Le diabète de type 2 se caractérise par une résistance à l’insuline dans les tissus périphériques, une déficience de sécrétion d’insuline et une augmentation de la production endogène de glucose. Notre but a été de démontrer le rôle spécifique de la production hépatique de glucose dans le développement du diabète. Nous avons développé un modèle de souris invalidées pour le gène codant pour la sous-unité catalytique de la G6Pase, enzyme clé de la production de glucose, spécifiquement dans le foie. Sous alimentation diabétogène, les souris transgéniques résistent au développement de l’hyperglycémie et l’hyperinsulinémie, et présentent une amélioration de la sensibilité à l’insuline et une augmentation du captage périphérique de glucose. Ces souris résistent également à l’obésité induite par ce régime déséquilibré, en liaison avec l’augmentation de la dépense énergétique, associée à l’induction des médiateurs de la thermogenèse dans les tissus adipeux brun et blanc, et au remodelage du muscle squelettique vers un phénotype oxydative. La délétion de la G6PC hépatique chez des souris rendues obèses et diabétiques résulte en une amélioration spectaculaire et rapide du métabolisme glucidique, et une stabilisation de la masse corporelle des souris obèses, associée à une induction des gènes du métabolisme oxydative dans les tissus périphériques.Ces effets bénéfiques pourraient être dus à l’augmentation de la sécrétion de facteurs hépatiques circulants connus pour réguler le métabolisme énergétique et glucidique dans les tissus périphériques. Ces travaux démontrent le rôle délétère de la production hépatique de glucose dans le développement du diabète et de l’obésité / Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance of glucose uptake by peripheral tissues, insulin secretion deficiency and increased endogenous glucose production. Our aim is to demonstrate the specific role of hepatic glucose production in triggering insulin resistance and diabetes. For that, we developed an inducible and liver-specific knock-out mouse model for the gene encoding the catalytic subunit of G6Pase, a key enzyme of glucose production. When fed a high fat/high sucrose diet, transgenic mice resisted to the development of fasting hyperglycemia and hyperinsulinemia, and even showed enhanced insulin sensitivity and glucose uptake in peripheral tissues. These mice are also resistant to diet induced obesity, due to the induction of basal metabolism, associated with increased brown and white adipose tissue thermogenesis machinery and remodeling of skeletal muscle towards a more oxidative phenotype. When liver G6pc deletion was realized in obese and diabetic mice, this resulted in a spectacular and early amelioration of glucose metabolism compared to that before liver G6pc deletion, and to stabilization of body mass of obese mice, which was associated with induction of oxidative genes in peripheral tissues. These beneficial effects could be explained by the secretion of hepatic circulating hormones known to control glucose and energy metabolism in peripheral tissues. This work underlines the deleterious role of hepatic glucose production in the development of obesity and diabetes, and sets the liver as a master-switch in the regulation of whole-body glucose and energy metabolism

G6Pase-alpha and G6Pase-beta share kinetic properties and active site structures, which lie on the luminal side of the endoplasmic reticulum (ER). For hydrolysis of G6P to glucose, G6Pase-alpha or G6Pase-beta must couple with an ubiquitously expressed ER-transmembrane protein, the G6P transporter (G6PT) that translocates G6P from the cytoplasm into the lumen of the ER. The primary role of the G6Pase/G6PT complex is therefore to provide endogenous glucose to the ER lumen. The essential role of the G6Pase-alpha/G6PT complex in glucose homeostasis has been well established, and the deficiencies in G6Pase-alpha and G6PT cause glycogen storage disease type Ia (GSD-Ia) and GSD-Ib, respectively. Both patients manifest the same metabolic phenotype of disturbed glucose homeostasis. While the metabolic abnormalities of GSD-Ia and GSD-Ib are almost identical, GSD-Ib patients exhibit neutropenia and myeloid dysfunctions which are not observed in GSD-Ia patients. Since G6Pase-beta and G6PT share an ubiquitous expression pattern, we hypothesized that the G6Pase-beta/G6PT complex might be functional in neutrophils and that the myeloid defects in GSD-Ib are due to the loss of activity of that complex. To test this hypothesis, we generated G6Pase-beta-deficient (G6pc3 --/--) mouse strains and showed that G6pc3--/-- mice manifest neutropenia; defects in neutrophil respiratory burst, chemotaxis, and calcium flux; and increased susceptibility to bacterial infection mimicking GSD-Ib patients. Consistent with this, G6pc3--/-- neutrophils exhibit enhanced ER stress and apoptosis. Taken together, the results demonstrate that endogenous glucose production in the ER via G6P translocation and metabolism are critical for normal neutrophil functions and that an ER stress-mediated neutrophil apoptosis is one mechanism underlying myeloid dysfunctions in the G6pc3--/-- mice. / Macrophages are the abundant leukocytes in the decidua throughout pregnancy and were thought to play a vital role in decidual homeostasis, placental development, and maintenance of a successful pregnancy. We hypothesized that endogenous glucose production in the ER might also be critical for normal macrophage function and G6pc3--/-- females manifesting neutropenia, neutrophil and macrophage dysfunctions might suffer from pregnancy-associated complications. Here we show that G6pc3--/-- macrophages exhibited impaired respiratory burst activity and repressed trafficking in vivo during an inflammatory response. The litter size and pregnancy frequency were markedly reduced in female G6pc3--/-- matings as compared to female G6pc3+/--/G6pc3+/+ matings, indicative of reduced fertility. The pregnancy-associated mortality risk was greatly increased in G6pc3--/--. Pathological analyses revealed that the sick or dying G6pc3--/-- mothers were emaciated and suffered from dental dysplasia and otitis media. Consistent with this, parental male and female G6pc3--/-- mice were more neutropenic than their age-matched virgin G6pc3 --/-- mice. Taken together, our results show that macrophage dysfunction, defective macrophage trafficking, neutrophil dysfunction, and enhanced neutropenia underlie the reduced fertility and increased mortality of G6pc3--/-- mothers. / Cheung, Yuk Yin. / Advisers: Janice Chou; Kam Bo Wong. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-03, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 92-107). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Lic.-avh. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 2 uppsatser.

La production endogène de glucose est une fonction cruciale au maintien de l’homéostasie glucidique dont les 2 dernières étapes sont la production de glucose par la glucose-6-phosphatase (G6Pase) et la sortie du glucose hors de la cellule par le transporteur facilité GLUT2. Les mécanismes dépendants de mouvements membranaires régulant ces deux étapes ont été étudiés. La régulation de la G6Pase par l’AMPc dépend de mouvements membranaires. Cependant les mécanismes moléculaires de cette régulation restaient à caractériser. Nous avons étudié l’hypothèse d’une phosphorylation directe des sous-unités de la G6Pase par la PKA. La PKA est capable d’induire l’activité G6Pase. Cependant, aucune phosphorylation des sous-unités G6Pase n’a pu être mise en évidence par phosphorylation in vitro, mutations dirigées de sites potentiels de phosphorylation ou analyse par spectrométrie de masse. En absence de Glut2, le glucose produit de novo sort des hépatocytes par une voie dépendante de mouvements membranaires, dont le mécanisme moléculaire n’est pas caractérisé. Cette voie vésiculaire n’est pas impliquée dans la sortie du glucose glycogénolytique. À l’inverse, 50% du glucose néoglucogénique sort des hépatocytes par une voie vésiculaire, probablement dépendante de la cavéoline-1. Par microscopie confocale à fluorescence, nous avons montré que la G6Pase se déplace dans la cellule vers la membrane plasmique et co-localise avec une partie de la cavéoline1 cellulaire. Les vésicules composées de cavéoline-1 et contenant la G6Pase pourrait donc constituer un lien entre le réticulum endoplasmique, lieu de production du glucose et la membrane plasmique, lieu de libération du glucose / Endogenous glucose production is a crucial function to maintain glucose homeostasis whose last two steps are glucose production by glucose-6-phosphatase (G6Pase) and glucose output by GLUT2. Regulations of both steps depend on membrane movements. In this work, we characterized the mechanisms of these regulations. Regulation of G6Pase by cAMP depends on membrane movements; however the molecular mechanisms of this regulation still have to be characterized. We hypothesized that PKA directly phosphorylated G6Pase subunits. We showed that PKA was able to enhance G6Pase activity. However, no phosphorylation of G6Pase subunits was evidenced by in vitro phosphorylation, directed mutagenesis of potentiel phosphorylation sites or mass spectrometry. In the absence of Glut2, the gluconeogenic glucose produced by hepatocytes is released through a pathway depending on membrane movements, which has not been characterised yet. This vesicular pathway was not involved in the output of glycogenolytic glucose. However, half of gluconeogenic glucose was released through a vesicular pathway, probably depending on caveolin-1. By confocal microscopy, we showed that G6Pase moved in cells and co-localized in part with cellular caveolin-1. Caveolin-1 vesicles containing G6Pase could thus constitute a link between the endoplasmic reticulum, site of glucose production, and the plasma membrane, site of glucose output

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La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie métabolique rare liée à une absence d’activité glucose‐6 phosphatase (G6Pase). La G6Pase est une enzyme clé de la production endogène de glucose (PEG) catalysant l’hydrolyse du G6P en glucose avant sa libération dans le sang. Cette fonction est restreinte au foie, aux reins et à l’intestin. La GSD1a est caractérisée par des hypoglycémies chroniques, une hépatomégalie associée à une stéatose hépatique et une néphromégalie. A plus longterme, la plupart des patients développent des adénomes. Un modèle murin de GSD 1a existe mais les souris ne survivent pas après le sevrage. Nous avons donc généré un modèle original de GSD1a, en invalidant le gène de la sous‐unité catalytique de la G6Pase spécifiquement dans le foie, grâce à une stratégie CRE‐LOX inductible (souris L‐G6pc‐/‐). Dans ce travail, nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont viables et reproduisent parfaitement la pathologie hépatique de la GSD1a, y compris le développement d’adénomes hépatiques après 9 mois d’invalidation. La viabilité des souris nous a permis de débuter des traitements par thérapie génique ciblant le foie à l’aide de vecteurs lentiviraux et AAV. La survie de ces souris, qui ne peuvent pas produire du glucose par le foie, repose la question du rôle relatif de la production hépatique de glucose dans la régulation de la glycémie Nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont capables de réguler leur glycémie, même au cours d’un jeûne prolongé. Ce maintien de l’homéostasie glucidique est due à une induction rapide de la néoglucogenèse rénale et intestinale, principalement par un mécanisme dépendant du glucagon / Glycogen storage disease type 1a (GSD1a) is a rare metabolic disorder due to an absence of glucose‐6 phosphatase (G6Pase) activity. G6Pase is the key enzyme of endogenous glucose production (EGP) and catalyzes the last step before the glucose release into the bloodstream. This function to produce glucose is restricted to the liver, the kidneys and the intestine. GSD1a is characterized by chronic hypoglycemia, hepatomegaly associated with hepatic steatosis and nephromegaly. The longterm complications of G6Pase deficiency include hepatocellular adenomas. The available animal model of GSD1a rarely survive over three months of age and the study of mechanisms of hepatocellular adenomas development cannot be investigated. So, we generated an original mouse model of GSD1a with a liver‐specific invalidation of catalytic subunit of G6Pase gene by an inducible CRE‐LOX strategy (L‐G6pc‐/‐ mice). In this work, we demonstrated that L‐G6pc‐/‐ were viable and totally reproduced the liver pathology of GSD1a, including the late development of hepatocellular adenomas. Then, we have begun liver gene therapy treatment using lentiviral and AAV vectors to correct the hepatic pathology. Finally, concerning glucose homeostasis, we have demonstrated that L‐G6pc‐/‐ were able to regulate blood glucose, during prolonged fast, even in the absence of hepatic glucose production. Rapidly, L‐G6pc‐/‐ mice were able to induce renal and intestinal gluconeogenesis thanks to a key role of glucagon and the development of a metabolic acidosis. These results provide evidence that the major role of the liver for EGP during fasting requires re‐examination

La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie métabolique rare liée à une absence d'activité glucose‐6 phosphatase (G6Pase). La G6Pase est une enzyme clé de la production endogène de glucose (PEG) catalysant l'hydrolyse du G6P en glucose avant sa libération dans le sang. Cette fonction est restreinte au foie, aux reins et à l'intestin. La GSD1a est caractérisée par des hypoglycémies chroniques, une hépatomégalie associée à une stéatose hépatique et une néphromégalie. A plus longterme, la plupart des patients développent des adénomes. Un modèle murin de GSD 1a existe mais les souris ne survivent pas après le sevrage. Nous avons donc généré un modèle original de GSD1a, en invalidant le gène de la sous‐unité catalytique de la G6Pase spécifiquement dans le foie, grâce à une stratégie CRE‐LOX inductible (souris L‐G6pc‐/‐). Dans ce travail, nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont viables et reproduisent parfaitement la pathologie hépatique de la GSD1a, y compris le développement d'adénomes hépatiques après 9 mois d'invalidation. La viabilité des souris nous a permis de débuter des traitements par thérapie génique ciblant le foie à l'aide de vecteurs lentiviraux et AAV. La survie de ces souris, qui ne peuvent pas produire du glucose par le foie, repose la question du rôle relatif de la production hépatique de glucose dans la régulation de la glycémie Nous avons montré que les souris L‐G6pc‐/‐ sont capables de réguler leur glycémie, même au cours d'un jeûne prolongé. Ce maintien de l'homéostasie glucidique est due à une induction rapide de la néoglucogenèse rénale et intestinale, principalement par un mécanisme dépendant du glucagon

Over the past decade, there has been unprecedented increase in the number of genetic loci associating with type 2 diabetes (T2D) risk and related glycemic traits, thanks to advances in sequencing technologies and access to large sample sizes. Identification of associated genetic variants across the frequency spectrum can provide valuable insight into disease pathophysiology. However, the translation into biological insights has been slow often due to uncertainties over the underlying effector transcripts. G6PC2/ABCB11 is one locus characterised by common non-coding variants that are strongly associated with fasting plasma glucose (FG) levels in healthy adults. The work presented in this thesis aims to understand how protein-coding variants in glycemic trait loci such as G6PC2 contribute to the variability of glycemic traits and in addition gain further insight into the physiological role of G6PC2. To evaluate the role of coding variants in glycemic trait variation, an exome array genotyping study of non-diabetic European individuals (n=33,407) reported multiple coding variants in G6PC2 that were independently associated with FG. I designed and conducted in vitro assays to functionally assess these variants and showed that they result in loss of function (LOF) due to reduced protein stability. This established G6PC2 as the effector transcript influencing FG and highlighted a critical role for G6PC2 (encoding the islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit) in glucose homeostasis. To investigate the role of low frequency (MAF=1-5%) and rare (MAF<1%) coding variants in influencing glycemic traits, recent large-scale exome array meta-analyses and whole exome sequencing were carried out as part of MAGIC (n=144,060) and the T2D-GENES/GoT2D consortia (n=12,940) respectively. G6PC1, a gene homolog of G6PC2 that primarily acts through the liver, was uncovered as a novel glycemic locus. My functional follow-up studies demonstrated that rare coding variants in G6PC1 exhibited LOF to influence both FG and FI levels. As rare variation in G6PC2 not previously identified could also affect G6PC2 function and modulate glycemic traits, I also functionally characterised a suite of rare non-synonymous G6PC2 variants. Most of the variants tested exhibited markedly reduced protein levels and/or loss of glycosylation. Several variants were also found to impact on enzymatic activity through inactivating or activating mechanisms to influence FG levels. Finally, to gain better understanding of the function of G6PC2 I performed gene knockdown studies in the EndoC-βH1 human beta cell model followed by insulin secretion analyses. G6PC2 knockdown resulted in increased insulin secretion at sub-threshold glucose stimulation levels, consistent with studies in knockout mouse models. In addition, expression of LOF G6PC2 variants were found to upregulate ER stress responses. These results warrant further studies of the precise roles that G6PC2, an ER-resident protein, plays in regulating insulin secretory function and ER homeostasis in the beta cell. Overall, my work described multiple rare coding variants in both G6PC1 and G6PC2 that alter protein function to regulate glucose metabolism through diverse mechanisms in different tissues. Improved understanding of these effector transcripts will open up opportunities for the exploration of new therapeutic targets for glucose regulation and T2D.

Introdução: A incidencia e prevalencia do Diabetes Mellitus aumentam a cada ano, alcancando proporcoes epidemicas. A infusao aquosa de erva mate apresenta consideraveis teores de acidos clorogenicos, que alem de atuarem como antioxidantes, podem diminuir a producao e absorcao de glicose, conforme indicado na literatura. Objetivos: Avaliar a influencia da ingestao de infusao de erva mate sobre parametros bioquimicos relacionados ao diabetes mellitus e o metabolismo de glicose. Metodologia: Ratos Wistar (n=41) foram divididos em: nao diabeticos controle (NDC, n=10); nao diabeticos erva mate (NDE, n=10); diabeticos controle (DC, n=11) e diabeticos erva mate (DE, n=10). O diabetes foi induzido por aloxana. Os animais receberam extrato de erva mate (1 g/kg) ou solucao fisiologica por gavagem durante 28 dias, com agua e racao comercial ad libitum. Seus tecidos foram submetidos as analises (glicemia, insulinemia, colesterol total, atividade da enzima glicose-6-fosfatase hepatica e expressao genica do cotransportador intestinal de Na+/glicose SGLT1, sendo este responsavel pela maior parte da absorcao de glicose no lumen). Os dados foram analisados por analise de variancia com dois fatores (ANOVA 2-way) com ou sem medidas repetidas, de acordo com a variavel. O nivel de significancia adotado foi 5%. Resultados: Nao houve diferenca significativa entre os grupos controle (NDC e DC) e os grupos que ingeriram erva mate (NDE e DE) para a glicemia, insulinemia, colesterol total e atividade da glicose-6-fosfatase hepatica. No entanto, a expressao genica 7 dos transportadores de glicose SGLT1 foi significantemente menor nos animais que receberam erva mate, tanto no duodeno (p=0,007) quanto no jejuno (p<0,001) Conclusão: A ingestao da erva mate nao modificou significativamente os parametros bioquimicos estudados dos animais sob intervencao relativamente ao controle. No entanto, foi observada diferenca significativa quanto a expressao do transportador de glicose SGLT1, sugerindo que compostos bioativos da erva mate sao capazes de reduzir a absorcao da glicose. / Introduction: The incidence and prevalence of Diabetes Mellitus are increasing, reaching epidemic proportions. Yerba mate infusions are rich in polyphenols, especially chlorogenic acids, that are known to have antioxidant properties. Evidences suggest that dietary polyphenols could also play a role in glucose metabolism and absorption. Objective: The aim of this study was to evaluate if yerba mate extract could have antidiabetic properties in alloxaninduced diabetic Wistar rats. Research design and methods: Wistar rats (n=41) were divided in four groups: non diabetic control (NDC, n=10); non diabetic yerba mate (NDM, n=10); diabetic control (DC, n=11) and diabetic yerba mate (DM, n=10). Diabetes was induced by alloxan (38 mg/kg bw). The mate group animals received yerba mate extract diluted in saline solution in a 1g extract/kg bw dose for 28 days, controls received saline solution only. The following biochemical parameters were measured: serum glucose, insulin and total cholesterol; hepatic glucose-6-fosfatase activity and gene expression of the intestinal Na+/glucose cotransporter SGLT1. Results: There were no significant differences in serum glucose, insulin, total cholesterol and hepatic glucose-6-phosphatase activity between the groups that ingested yerba mate extract (NDM and DM) and the controls (NDC and DC). However, the intestinal SGLT1 gene expression was significantly lower in animals that received yerba mate both in upper (p=0.007) and middle small intestine (p<0,001). Conclusion: These results indicate that bioactive 9 compounds present in yerba mate might be capable to decrease intestinal glucose absorption, by decreasing SGLT1 expression.

La production endogène de glucose est une fonction cruciale au maintien de l'homéostasie glucidique dont les 2 dernières étapes sont la production de glucose par la glucose-6-phosphatase (G6Pase) et la sortie du glucose hors de la cellule par le transporteur facilité GLUT2. Les mécanismes dépendants de mouvements membranaires régulant ces deux étapes ont été étudiés. La régulation de la G6Pase par l'AMPc dépend de mouvements membranaires. Cependant les mécanismes moléculaires de cette régulation restaient à caractériser. Nous avons étudié l'hypothèse d'une phosphorylation directe des sous-unités de la G6Pase par la PKA. La PKA est capable d'induire l'activité G6Pase. Cependant, aucune phosphorylation des sous-unités G6Pase n'a pu être mise en évidence par phosphorylation in vitro, mutations dirigées de sites potentiels de phosphorylation ou analyse par spectrométrie de masse. En absence de Glut2, le glucose produit de novo sort des hépatocytes par une voie dépendante de mouvements membranaires, dont le mécanisme moléculaire n'est pas caractérisé. Cette voie vésiculaire n'est pas impliquée dans la sortie du glucose glycogénolytique. À l'inverse, 50% du glucose néoglucogénique sort des hépatocytes par une voie vésiculaire, probablement dépendante de la cavéoline-1. Par microscopie confocale à fluorescence, nous avons montré que la G6Pase se déplace dans la cellule vers la membrane plasmique et co-localise avec une partie de la cavéoline1 cellulaire. Les vésicules composées de cavéoline-1 et contenant la G6Pase pourrait donc constituer un lien entre le réticulum endoplasmique, lieu de production du glucose et la membrane plasmique, lieu de libération du glucose