La transplantation de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon ombilical ne s'est pas révélée être favorable pour la reprise des neutrophiles et des plaquettes. L'expansion des cellules hématopoïétiques (CD34+) et leur différenciation en mégacaryocytes (MKs) ont été optimisées dans notre laboratoire. Par contre, l'expansion des MKs avec des cocktails de cytokines atteint rapidement un plateau. Pour pallier ce problème, de nouvelles stratégies doivent être étudiées pour augmenter l'expansion des cellules CD34+ et MKs ex vivo. L'objectif principal de ce projet était de maximiser l'expansion des progéniteurs myéloïdes et MKs en amplifiant les cellules CD34+ en présence de cellules et/ou protéines normalement présentes dans la moelle osseuse (MO) et pour éventuellement améliorer la reprise hématopoïétique à court terme après transplantation. Plusieurs stratégies ont été proposées pour ce projet de doctorat afin de favoriser les expansions des progéniteurs myéloïdes et MKs en présence des cocktails de cytokine : de développer un environnement endostéale en introduisant la co-culture avec les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) de la MO, d'évaluer aussi différentes protéines de la matrice extracellulaire (MEC) afin de stimuler la croissance ex vivo, et de développer un bioréacteur qui recrée partiellement un microenvironnement similaire à la MO in vitro. Les résultats ont démontré que l'expansion des progéniteurs hématopoïétiques (PHs) était généralement meilleure dans les conditions qui ne nécessitent pas de contact avec des CSMs irradiées. Cette étude démontre pour la première fois que les CSMs se différencient en pseudo-ostéoblastes après irradiation (14 Gray) ce qui affecte la sécrétion de la neurotrophine-3 et de 1' insuline growth factor binding protein-2, afin de promouvoir l'expansion des PHs. Deuxièmement, nos résultats avec les protéines de la MEC ont démontré que l'utilisation du mélange protéique 4MECp (collagène type I et IV, laminine, fibronectine) permet aussi augmenter l'expansion des PHs. Finalement, nous avons conçu et validé un système de co-culture avec circulation en trois dimensions qui a favorisé l'expansion des PHs. En conclusion, cette étude de doctorat démontre que recréer partiellement la MO in vitro peut améliorer l'expansion des PH myéloides et mégacaryocytaires à partir de cellules CD34+. Cette étude confirme aussi l'importance qu'ont les CSMs, ostéoblastes et protéines MEC sur la différenciation et la prolifération des PHs.

L'anémie de Fanconi (AF) est une pathologie génétique rare (1/350 000 naissances), transmise selon le mode récessif. Son tableau clinique regroupe de nombreuses malformations congénitales, une aplasie médullaire, une pancytopénie et une prédisposition accrue aux cancers. Au plan cellulaire, une mutation sur l'un des treize gènes Fanconi suffit à induire une instabilité chromosomique et une hypersensibilité aux agents pontant l'ADN. La perte de fonction des protéines Fanconi est probablement responsable du défaut d'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de l'état pro-apoptotique des progéniteurs médullaires. Les principaux traitements ont une très faible efficacité et induisent de dangereuses complications (toxicité, leucémies). La thérapie génique qui consiste à introduire ex vivo dans les CSH, une copie fonctionnelle du gène Fanconi altéré, apparaît ici comme le traitement alternatif le plus prometteur. Les premiers travaux effectués dans le laboratoire et confirmés pas d'autres, ont montré que la correction génique ex vivo est néfaste pour les CSH Fanconi. Une nouvelle approche thérapeutique a été mise en place, consistant à introduire la copie fonctionnelle du gène altéré directement in vivo, par injection intra-fémorale (IIF). Cette technique novatrice permet de délivrer le gène dans le milieu natif des CSH, leur évitant le stress induit par la culture. Après l'IIF de virions porteurs du gène EGFP (enhanced green fluorescent protein), des analyses sanguines mensuelles montrent une augmentation régulière de la fluorescence, confirmant l'efficacité technique du transfert génique in vivo. L'étape suivante consistait en l'injection du gène correcteur FancC, en fusion avec le marqueur EGFP (FancC-EGFP), dans des souris FancC-/-, FancA-/- et sauvages. L'expression sanguine de la protéine FANCC-EGFP confirme la transduction de cellules médullaires. L'efficacité de correction est évaluée lors de tests de survie des souris aux injections intra-péritonéales d'un agent pontant l'ADN : la mitomycine-C (MMC), sur une période de quinze semaines. Ce traitement vise à évaluer l'effet correcteur de la transduction et la fonctionnalité de la protéine transgénique, seules les cellules corrigées seront en mesure de restaurer l'intégrité de leur ADN et de proliférer. La nature des cellules corrigées a été analysée au cours de transplantations successives. Les résultats démontrent que les CSH FancC-/- recouvrent, après correction in vivo, par le transgène FancC-EGFP, une fonctionnalité semblable à celle des sauvages. Les résultats préliminaires obtenus dans le modèle murin aplasique confirment l'efficacité de la correction génique et sont particulièrement encourageants puisqu'ils permettent d'envisager l'IIF comme une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l'AF.

Beaucoup d’espoir repose sur le domaine de la transplantation de cellules souches issues de sang de cordon ombilical. En effet, malgré les avancées remarquables survenues ces dernières années, le retard de la reprise des plaquettes et des neutrophiles persiste comme inconvénient majeur à surmonter. Afin d’améliorer la prise de greffe et d’accélérer la récupération des cellules hématopoïétiques, des thérapies cellulaires se basant sur la croissance et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques sont à l’étude. Ainsi, avec un nombre plus élevé de cellules qui ont déjà entamé leur différenciation, la récupération du système hématopoïétique devrait être accélérée. Ce mémoire présente une stratégie d’expansion des cellules qui favorise la voie mégacaryocytaire grâce à un cocktail de cytokines optimisé et à une température d’incubation de 39°C. La co-transplantation de cellules expansionnées sous ces conditions optimales avec des cellules non-expansionnées a permis d’accélérer la reprise plaquettaire chez un modèle murin. / Strong hope resides in the field of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Although many remarkable advances were achieved in the past years, the prolonged delay in neutrophils and platelets recovery is still a major issue to overcome. To enhance engraftment and accelerate hematopoietic recovery, the growth and differentiation of hematopoietic stem cells are studied as the funding of cellular therapies. Hence, with a higher number of cells, that already entered their own differentiation pathway, recovery of mature hematopoietic cells should be accelerated. This thesis presents an expansion strategy for hematopoietic stem cell that favors the megakaryocytic lineage through an optimized cytokine cocktail and an incubation temperature of 39°C. Finally, the co-transplantation of cells expanded under these conditions along with non-expanded cells accelerated platelet recovery in a murine model for stem cell transplantation.

La greffe de cellules souches hématopoietiques (CSH) est un traitement intensif pour des désordres hématologiques et des tumeurs solides réfractaires. La fatigue est l'un des symptômes souvent rapporté et les facteurs associés à ce phénomène sont peu connus. Alors que le modèle des systèmes de Neuman et Fawcett (2002) en sciences infirmières permet l'agencement des concepts de l'étude, la théorie de stress de (Herbert & Cohen, 1996) permet de valider l'objectif principal de cette étude qui est de vérifier sa capacité à prédire la fatigue et le vigueur des personnes qui ont reçu une greffe de cellules souches hématopoietiques. L'objectif secondaire est de décrire la relation entre le niveau d'hémoglobine et la fatigue. Un total de 83 participants adultes a été recruté. Les stresseurs liés au cancer (β = 0,29; p < 0,05) expliquent 16 % de la fatigue après une greffe. Pour la vigueur, l'exercice physique (β = 0,30; p < 0,001), la perception d'une vie sociale satisfaisante (β = 0,23; p < 0,05), le fait de travailler (β = 0,18; p < 0,05) et un bas niveau de détresse émotionnelle (β = -0,21; p < 0,01) expliquent 42 % de la variance de la vigueur. Ainsi, des variables psychosociales liées au stress expliquent la fatigue persistante après une greffe de CSH. De plus, une relation significative a été trouvée entre le niveau d'hémoglobine (r = -0,33; p < 0,01) et la fatigue. En utilisant le modèle des systèmes de Neuman et Fawcett, l'infirmière peut développer pour ses patients, des interventions primaires, secondaires et tertiaires visant à diminuer les effets négatifs des stresseurs pouvant conduire à la fatigue. Ces interventions infirmières pourraient aussi être centrées sur des stratégies qui permettraient d'améliorer le niveau d'énergie (la vigueur) par la pratique de l'exercice physique et une approche globale de la gestion de stress.

La mégacaryopoïèse est le nom donné à la différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) en mégacaryocytes (MCs). Elles sont les cellules spécialisées précurseures des plaquettes sanguines. Au cours de leur maturation, les MCs entreprennent plusieurs rondes successives de réplication d'ADN. Ce phénomène est appelé endomitose. De récentes évidences suggèrent que les MCs endomitotiques seraient incapables de compléter leur division cellulaire. Dans le cadre de ce projet de recherche, il a été démontré que la surproduction du peptide MTPG-43 dans des lignées leucémiques humaines entraîne une augmentation du volume cytoplasmique et un changement de morphologie cellulaire, rappelant ainsi certaines acquisitions du MC différencié. Fusionné ou non à des marqueurs fluorescents, la surexpression transgénique du peptide dans les lignées exprimant un phénotype mégacaryocytaire entraîne un accroissement de la taille des cellules sans pour autant faire intervenir une augmentation du degré de ploïdie nucléaire. N'affectant pas la viabilité, l'accumulation du peptide à la membrane cytoplasmique semble rendre les cellules plus labiles. L'expression du peptide dans des MCs dérivés de cultures de CSHs de sang de cordon à l'aide d'un vecteur d'expression adénoviral n'a cependant pas permis d'accroître la production de plaquettes in vitro. Ce peptide demeure toutefois un outil moléculaire intéressant pour approfondir et élucider les mécanismes biologiques qui provoquent le gigantisme cellulaire.

La mégacaryopoïèse est le mécanisme par lequel les cellules souches hématopoïétiques se différencient en cellules mégacaryocytaires. Notre équipe a récemment découvert que la culture des cellules CD34+ issus de sang de cordon ombilical sous condition d'hyperthermie légère (39°C) accélère la différenciation des mégacaryocytes. Le but de ces travaux était de mieux caractériser l'effet de l'hyperthermie sur nos cellules et d'identifier le mécanisme d'action sur la mégacaryopoïèse. Nous avons découvert que l'impact sur la différenciation mégacaryocytaire était rapide et que l'optimisation du temps de culture à 39°C augmentait le nombre de mégacaryocytes. L'hyperthermie légère avait peu d'effets sur la viabilité cellulaire mais diminuait légèrement le degré de ploïdie des mégacaryocytes. De plus, les cellules maintenues à 39°C avaient un temps moyen de division plus court et une augmentation significative du nombre de cellules en cycle cellulaire actif. Finalement, une analyse par PCR a révélé une diminution d'expression de plusieurs gènes régulant le cycle cellulaire.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) constitue une avenue thérapeutique potentiellement curative pour plusieurs cancers hématologiques comme la leucémie. L’utilisation d’une thérapie immunosuppressive pour prévenir la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) est un déterminant majeur du succès de la greffe. Malgré tout, cette complication survient chez 25 à 50% des transplantés et est une cause majeure de mortalité. L’optimisation du régime d'immunosuppression est un facteur facilement modifiable qui pourrait améliorer le pronostic des patients. Particulièrement, les polymorphismes du génome du donneur ou du receveur dans les voies pharmacogénomiques des immunosuppresseurs pourraient influencer l’exposition et l’action de ces médicaments, de même que le pronostic du patient. Le profilage de 20 pharmacogènes prioritaires chez des paires de donneurs-receveurs en greffe de CSH a permis d’identifier des variations génétiques liées au risque de la GvHD aiguë. Principalement, le statut génétique du receveur pour les protéines ABCC1 et ABCC2, impliquées dans le transport du méthotrexate (MTX), ainsi que des cibles moléculaires de ce médicament (ATIC et MTHFR) ont été associées au risque de GvHD aiguë. Similairement, le NFATc1, codant pour une cible moléculaire de la cyclosporine, augmentait lui aussi le risque de la maladie. Les porteurs de deux génotypes à risque et plus étaient particulièrement prédisposés à développer cette complication. Par surcroît, le statut génétique du donneur influençait également le pronostic du receveur après la greffe. Entre autres, des allèles protecteurs ont été identifiés dans les voies liées au transport (SLC19A1) et à l’action du MTX (DHFR). Inversement, NFATc2 a été associé à une augmentation du risque de GvHD aiguë. Afin de mieux comprendre les associations observées entre ces marqueurs génétiques et le risque de GvHD aiguë, une étude prospective innovante est en cours chez des greffés de CSH. Cette étude permettra d’étudier comment la génétique du patient ou du donneur peut influencer la pharmacocinétique et la pharmacodynamie des immunosuppresseurs, de même que leurs liens avec la GvHD aiguë. Ces paramètres sont quantifiés grâce à des approches analytiques que nous avons mises au point afin de répondre aux besoins spécifiques et uniques de cette étude. Les approches proposées dans cette thèse sont complémentaires aux méthodes classiques de suivi des immunosuppresseurs et pourraient aider à optimiser la pharmacothérapie du patient. Une meilleure identification des patients à haut risque de GvHD aiguë avant la greffe, basée sur des marqueurs pharmacogénomiques identitaires, pourrait guider le choix de la prophylaxie immunosuppressive, et ainsi améliorer l’issue clinique de la greffe. / Hematopoietic stem cells transplantation (HSCT) is a potentially curative therapy for several hematological cancers such as leukemia. Following transplantation, effective immunosuppression prophylaxis is mandatory to prevent the graft-versus-host disease (GvHD) and improved the clinical outcome. However, GvHD still occurs in 25-50% of transplanted patient and is associated with high mortality rate. Optimization of immunosuppressive therapy is an easily modifiable factor that can improve the prognosis of patient after HSCT. In particular, polymorphisms of recipient and donor in genes with functions related to drugs transport, metabolism and action might influence the exposure and the efficacy of immunosuppressive therapy, and thus the clinical outcome. The evaluation of 20 candidate pharmacogenes in donor-recipient pairs of HSCT identified genetic polymorphisms associated with the risk of GvHD. Recipient genetic status for ABCC1 and ABCC2, related to methotrexate (MTX) transport, as well as polymorphisms in genes encoding molecular targets (ATIC and MTHFR) of this drug, exhibit a remarkable influence on acute GvHD prevalence. Similarly, the cyclosporin molecular target NFATc1 also increases the risk of GvHD. Importantly, the presence of ≥2 of these SNPs was found to be associated with high risk of developing severe grade of acute GvHD. In donor, we identified protective alleles in pathways related to transport (SLC19A1) and action (DHFR) of MTX. Conversely, NFATc2 enhances the risk of acute GvHD. To improve our understanding of the process behind these associations, we have an ongoing prospective study in HSCT. This innovative study will provide the opportunity to evaluate the influence of such genetic markers on the pharmacokinetic and pharmacodynamic of immunosuppressive drugs, as well as their relation with the risk of GvHD. For the specific needs of our study, we have developed two analytical methods based on mass spectrometry. The approaches we proposed in this thesis are complementary to conventional monitoring method and are promising tools to optimize drug therapy in HSCT. Identification of such biomarkers assessed before transplantation can help personalized patient care in order to prevent GvHD and improve survival.

Les fusions de MLL peuvent générer trois types de leucémies aiguës (LLA-B, LMA et LLA-T). Les cellules souches/progénitrices de sang de cordon humain purifiées par une méthode de sélection négative ont été infectées par un rétrovirus contrôle exprimant la EGFP ou un rétrovirus exprimant un gène de fusion de MLL et la EGFP, avant d’être injectées dans le fémur de souris immunodéficientes. Après 20 semaines, les souris ont été sacrifiées et les organes hématopoïétiques ont été analysés par FACS. MLL-ENL a généré exclusivement des LLA-B, MLL-ELL des LLA-B et LMA, et MLL-AF9 des LLA-B et mixte. Il semble que certains partenaires peuvent jouer un rôle important dans le phénotype et que le microenvironnement murin peut favoriser le phénotype LLA-B. Cette étude peut aider à comprendre le rôle instructif des MLL-ENL, MLL-ELL et MLL-AF9 sur le phénotype leucémique et leur capacité à initier la transformation des cellules normales en cellules leucémiques. / MLL fusion genes may generate three different types of acute leukemia (B-ALL, AML and T-ALL). Purified human cord blood cells by negative selection technique (Lin-CB) and having CD34+ &gt; 70% were transduced by control retrovirus expressing the EGFP or other retrovirus expressing an MLL fusion gene and the EGFP, and then injected into the immune-deficient NSG mouse femur to test the leukemogenic potential. After 20 weeks, the mice were sacrificed and organs were analysed by FACS. MLL-ENL exclusively produced B-ALL, MLL-ELL B-ALL and AML, and MLL-AF9 B-ALL and mixed. It seems that some MLL partner genes may play an important role in phenotype, and the murine microenvironment of our in vivo model may promote the B-ALL phenotype. This study may help understand the instructive role of MLL-ENL, MLL-ELL and MLL-AF9 fusion genes in leukemic phenotype and their ability to induce the transformation of normal hematopoietic stem/progenitor cells into leukemic cells.