi ou le glucose. Globalement, ces données sont compatibles avec le modèle conformationnel de la G6Pase. Une nouvelle version de ce modèle, intégrant les résultats concernant le transport de Pï et de glucose, propose qu'un pore dans la membrane du RE puisse remplir la fonction d'influx/efllux des produits de la G6Pase. / Glucose-6-phosphatase (G6Pase), a multicomponent enzyme, plays a crucial role in glucose metabolism by hydrolyzing glucose-6-phosphate (G6P) into glucose and inorganic phosphate (Pi). G6Pase is located in the endoplasmic reticulum membrane and highly expressed in liver and kidneys. Two components of G6Pase have been cloned, the catalytic subunit (p36) and the putative G6P translocase (p46). Despite the great progress in G6Pase field, the hydrolytic mechanism of G6Pase is still in debate. Meanwhile, evidence also indicates that Pi deficiency is related to impaired glucose metabolism with an unclear mechanism. In this thesis, the effects of Pi deficiency on G6Pase and other glucoregulatory factors were investigated. Meanwhile, the hydrolytic mechanism of G6Pase was also studied in terms of its transport properties. Results showed that compared to the rats fed with a control diet ( +Pi), in the rats fed with a phosphate deficient diet (-Pi) for 48h, plasma phosphate concentration was decreased. Liver G6Pase was upregulated, gluconeogenesis key steps ;vere stimulated, liver glycogen content was decreased and plasma glucose concentration was increased in the fed (-Pi) group. These changes could be accounted for by increased liver cAMP content and decreased plasma insulin concentration in the fed (-Pi) group. During an intravenous glucose tolerance test, although similar glucose fall rates and insulin responses were observed in overnight fasted (+Pi) and (-Pi) group, a tendency to hyperglycemia and less suppressed endogenous glucose production were obtained in the (-Pi) group. Ali of these results demonstrated that under the phosphate deficient condition, G6Pase was upregulated and glucose production was enhanced. The enhanced glucose production, potentially caused by the altered insulin/glucagon ratio, may contribute to the impaired glucose metabolism. To further elucidate the relationship between glucose homeostasis and phosphate homeostasis, liver and kidney G6Pase system were investigated in X-linked hypophosphatemic mice, Hyp mice. Results showed G6Pase activity was increased in Hyp mouse liver and kidney. Consistently, the protein amount and mRNA abundance of the catalytic subunit, p36, were increased in Hyp mouse liver and kidney. In contrast, the mRNA abundance and protein amount of p46 were decreased in Hyp mouse liver and kidney. These results further dernonstrated that G6Pase activity was stimulated by Pi deficiency. The increased G6pase activity may enhance glucose production, probably contributing to impaired glucose metabolisrn. The hydrolytic mechanism of G6Pase was investigated via transport studies. Inorganic phosphate (KH2P04) transport across rnicrosornes showed identical T 112 values around 23 s at different KH2P04 concentrations, which were unaffected by potential inhibitors of G6Pase. Neither accelerated exchanging transport nor saturable effect was observed in this process. These results supported no specific inorganic phosphate transporter in the ER membrane. Similar phenomena were observed for the glucose transport process, which was characterized with T 112 values of 40 s. Tracer equilibration during [U-14C]- and [32P]G6P hydrolysis proceeded with T 112 values of 4 7 and 21 s, respectively. Steady state levels of tracer accumulation from [U-14C]­and [32P]G6P were also different frorn each other and had a similar ratio to that of their T 112 values. This result dernonstrated that the accumulated radiotracer was the product, Pi or glucose, rather than the substrate G6P. Effects of unlabelled G6P and inhibitors on [32P]G6P uptake dernonstrated that G6P uptake and hydrolysis were tightly coupled processes. Moreover, no exchanging transport between G6P and inorganic phosphate/glucose was observed. These results are not compatible with the substrate-transport rnodel of G6Pase. Based on these data, a new combined­conformational model is proposed to explain the G6Pase system. In this model, G6P transport/hydrolysis are tightly coupled processes whereas glucose and phosphate share with water and a variety of other organic and inorganic solutes a common pore­like structure accounting for their transport through the ER membrane. The p46 protein rnay be more like a G6P sensor than a G6P transporter. The binding of G6P to p46 may affect the conformation of p46 and p36 via their coupling interaction. The conformational change rnay account for the specificity and latency of G6Pase.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La glucose-6-phosphatase (G6Pase) catalyse l'hydrolyse du glucose-6- phosphate (G6P), qui est l'étape terminale aussi bien de la glycogénolyse que de la néoglucogénèse. La localisation dans la membrane du réticulum endoplasmique de la G6Pase est suggérée sur des bases biochimiques et génétiques et cette enzyme est constituée de plusieurs composantes. À ce jour, deux composantes du système G6Pase ont été clonées, une sous-unité catalytique de masse moléculaire 36 kDa (p36) et un transporteur putatif de G6P de 46 kDa (p46). Des études topologiques indiquent que p36 et p46 sont très hydrophobiques, avec 9 et 10 domaines transmembranaires, respectivement. Deux modèles différents ont été proposés pour décrire le système complexe de la G6Pase, nommés le modèle de transport du substrat et le modèle conformationnel. La distribution tissulaire de p36 est essentiellement dans les organes néoglucogéniques comme le foie, le cortex rénal et l'intestin grêle, tandis que l'expression de p46 est plus étendue, étant présente dans la majorité des tissus et dans plusieurs lignées cellulaires. La glycogènose de type I (GSD-I) est une maladie autosomale récessive causée par une déficience en G6Pase, caractérisée par une hypoglycémie sévère et une accumulation excessive de glycogène hépatique. Des mutations dans le gène de p36 sont trouvées essentiellement chez les patients GSD-Ia, tandis que des mutations dans le gène de p46 expliquent la majorité des cas de GSD-Ib, le et Id, nouvellement qualifiés de "non a". Puisqu'une augmentation dans l'activité de la G6Pase est associée avec les deux types de diabète sucré et peut donc contribuer à l'augmentation de la production hépatique de glucose dans cette condition, p36 et p46 peuvent être considérés comme des gènes-candidats pour le diabète. La surexpression de p36 dans des hépatocytes et in vivo au moyen d'un adenovirus résulte en une augmentation de la néoglucogénèse et en une diminution du flux glycolytique et de la synthèse de glycogène, tandis que la surexpression de p36 dans les cellules d'insulinome INS-1 invalide la sécrétion d'insuline induite par le glucose. Il est connu que l'activité de la G6Pase est augmentée dans le foie de rats à jeun ou diabétiques. Le clonage des gènes de la G6Pase (qui incluent maintenant les gènes de p36 et p46) et la disponibilité de sondes d' ADNc ont permis d'examiner si les changements d'activité de la G6Pase dans ces conditions était dûe à des altérations dans l'expression de ces gènes ou était la conséquence de modifications post-traductionnelles de l'enzyme. Il a été rapporté que dans les cellules FAO, le niveau d'ARNm de p36 était augmenté par I' AMP cylique et les glucocorticoïdes, tandis que l'insuline avait un effet dominant négatif de suppression de ce gène. Dans ces mêmes cellules, des concentrations élevées de glucose (25 mM) étaient associées avec une quantité accrue d' ARNm de p36 et cette observation fut ultérieurement confirmé dans des hépatocytes en culture primaire et in vivo. L'expression du gène de p36 est donc règlé par des facteurs nutritionels et hormonaux. La régulation du gène de p46 nouvellement cloné, qui joue un rôle essentiel dans la G6Pase, n'a pas encore été exploré. Dans notre travail nous avons caractérisé l'expression de p46 en parallèle avec p36, dans le diabète expérimental, la déficience alimentaire en Pi, divers traitements hormonaux et différentes concentrations de glucose. Chez les rats rendus diabétiques par traitement à la streptozocine, nous avons trouvé une activité élevée de la G6Pase associée avec une augmentation de l'abondance de l 'ARNm de p46 et une augmentation similaire de la protéine p46 dans le foie, le rein et l'intestin, outre la stimulation de l'expression du gène de p36 documenté auparavent. Chez les rats nourris avec une diète déficiente en Pi, les niveaux relatifs d' ARNm de p36 et de p46 étaient augmentés ensemble dans le foie de concert avec une activité accrue de la G6Pase. Nous avons de plus étudié la régulation gènique de p36 et p46 dans les cellules HepG2, dont les concentrations de nutriments et d'hormones peuvent être aisément manipulés dans le milieu de culture. Nous avons trouvé que le glucose causait une augmentation dose­dépendante dans l'expression des gènes de p36 aussi bien que de p46 au niveau de l 'ARNm et des protéines. Cependant, des études dose-réponse de différentes hormones et agents affectant l'expression des gènes de p36 et p46 ont révélé des sensibilités différentes de ces deux composantes du système G6Pase. Nous montrons dans les cellules HepG2 qu'alors que l'insuline, à des concentrations physiologiques (0.01-10 nM), supprimait l 'ARNm de p36, celle de p46 n'était affectée que de 20-30% et réduite au plus à 50% avec 1 µM d'insuline. De plus, l'AMP cyclique, le glucagon, ainsi que la thapsigargine (un inhibiteur de la Ca2+-ATPase du RE) augmentaient l'ARNm de p36 aux concentrations 10-100 nM, sans affecter la transcription du gène de p46. Par contre, la dexamethasone (0.1-100 nM) augmentait similairement l'ARNm de p36 et de p46. Afin de caractériser ultérieurement l'impact métabolique d'une expression accrue de p46 et de comprendre la fonction de la protéine p46, nous avons surexprimé celle-ci au moyen d'un adenovirus recombinant dans des hépatocytes de rat en culture primaire. Les résultats montrent que la surexpression de p46 a pour conséquence d'induire l' ARNm de p36 et l'activité de la G6Pase. On observait également une diminution de la synthèse du glycogène et du flux glycolytique ainsi qu'une augmentation de la dégradation du glycogène. Puisque des mutations de p46 ont été trouvées chez des patients GSD-1 non a, qui ont par rapport aux patients GSD-1 a des symptômes additionnels comme une neutropénie et une dysfonction des neutrophiles et des monocytes, nous avons formulé l'hypothèse que p46 pourrait avoir d'autres fonctions que celle de contrôler p36, qui est absent des leucocytes. De plus, nous avons d'abord découvert dans une librairie d' ADNc de leucocytes humains et avons ensuite confirmé dans des échantillons sanguins la présence de quatre transcrits différents du gène de p46, dont trois ne sont pas présent dans le foie. Cette découverte supporte la possibilité que d'autres produits du gène de p46, possédant des fonctions distinctes, puissent être formés par épissage alternatif. En conclusion, nos résultats indiquent: (1) que dans le diabète insulinoprive, l'hyperglycémie, la déficience en insuline et l'augmentation de l 'AMP cyclique due à des hormones contrerégulatrices non opposées peuvent contribuer de façon indépendante l'un de l'autre à une expression accrue des gènes de p36 et p46. La surexpression de p46 avec un adenovirus recombinant résulte en des changements métaboliques semblables à ceux d'une surexpression de p36, indicant que des dérégulations aussi bien de p36 que de p46 peuvent être impliquées dans l'activité accrue de la G6Pase, menant à une production hépatique de glucose plus forte qui peut exacerber l'hyperglycemie du diabète; (2) que la régulation hormonale distincte de p36 et p46 indique que celles qui affectent seulement p36 coïncide avec des modifications connues de la production hépatique de glucose, tandis que celles qui affectent p36 et p46 sont consistantes avec une stimulation de la synthèse de glycogène; (3) que p46 pourrait être une protéine multifonctionnelle avec des propriétés tissulaires spécifiques. Dans les tissus où p36 est présent, comme dans le foie, p46 pourrait founir le G6P nécessaire à son hydrolyse par p36. Dans d'autres tissus, qui ne possèdent pas p36, p46 a probablement d'autres fonctions qui sont déficientes dans les leucocytes des patients GSD-lb. / Glucose-6-phosphatase (G6Pase) plays an important role in glucose metabolism by catalyzing the terminal step of both glycogenolysis and gluconeogenesis. Although G6Pase is proposed to be a multifunctional and multicomponent system residing in the membrane of endoplasmic reticulum, until now neither the structure of its components nor the function of each protein has been totally understood. So far two components of the G6Pase system have been cloned, including the G6Pase catalytic subunit (p36) and the putative glucose-6-phosphate translocase (p46). Genetie deficiency of G6Pase leads to glycogen storage disease type-1 (GSD-1), while mutations in p36 and p46 genes account for GSD-Ia and most of GSD-1 non a respectively. Furthermore, diabetes mellitus is associated with increased G6Pase activity, which may contribute to the enhanced hepatic glucose production. Previous studies have shown that p36 gene express10n 1s under nutritional and hormonal regulation. In this work, the gene regulation of newly cloned p46 was investigated and compared with that of p36 gene. We found that under the conditions like increased glucose concentration, dietary phosphate deprivation or streptozotocin-induced diabetes, p36 and p46 genes were similarly up-regulated. However, the sensitivities of these two genes to different hormones or reagents were found to be quite different as shown in HepG2 hepatoma cells. Insulin has dominant negative effects on bath p36 and p46 gene expression, but compared to p36, p46 gene has a much .lower sensitivity to insulin. Glucagon, cAMP and thapsigargin significantly increase p36 gene transcription but barely affect p46 gene, while glucocorticoids remarkably and sensitively induce bath genes. Based on the distinct hormonal regulation of p36 and p46 gene expression, their possible roles in glucose metabolism were proposed. We explored in two ways to study the yet unclear p46 function: (1) On the one hand, in order to study the p46 function in hepatic G6Pase system, we perfonned p46 overexpression in hepatocytes via recombinant adenovirus mediated gene transfer, which resulted in induced p36 transcription and increased G6Pase activity. In addition, overexpression of p46 led to significant metabolic impacts in primary hepatocytes, including decreased glycogen synthesis, increased glycogen degradation and decreased glycolysis; (2) On the other hand, we studied p46 gene transcription in leucocytes, where p36 is absent, and identified four different p46 transcripts, three of which are not present in liver. We hypothesize that mutated p46 gene might be responsible for neutropenia and neutrophil dysfunctions seen in GSD-Ib and le; p46 may bear other functions in leucocytes by differential mRNA splicing. In conclusion, we characterized the gene regulation of newly cloned p46 gene, investigated effects of adenovirus mediated overexpression of p46 on glucose and glycogen metabolisms and discovered different transcripts of p46 gene in leucocytes. Key works: glucose-6-phosphatase catalytic subunit; putative glucose-6- phosphate translocase; glucose; phosphate; hormones; gene regulation; overexpress10n.

La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie métabolique rare liée à une absence d’activité glucose‐6 phosphatase (G6Pase). La G6Pase est une enzyme clé de la production endogène de glucose (PEG) catalysant l’hydrolyse du G6P en glucose avant sa libération dans le sang. Cette fonction est restreinte au foie, aux reins et à l’intestin. La GSD1a est caractérisée par des hypoglycémies chroniques, une hépatomégalie associée à une stéatose hépatique et une néphromégalie. A plus longterme, la plupart des patients développent des adénomes. Un modèle murin de GSD 1a existe mais les souris ne survivent pas après le sevrage. Nous avons donc généré un modèle original de GSD1a, en invalidant le gène de la sous‐unité catalytique de la G6Pase spécifiquement dans le foie, grâce à une stratégie CRE‐LOX inductible (souris L‐G6pc‐/‐). Dans ce travail, nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont viables et reproduisent parfaitement la pathologie hépatique de la GSD1a, y compris le développement d’adénomes hépatiques après 9 mois d’invalidation. La viabilité des souris nous a permis de débuter des traitements par thérapie génique ciblant le foie à l’aide de vecteurs lentiviraux et AAV. La survie de ces souris, qui ne peuvent pas produire du glucose par le foie, repose la question du rôle relatif de la production hépatique de glucose dans la régulation de la glycémie Nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont capables de réguler leur glycémie, même au cours d’un jeûne prolongé. Ce maintien de l’homéostasie glucidique est due à une induction rapide de la néoglucogenèse rénale et intestinale, principalement par un mécanisme dépendant du glucagon / Glycogen storage disease type 1a (GSD1a) is a rare metabolic disorder due to an absence of glucose‐6 phosphatase (G6Pase) activity. G6Pase is the key enzyme of endogenous glucose production (EGP) and catalyzes the last step before the glucose release into the bloodstream. This function to produce glucose is restricted to the liver, the kidneys and the intestine. GSD1a is characterized by chronic hypoglycemia, hepatomegaly associated with hepatic steatosis and nephromegaly. The longterm complications of G6Pase deficiency include hepatocellular adenomas. The available animal model of GSD1a rarely survive over three months of age and the study of mechanisms of hepatocellular adenomas development cannot be investigated. So, we generated an original mouse model of GSD1a with a liver‐specific invalidation of catalytic subunit of G6Pase gene by an inducible CRE‐LOX strategy (L‐G6pc‐/‐ mice). In this work, we demonstrated that L‐G6pc‐/‐ were viable and totally reproduced the liver pathology of GSD1a, including the late development of hepatocellular adenomas. Then, we have begun liver gene therapy treatment using lentiviral and AAV vectors to correct the hepatic pathology. Finally, concerning glucose homeostasis, we have demonstrated that L‐G6pc‐/‐ were able to regulate blood glucose, during prolonged fast, even in the absence of hepatic glucose production. Rapidly, L‐G6pc‐/‐ mice were able to induce renal and intestinal gluconeogenesis thanks to a key role of glucagon and the development of a metabolic acidosis. These results provide evidence that the major role of the liver for EGP during fasting requires re‐examination

La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie métabolique rare liée à une absence d'activité glucose‐6 phosphatase (G6Pase). La G6Pase est une enzyme clé de la production endogène de glucose (PEG) catalysant l'hydrolyse du G6P en glucose avant sa libération dans le sang. Cette fonction est restreinte au foie, aux reins et à l'intestin. La GSD1a est caractérisée par des hypoglycémies chroniques, une hépatomégalie associée à une stéatose hépatique et une néphromégalie. A plus longterme, la plupart des patients développent des adénomes. Un modèle murin de GSD 1a existe mais les souris ne survivent pas après le sevrage. Nous avons donc généré un modèle original de GSD1a, en invalidant le gène de la sous‐unité catalytique de la G6Pase spécifiquement dans le foie, grâce à une stratégie CRE‐LOX inductible (souris L‐G6pc‐/‐). Dans ce travail, nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont viables et reproduisent parfaitement la pathologie hépatique de la GSD1a, y compris le développement d'adénomes hépatiques après 9 mois d'invalidation. La viabilité des souris nous a permis de débuter des traitements par thérapie génique ciblant le foie à l'aide de vecteurs lentiviraux et AAV. La survie de ces souris, qui ne peuvent pas produire du glucose par le foie, repose la question du rôle relatif de la production hépatique de glucose dans la régulation de la glycémie Nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont capables de réguler leur glycémie, même au cours d'un jeûne prolongé. Ce maintien de l'homéostasie glucidique est due à une induction rapide de la néoglucogenèse rénale et intestinale, principalement par un mécanisme dépendant du glucagon

Over the past decade, there has been unprecedented increase in the number of genetic loci associating with type 2 diabetes (T2D) risk and related glycemic traits, thanks to advances in sequencing technologies and access to large sample sizes. Identification of associated genetic variants across the frequency spectrum can provide valuable insight into disease pathophysiology. However, the translation into biological insights has been slow often due to uncertainties over the underlying effector transcripts. G6PC2/ABCB11 is one locus characterised by common non-coding variants that are strongly associated with fasting plasma glucose (FG) levels in healthy adults. The work presented in this thesis aims to understand how protein-coding variants in glycemic trait loci such as G6PC2 contribute to the variability of glycemic traits and in addition gain further insight into the physiological role of G6PC2. To evaluate the role of coding variants in glycemic trait variation, an exome array genotyping study of non-diabetic European individuals (n=33,407) reported multiple coding variants in G6PC2 that were independently associated with FG. I designed and conducted in vitro assays to functionally assess these variants and showed that they result in loss of function (LOF) due to reduced protein stability. This established G6PC2 as the effector transcript influencing FG and highlighted a critical role for G6PC2 (encoding the islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit) in glucose homeostasis. To investigate the role of low frequency (MAF=1-5%) and rare (MAF<1%) coding variants in influencing glycemic traits, recent large-scale exome array meta-analyses and whole exome sequencing were carried out as part of MAGIC (n=144,060) and the T2D-GENES/GoT2D consortia (n=12,940) respectively. G6PC1, a gene homolog of G6PC2 that primarily acts through the liver, was uncovered as a novel glycemic locus. My functional follow-up studies demonstrated that rare coding variants in G6PC1 exhibited LOF to influence both FG and FI levels. As rare variation in G6PC2 not previously identified could also affect G6PC2 function and modulate glycemic traits, I also functionally characterised a suite of rare non-synonymous G6PC2 variants. Most of the variants tested exhibited markedly reduced protein levels and/or loss of glycosylation. Several variants were also found to impact on enzymatic activity through inactivating or activating mechanisms to influence FG levels. Finally, to gain better understanding of the function of G6PC2 I performed gene knockdown studies in the EndoC-βH1 human beta cell model followed by insulin secretion analyses. G6PC2 knockdown resulted in increased insulin secretion at sub-threshold glucose stimulation levels, consistent with studies in knockout mouse models. In addition, expression of LOF G6PC2 variants were found to upregulate ER stress responses. These results warrant further studies of the precise roles that G6PC2, an ER-resident protein, plays in regulating insulin secretory function and ER homeostasis in the beta cell. Overall, my work described multiple rare coding variants in both G6PC1 and G6PC2 that alter protein function to regulate glucose metabolism through diverse mechanisms in different tissues. Improved understanding of these effector transcripts will open up opportunities for the exploration of new therapeutic targets for glucose regulation and T2D.