Les glycannes des glycoprotéines sont impliqués dans de multiples processus biologiques, tels que l'inflammation, l'immunité, le développement et la reproduction. Ils sont responsables des nombreuses propriétés physicochimiques, immunologiques et biologiques des glycoprotéines. Ils peuvent, de fait, moduler les propriétés pharmacologiques des glycoprotéines recombinantes thérapeutiques. Leur importance a également été démontrée par la sévérité des présentations cliniques et les taux de morbidité / mortalité de CDG. Cependant, la médecine moderne manque cruellement d'outils glycobioanalytiques permettant l'exploration de ces métabolismes, à grand échelle. Les objectifs de notre thèse étaient donc fondés sur la mise au point d'approches et d'outils glycobioanalytiques, basés sur l'utilisation de la spectrométrie de masse appliqués à l'étude de la glycosylation d'une glycoprotéine d'intérêts biologiques, l'a-mannosidase lysosomale (LAMAN), et à l'étude de fluides biologiques d'intérêts, tels que le plasma sanguin et l'urine, qui regorgent de précieux glycobiomarqueurs diagnostiques et/ou pronostiques spécifiques, formés au cours de pathologie congénitales de la biosynthèse (CDG) et du catabolisme (glycoprotéinoses) des glycoprotéines. La première partie de notre travail de thèse a consisté en la caractérisation structurale de la glycosylation de la LAMAN bovine, qui constitue notre modèle d'étude de la LAMAN humaine et de la pathogénése moléculaire de l'a-mannosidose. Nous avons pu déterminer la structure détaillée d'une vingtaine de N-glycannes ainsi que leur positions sur six des huit sites de glycosylation de la LAMAN bovine. Les résultats obtenus constituent un base solide pour l'étude de la glycosylation de la LAMAN humaine recombinante, dédiée à l'évaluation de son efficacité thérapeutique dans le traitement expérimental de l'a-mannosidose. La seconde partie de notre travail de thèse a consisté en la mise au point de méthodologies de glycomique dédiées au profilage et à la caractérisation structurale de glycobiomarqueurs urinaires diagnostiques des glycoprotéinoses. Dans un premier temps, nous décrivons une méthode de profilage complet des oligosaccharides et de glycoasparagines urinaires perméthylés, par MALOI-TOF-MS, reflets du catabolisme Iysosomal de glycoprotéines cellulaires, par la microanalyse de 20 µL d'urine de patients. Dans un second temps, appliquée, à l'étude des oligosaccharides urinaires d'un patient atteint d'une ß-mannosidose, nous avons pu identifier et partiellement caractériser neuf nouvelles structures, jamais décrites chez l'homme. Enfin, la dernière partie de notre travail de thèse a consisté en la mise au point d'une approche glycobioanalytique globale permettant d'explorer les processus de g!ycosylation des protéines. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de profilage rapide du N- et du O-glycome des glycoprotéines sériques totales par MALOI-TOF-MS, par la microanalyse de 30 µL de sérum, permettant la détection et la caractérisation de glycofonnes anormales, formées au cours des CDG. Appliquées au sérum de patients souffrant de CDG-lla et d'une déficience en protéine COG 1, cette stratégie a permis de mettre en évidence et de caractériser de précieux glycobiomarqueurs diagnostiques de ces maladies / Glycoprotein-derived glycans are involved in numerous biological processes , such as inflammation, immunity. development and reproduction. They are responsible for numerrous physicochemical, immunological and biological properties of glycoproteins, and, they can modulate the pharmacological properties of therapeutic recombinant glycoproteins. Their importance has been demonstrated by the severity of the clinical pictures and the high level of morbidity and mortality of patients suffering from congenital disorders of glycosylatlon (COG). Therefore, in the field of clinical chemistry, there is a lack of glycobioanalytica! tools for the exploration of the glycoprotein-derived glycan metabolism. Then, the objectives of our thesis was founded on the development of glycobioanalytical approaches, relied on mass spectrometry, applied to the study of the glycosylation of biologically interesting glycoproteins, such as LAMAN, or biological fluids, such as blood plasma and urine, known to contain numerous specific diagnostic and/or prognostic glycobiomarkers, yielded during congenital defect in the biosynthesis (CDG) and in the catabolism (glycoproteinoses) of glycoprotein-derived glycans. The first step of our thesis consisted in the site-specifie glycosylation analysis of bovine LAMAN, whlch constltutes our model of study of the human enzyme and of the molecular pathogenesis of a-mannosidosis. The detailed structures as well as their distribution within six of eight glycosy!ation:sites were determined. These results constitute a solid basis of work for the site-specific glycosylation analysis of the human recombinant LAMAN, in order to evaluate its therapeutic efficiency in the experimental treatment of a-mannosidosis. The second step of our thesis consisted in the elaboration of mass spectrometry methodologies for the profiling as well as the structural characterization of ths urinary oligosaccharides an glycoasparagmes, as valuable glycoprotemoses-assoclated glycobiomarkers. Applled to the mass profilinïg of urinary oligosaccharides of a patient suffering from ß-mannosidosis, nine new structures, never described in man, were identified and partially characterized. Finally, the last part of our thesis consisted in the elaboration of a global glycobloanalytlcal methodology, enablrng the exploratIon of g/ycosylation prccesses of cellular proteins. ln this study we described a.rapid mass spectrometric strategy for the structural characterization of N- and O-glycan chams ln the dlagnosis of genetlc defects in glycan blosynthesis. Applied to patients suffering from CDG-lla and CDG-llg ,valuable diagnostic glycobiomarkers were identified.

La glycosylation est l’une des principales modifications post-traductionnelles des protéines. La glycosylation des protéines est fortement modifiée lors de diverses pathologies comme le cancer, la polyarthrite rhumatoïde ou les troubles congénitaux de la glycosylation («Congenital disorders of glycosylation», CDGs). Ainsi, la nature et les proportions relatives des oligosaccharides liés aux protéines peuvent être utilisées pour dépister, pronostiquer voire suivre l’évolution de pathologies. Les travaux de cette thèse se sont focalisés sur l’étude de la glycosylation pour permettre le dépistage de certaines pathologies : les CDGs, la maladie d’Alzheimer (MA) et la dégénérescence rétinienne. Plusieurs stratégies fondées sur l’électrophorèse capillaire (EC) ont été envisagées pour répondre à cet objectif. Tout d’abord, le développement d’une méthode par EC de zone (ECZ) l’apolipoprotéine C-III (ApoC-III) intacte, une O-glycoprotéine impliquée dans le dépistage des troubles de la O-glycosylation, a permis de séparer les différentes glycoformes selon leur degré de sialylation. L’analyse d’échantillons d’ApoC-III standard provenant de différents fournisseurs par spectrométrie de masse (MS) MALDI -TOF a mis en évidence une hétérogénéité liée à la présence (inattendue) de formes carbamylées. Un traitement du plasma basé sur une immunocapture de l’ApoC-III suivie d’une dérivation sur billes magnétiques de la protéine par un fluorophore a permis de séparer ses différentes glycoformes en ECZ. Ensuite, une analyse N-glycomique de fluides biologiques employant une nouvelle technique de préparation d’échantillon que nous avons adaptée au plasma et au liquide céphalorachidien, a été réalisée par EC en gel couplée à une détection par fluorescence induite par laser (ECG-LIF) sur des patients sains et atteints de la MA. Cette étude a permis de mettre en évidence quelques modifications des N-glycanes chez ces patients. Enfin la combinaison des deux stratégies d’analyse de la glycosylation (glycoprotéine intacte et glycanes libérés), a permis de détecter la transferrine intacte présente dans le liquide vitré à des concentrations faibles ainsi que ses N-glycanes libérés, dans le cadre du dépistage d’une maladie oculaire. L’EC-QTOF-MS a également été explorée pour l’analyse de N-glycanes dérivés avec un nouveau fluorophore permettant d’améliorer la sensibilité en MS. / Glycosylation is one of the most main types of post-translational modifications of proteins. Disease-associated modifications in protein glycosylation have been observed for various pathologies such as cancer, rheumatoid arthritis, or «Congenital disorders of glycosylation» (CDGs). They are often exploited for diagnosis, prognosis and monitoring of these diseases. This thesis work focused on the glycosylation study with the aim to allow the screening of different pathologies: CDGs, Alzheimer’s disease and retinal degeneration diseases. Different strategies based on capillary electrophoresis (CE) were considered to fulfil this goal. First, the developement of a CZE analysis of intact apolipoprotein C-III (ApoC-III), an O-glycoprotein implied in the screening of O-glycosylation disorders, allowed the separation of its glycoforms according to their sialylation degree. The MALDI-TOF mass spectrometry (MS) analysis of standard ApoC-III batches from different standard ApoC-III batches from different suppliers highlighted an additonnal heterogeneity due to (unexpected) carbamylated species. A plasma pretreatment based on an immunocapture of apoC-III followed by protein derivatization on magnetic beads using a fluorophore allowed to separate its glycoforms by CZE. Second, a glycomic analysis of biologicial fluids using a new sample treatment method that we adjusted to plasma and cerebrospinal fluid samples was performed by CGE-LIF on controls and Alzheimer’s patients. It allowed to highlight some modifications of N-glycans for this disease. Finally, the combination of both strategies of glycosylation analysis (intact glycoprotein and released N-glycans) allowed the detection of intact transferrin present in vitrous humor but also of its released N-glycans for the screening of retinal degeneration disease. CE-QTOF-MS was also investigated for the analysis of released N-glycans derivatized by a new fluorophore which increases MS sensitivity.

Le stade pre-B représente un point de contrôle crucial du développement des lymphocytes B dans la moelle osseuse. A ce stade, il y aura formation d'un récepteur intermédiaire nommé pre-BCR. Le pre-BCR est constitué de deux chaines lourdes Igµ et de deux pseudo-chaines légères (SLCs). Chaque SLC est constituée des protéines λ5 et VpreB, qui possèdent des régions « uniques » à leur extrémité N et C-terminale, respectivement. Ces régions uniques sont cruciales pour les fonctions du récepteur. La première partie de mes travaux sur l'étude du domaine λ5-UR nous a permis de proposer un modèle original d'assemblage du pre-BCR et d'apporter les bases structurales du rôle de chaperonne intramoléculaire de λ5-UR. L'activation du récepteur est permis par la formation d'une synapse immunologique. Des interactions entre la galectine-1 et λ5-UR vont permettre la formation d'un treillis d'interactions. L'étude structurale du complexe GAL1/λ5-UR, réalisée dans la seconde partie de ma thèse, a permis de déterminer la structure du complexe. L'interaction GAL1/λ5-UR engendre une modification d'affinité de GAL1 pour le lactose. Ce résultat suggère que l'interaction entre le pre-BCR et la galectine-1 peut influencer l'équilibre des interactions au niveau de la lattice en modulant l'affinité de la galectine-1 pour certains glycans. Dans la troisième partie de mon travail de thèse, des approches de glycomique fonctionnelle et structurale nous a permis l'élaboration d'un mécanisme de formation-dissolution de la synapse pre-B basés sur une modification d'affinité de GAL1 pour certains carbohydrates en présence de λ5-UR. / The pre-B stage represents a critical checkpoint in the development of B cells in the bone marrow. At this stage , there will be formation of a receptor intermediate called pre-BCR . The pre -BCR is composed of two heavy chains Igμ and two surrogate light chains ( SLCs ) . Each SLC consists of two proteins: λ5 and VpreB , which have "unique region" to their N-terminus and C -terminus, respectively. These unique regions are crucial for the functions of the receptor. The first part of my work on the domain λ5-UR has allowed us to propose an original model for assembling the pre -BCR and provide the structural basis of the role of intramolecular chaperone of λ5-UR. Receptor activation is allowed by the formation of an immunological synapse. Interactions between galectin-1 and λ5-UR will allow the formation of a lattice interactions. The structural study of complex GAL1/λ5-UR , conducted in the second part of my thesis, has allowed to determine the structure of the complex. These interactions GAL1/λ5-UR generate a modification of affinity of GAL1 for lactose. This result suggests that the interaction between the pre-BCR and galectin-1 may affect the balance of interactions at the lattice by modulating the affinity for galectin-1 for some glycans. In the third part of my thesis, approaches to structural and functional glycomics has allowed us to develop a mechanism of formation-dissolution of the synapse pre-B based on a modified affinity of GAL1 for certain carbohydrates in presence of λ5-UR.