La transplantation de myoblastes est une thérapie envisagée pour le traitement de la Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). La mort précoce des cellules injectées et leurs faibles migrations limitent son succès. Le MGF-Ct24E, un peptide synthétique qui représente le peptide E de l’isoforme Ec de l’IGF-1, a été utilisé. Il a augmenté la prolifération cellulaire en médiant son effet par un récepteur différent de celui à l’IGF-1. Des injections systémique et intramusculaire ont amélioré le taux de greffe, ce qu’un pré-traitement et une co-injection du peptide n’a pas permis. La surexpression du récepteur à l’IGF-1 avec un lentivirus a augmenté la prolifération des cellules et n’a eu aucun effet sur leur différentiation. La sélection de cellules surexprimant fortement le récepteur à l’IGF-1 et phosphorylant fortement Akt a amélioré le succès de transplantation. Ces résultats offrent une perspective encourageante pour l’amélioration de la transplantation cellulaire pour des patients atteints de DMD. / Myogenic cells transplantation is one of the promising therapies to treat dystrophic patients. Early cells death and poor migration are important problems who limit this therapy’s success. MGF-Ct24E, a synthetic copy of the peptide E from the IGF-1 Ec isoform, was used. The peptide increases the proliferation of cells and did no effect on the differentiation. Injected systematically and intramuscularly, MGF-Ct24E increased the graft success. When the cells were pretreated with the peptide and co-injected with it, no increase in the graft success was seen. The overexpression of IGF-1 receptor on human cells with a lentivirus increased the proliferation rate and did no effect on their differentiation. When the cells were selected for a high expression of the IGF-1 receptor and for a high phosphorylation of Akt, the graft success was increased. Together, those results are offering an interesting avenue for the amelioration of cells transplantation in DMD.

Titre de l'écran-titre (visionné le 3 octobre 2023) / La cellule sénescente sécrète différents facteurs qui peuvent être pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires. Plusieurs stress cellulaires peuvent amener la cellule à entrer en sénescence, comme l'ischémie-reperfusion lors de la transplantation rénale. Le rejet chronique est la principale cause de la perte du greffon rénal de nos jours et il est provoqué par la mise en place d'un milieu inflammatoire chronique dans lequel les cellules immunitaires sont impliquées. Notre hypothèse est que les cellules présentes dans le rein transplanté pourraient participer à attirer des cellules immunitaires par le biais de leur phénotype pro-inflammatoire. Pour répondre à notre hypothèse de recherche, nous avons mis au point un modèle d'induction de la sénescence par stress oxydatif dans une lignée de cellules rénales épithéliales tubulaires (RPTEC). Nous avons par la suite étudié les effets des cellules sénescentes sur les cellules mononucléées du sang périphérique par le biais de deux modèles expérimentaux, soit en utilisant des chambres de Boyden (essaie de migration) et en faisant une co-culture directe. De plus nous avons vérifié la présence de cellules sénescentes dans les cellules immunitaires de greffés rénaux. Nous avons validé notre modèle d'induction de la sénescence et en testant nos deux conditions expérimentales, nous avons observé que les cellules NK étaient spécifiquement attirées par les cellules sénescentes. De plus, nous avons mis en évidence des changements de phénotypes (modulation de l'expression des marqueurs CD45RA et CCR7) dans les populations de lymphocytes T CD8⁺ et de monocytes ainsi qu'une activation des monocytes dose-dépendante en présence de cellules sénescentes. En conclusion, nos résultats suggèrent que les cellules sénescentes pourraient participer aux processus inflammatoires impliqués dans le rejet rénal chronique. / The senescent cell secretes various factors, which can be pro-inflammatory or anti-inflammatory. Several cellular stresses can cause the cell to enter into senescence, such as ischemia-reperfusion during kidney transplantation. Chronic rejection is the leading cause of kidney graft loss today and is caused by the establishment of a chronic inflammatory milieu in which immune cells are involved. Our hypothesis is that the cells present in the transplanted kidney could participate in calling immune cells through their pro-inflammatory phenotype. To answer our research hypothesis, we have developed a model of induction of senescence by oxidative stress in a renal tubular epithelial cell line (RPTEC). We then studied the effects of senescent cells on peripheral blood mononuclear cells through two experimental models, either using Boyden chamber (migration assay) or direct co-culture. In addition, we attempted to verify the presence of senescent cells in the immune cells of kidney transplant recipients. We validated our senescence induction model and by testing our two experimental conditions, we observed that NK cells were specifically attracted by senescent cells. Furthermore, we demonstrated phenotype changes in CD8+ T cell and monocyte populations as well as dose-dependent monocyte activation under senescent cell conditions. In conclusion, our results suggest that senescent cells may participate in inflammatory processes involved in chronic renal rejection.

La dystrophie musculaire de Duchenne, maladie héréditaire causée par la mutation du gène codant la protéine appelée dystrophine, se caractérise par une dégénérescence musculaire progressive et létale. Présentement, c’est une maladie incurable. La transplantation de cellules myogéniques (TM) est une des approches thérapeutiques envisagées pour améliorer la condition et l’espérance de vie des patients. Cette thérapie consiste à prélever des myoblastes d’un donneur sain et de les transplanter dans les muscles d’un patient dystrophique. Cette approche comporte plusieurs difficultés, dont la survie des myoblastes post-transplantation. Premièrement, les myoblastes injectés meurent rapidement et massivement, le succès de la transplantation ne reposant alors que sur une faible portion de cellules transplantées. Tous les facteurs impliqués dans cette mortalité cellulaire ne sont pas encore déterminés. Néanmoins, il est établi que la régénération musculaire se base sur les capacités de prolifération et de différenciation des myoblastes. Le premier article de cette thèse propose l’administration de la forme active de la vitamine D3 pour compenser la perte initiale des myoblastes injectés. Nous avons confirmé l’effet mitogénique et morphogénique de la vitamine D3 sur les myoblastes humains permettant ainsi, via son administration, d’augmenter le succès des TMs. La deuxième partie de cette thèse traite du rejet immunitaire lié à la TM allogénique. Actuellement, pour bloquer ce rejet, les approches cliniques proposent une immunosuppression soutenue des patients, se révélant toxique à long terme et augmentant le risque de contracter des maladies iatrogènes. Une autre procédure, moins délétère, repose sur le développement d’une tolérance immunologique, via l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique mixte. Pour obtenir ce chimérisme, les procédures existantes nécessitent un lourd conditionnement des patients, incluant l’injection d’anticorps bloquants ou déplétants, ainsi qu’une irradiation pancorporelle. Le deuxième article de ce manuscrit propose l’administration de drogues cytoréductrices, déjà connues et approuvées en clinique. Ce protocole conduit au développement d’un statut de tolérance stable ainsi que le maintien à long terme des TMs. Les travaux effectués au cours de cette thèse proposent donc deux solutions pour circonvenir à la destruction précoce et plus tardive des myoblastes transplantés. Ces deux approches pourraient réduire l’aspect invasif de l’essai clinique basé sur la TM. / Duchenne muscular dystrophy is a fatal neuromuscular recessive disease characterized by widespread muscle damage throughout the body. No cure is currently available this disease. Myoblast transplantation (MT) is an interesting approach to enhance the life quality and life expectancy of patients. This therapy consists in harvesting myoblasts of a non-dystrophic donor and in transplanting them in dystrophic muscles. This approach involves many drawbacks and predominantly the loss of the grafted cells in post-transplantation period. Firstly, an important part of injected myoblasts quickly dies following their injection. Thus, the graft success relies on the survival of a little proportion of grafted cells. The pathways involved in this important death of cells are not well established. However, following a muscle injury, the muscular regeneration depends on the proliferation and the differentiation of myoblasts. In a first study, we propose an administration of the activated form of vitamin D3 on human myoblasts to compensate the early loss of injected cells. Actually, some previous studies demonstrated that this vitamin acted directly on myoblasts, regulating their proliferation and fusion. We have confirmed these effects and demonstrated that the administration of the vitamin D3 enhances the success of human MT. The second part of this thesis broaches the specific immune rejection associated with the allogeneic MT. Currently, Duchenne patients are treated with chronic immunosuppression for MT. However, the problem in humans is that the long-term use of immunosuppressive treatments has adverse effects: nephrotoxicity, increased cancer risk etc... Mixed-haematopoietic chimerism is a promising approach to circumvent sustained immunosuppression but most of proposed protocols need antibodies treatment or host irradiation. The second study of this thesis shows that we have developed a protocol based on a short term administration of two cytoreductive drugs, both approved for clinical use. The mixed-chimerism development obtained with our conditioning regimen promotes donor specific stable tolerance. Taken together, this thesis gives two solutions to circumvent the early and late destruction of transplanted myoblasts. These approaches could be further included in the clinical essay developed for the Duchenne muscular dystrophy by promoting the efficiency and decrease the clinical risk related to the MT.

[Préconditionnement hypoxique des myoblastes humains ; préconditionnement pharmacologique des myoblastes humains]. / Problématique: La transplantation des myoblastes est une approche thérapeutique potentielle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Un des facteurs limitant de cette approche est la mort précoce de près de 80 % des myoblastes transplantés durant les premiers jours suivant la greffe. Nous avons vérifié si le préconditionnement hypoxique et pharmacologique des myoblastes humains permettait de réduire leur taux de mortalité in vitro. Par ailleurs, un 'cocktail' pro-survie constitué de facteurs anti-apoptotiques a été utilisé dans le but d'en tester l'effet sur la survie des myoblastes in vivo. Méthode: In vitro, la mortalité a été évaluée par marquage à l'Annexine V et par analyse au FACS. In vivo, la quantité de cellules vivantes a été estimée par scintigraphie en mesurant la quantité de carbone 14 radioactif incorporé dans l'ADN des myoblastes. Résultats: In vitro, le préconditionnement hypoxique des myoblastes permet d'augmenter le taux de prolifération des myoblastes. Le préconditionnement pharmacologique des myoblastes au DETA-NO (10 muM), un donneur d'oxyde nitrique permet d'améliorer leur survie in vitro (p<O.05). Par ailleurs, le traitement des myoblastes au diazoxide (1 00 muM), un activateur de canaux potassiques sensibles à l'ATP, combiné à un traitement au DETA-NO (50 muM ) permet d'améliorer de façon significative la survie des myoblastes in vitro (p<O.Ol). Le cocktail pro-survie permet de protéger les myotubes humains d'un stress anoxique prolongé (96 heures) in vitro. De plus, la transplantation des myoblastes humains suspendus dans le cocktail permet d'augmenter de 7 fois leur survie au bout de 5 jours après la greffe (p<O.Ol). Conclusion: Les préconditionnements hypoxique et pharmacologique sont des stratégies qui permettent de protéger les myoblastes humains du stress oxydatif in vitro. Le cocktail pro-survie peut être utilisé afin d'améliorer la transplantation des myoblastes. / Problématique: La transplantation des myoblastes est une approche thérapeutique potentielle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Un des facteurs limitant de cette approche est la mort précoce de près de 80 % des myoblastes transplantés durant les premiers jours suivant la greffe. Nous avons vérifié si le préconditionnement hypoxique et pharmacologique des myoblastes humains permettait de réduire leur taux de mortalité in vitro. Par ailleurs, un 'cocktail' pro-survie constitué de facteurs anti-apoptotiques a été utilisé dans le but d’en tester l'effet sur la survie des myoblastes in vivo. Méthode: In vitro, la mortalité a été évaluée par marquage à l'Annexine V et par analyse au FACS. In vivo, la quantité de cellules vivantes a été estimée par scintigraphie en mesurant la quantité de carbone 14 radioactif incorporé dans l'ADN des myoblastes. Résultats: In vitro, le préconditionnement hypoxique des myoblastes permet d'augmenter le taux de prolifération des myoblastes. Le préconditionnement pharmacologique des myoblastes au DETA-NO (10 ~M), un donneur d'oxyde nitrique permet d'améliorer leur survie in vitro (p<O.05). Par ailleurs, le traitement des myoblastes au diazoxide (1 00 ~M), un activateur de canaux potassiques sensibles à l'ATP, combiné à un traitement au DETA-NO (50 ~M ) permet d'améliorer de façon significative la survie des myoblastes in vitro (p<O.Ol). Le cocktail pro-survie permet de protéger les myotubes humains d'un stress anoxique prolongé (96 heures) in vitro. De plus, la transplantation des myoblastes humains suspendus dans le cocktail permet d'augmenter de 7 fois leur survie au bout de 5 jours après la greffe (p<O.Ol). Conclusion: Les préconditionnements hypoxique et pharmacologique sont des stratégies qui permettent de protéger les myoblastes humains du stress oxydatif in vitro. Le cocktail pro-survie peut être utilisé afin d'améliorer la transplantation des myoblastes. / Background: Myoblast transplantation is a potential therapeutical approach for Duchenne muscular dystrophy. One limiting problem is that up to 80 % of the transplanted myoblasts die few days following the graft. We have demonstrated that the hypoxic and pharmacological preconditioning reduces cell death in vitro. Moreover, a pro-survival cocktail composed of anti-apoptotic factors has been tested on the survival of human myoblasts transplanted into immunodeficient mice. Method: In vitro, cell death was evaluated by labeling cells with Annexin V followed by FACS analysis. In vivo, the percentage of cell viability was measured by the thymidine quantity in the transplanted cell DNA. Results: In vitro, the hypoxic preconditioning of myoblasts improved the proliferation of myoblasts. Pharmacologie preconditioning with DETA-NO (10 ~M), a nitric oxide donor, improved myoblasts survival in vitro (p<0.05). Furthermore, diazoxide (100 ~M), an ATP-dependent channel opener, combined with DETA-NO (50 ~M) improved significantly myoblasts survival in vitro (p<O.O 1). In addition to that, the prosurvival cocktail protected human myotubes from anoxie injury (96 hours). This cocktail improves myoblast survival 7-fold, five days after their transplantation (p<O.Ol). Conclusion: Hypoxic and pharmacologie al preconditioning can be used to protect myoblast from oxidative stress injury in vitro. AIso, the pro-survival cocktail. can be used to improve myoblast transplantation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mon projet de doctorat s'est déroulé au Laboratoire d'Optique Appliquée de l'Ecole Polytechnique, ENSTA, CNRS à Palaiseau, en collaboration avec le Laboratoire Biotechnologie et Oeil, Université Paris V, Hôpital Hôtel Dieu à Paris. Il porte sur l'étude des phénomènes d'interaction du rayonnement à impulsions ultracourtes avec le tissu et notamment sur les applications des lasers femtoseconde (dont les impulsions durent 10-15 s) en chirurgie de la cornée. Environ 100.000 greffes de cornée sont réalisées annuellement dans le monde. La première cause de greffe de cornée est l'œdème, pathologie due à un disfonctionnement cellulaire ; le tissu devient perméable et perd ses propriétés de transparence. Le degré d'œdème progresse très rapidement et, si non interrompu par une greffe, entraîne une opacification totale de la cornée et une baisse drastique de l'acuité visuelle. Les techniques chirurgicales de kératoplastie (greffe de cornée) pratiquées aujourd'hui présentent un risque de rejet élevé ou un risque d'échec car elles sont délicates et difficiles. Face à ces problématiques, la technologie des lasers femtoseconde représente la seule alternative intéressante en remplacement des méthodes chirurgicales classiques. Des systèmes à but clinique sont déjà présents sur le marché, cependant leurs performances sont réduites dans le cas de traitements de cornées fortement pathologiques. De nature parfaitement interdisciplinaire, le travail de recherche réalisé dans le cadre de mon doctorat a permis d'établir un bilan très complet du potentiel et des limites de l'application de la technologie laser actuelle à la greffe de cornées pathologiques. Il a apporté des solutions d'optimisation de l'interaction laser-tissu et indiqué les différentes pistes possibles pour le développement d'une technologie future plus performante.

Thèse de doctorat : Médecine. Immunologie : Nantes : 2007. / Bibliogr.

Thesis (S.T.D.)--Catholic University of America, 1944. / Vita. Bibliography: p. 107-113.

Ce travail de recherche a eu pour objectif de caractériser l’influence du génotype de porte-greffes sur le développement du greffon notamment à travers l’étude des mécanismes relatifs à la signalisation azotée et hormonale. Dans ce contexte, deux porte-greffes, 1103 Paulsen (1103P) et Riparia Gloire de Montpellier (RGM), induisant respectivement une forte et faible vigueur du greffon, ont été étudiés. Une analyse du transcriptome racinaire a été effectuée chez des plants greffés impliquant ces deux génotypes dans un système split-root où la disponibilité en azote était hétérogène. Une réponse plus prononcée a été observée pour le génotype RGM, ainsi qu’une régulation temporelle différente entre les deux génotypes, notamment concernant des gènes clés de la réponse au nitrate intervenant dans la régulation de la croissance des racines ou dans la signalisation hormonale. D’un point de vue développemental, une régulation étroite de la production des racines latérales et des rameaux latéraux par la disponibilité en azote a été mise en évidence chez RGM. D’autre part, les propriétés intrinsèques de chaque porte-greffe semblent être conférées au greffon induisant notamment une ramification plus importante de celui-ci lorsque le porte-greffe 1103P est utilisé. La caractérisation fonctionnelle des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des strigolactones et la réalisation de bio-essais ont permis de mettre en évidence la production de composés de type strigolactones chez la Vigne. Ces travaux suggèrent aussi une balance contrastée entre les strigolactones et les cytokinines au sein des deux génotypes, corrélée à leur capacité de contrôle de la croissance du greffon. L’ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence une réponse transcriptomique et développementale à la disponibilité en azote toujours plus prononcée pour le génotype connu pour conférer le moins de vigueur au greffon, RGM. / This work aimed to characterize the impact of the rootstock genotype on the scion development especially through the study of the mechanisms related to nitrogen and hormonal signalling. In that context, two rootstocks were studied, 1103 Paulsen (1103P) and Riparia Gloire de Montpellier (RGM), inducing high and low scion vigour, respectively. A transcriptomic analysis was performed on roots of grafted plants involving both genotypes, cultivated in a split-root system where the nitrogen availability was heterogeneous. A more pronounced response was observed for RGM together with a different temporal regulation between both rootstocks, in particular concerning the expression of key genes of the nitrate response involved in root growth regulation or in hormonal signaling. Concerning plant development, a clear impact of the nitrogen availability on the production of lateral roots and shoot branching was highlighted for RGM. Moreover, the intrinsic properties of each rootstock seemed to be conferred to the scion inducing especially a higher shoot branching when the rootstock 1103P was used. The functional characterization of the genes involved in the strigolactone biosynthesis pathway and bioassays highlighted the production of strigolactone-like compounds in Grapevine. These experiments suggest also a contrasted balance between strigolactones and cytokinins within each rootstock genotype, correlated with their ability to control the scion growth. Taking together, these results showed a pronounced transcriptomic and developmental response to nitrogen availability for the genotype conferring the lowest scion vigour, RGM