Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L'objectif de cette thèse est le développement d'une langue électronique avec une méthode simplifiée d'obtention de récepteurs à réactivité croisée. Ces récepteurs sont préparés par une approche combinatoire novatrice qui consiste au mélange et à l'auto-assemblage de deux disaccharides. Le couplage de ces récepteurs avec un système de détection d'imagerie par résonance des plasmons de surface nous a permis de réaliser une langue électronique capable de différencier des échantillons de différentes complexités, y compris des protéines pures et des mélanges complexes. Cela se fait grâce aux profils et images d'évolution continue, assimilés à des " empreintes digitales " des échantillons. D'un autre côté, ce système peut être utilisé en tant qu'outil pour la conception de surfaces biomimétiques 2D et 3D. Ce système est prometteur pour l'étude des interactions sucre-protéine et pour la préparation de nanovecteurs biomimétiques qui ciblent de façon spécifique des protéines d'intérêt.

Les glycosaminoglycanes (GAG) forment une famille de polysaccharides linéaires retrouvés dans tous les tissus, au niveau des matrices extracellulaires et des surfaces cellulaires. Les héparanes sulfates (HS) sont des membres importants de cette famille et sont liés à une protéine dite cœur pour former ensemble le protéoglycane (PG). Selon le tissu et la nature de la protéine cœur, les HS, composés d'unités disaccharidiques de N-acétylglucosamine (GlcNAc) et d'acide glucuronique (GlcA) [-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-] vont subir de nombreuses modifications. En effet, les HS sont modifiés par différentes sulfatations au niveau des deux oses et une épimérisation de l'acide glucuronique en acide iduronique (IdoA). Les différentes structures saccharidiques élaborées vont pouvoir être alors interagir avec une très grande quantité de protéines et jouer des rôles divers dans l'inflammation, la prolifération cellulaire, l'angiogenèse, la réponse immunitaire, l'attachement viral…L'étude de la structure des HS, du fait de la nature flexible et hétérogène de ces molécules, a été principalement focalisée sur des analyses fragmentaires du polysaccharide au niveau des séquences d'interaction avec les protéines. Lors de ces dépolymérisations, des informations sur le polysaccharide, notamment l'épimérisation, sont perdues.Dans ce travail, nous avons développé une approche basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) bidimensionnelle 1H-13C pour l'étude de la composition saccharidique des HS réalisée directement à partir des HS isolés de cellules marquées au 13C. Pour cela, un protocole efficace de marquage et de purification des polysaccharides a été mis en place. En intégrant le volume des pics à différents déplacements chimiques par RMN, cette analyse non-destructive permet de déterminer à la fois le profil de sulfatation et d'épimérisation des HS. Cette analyse est appliquée efficacement à différents types cellulaires et est de grand intérêt pour mieux comprendre les changements dans les structures d'HS qui ont lieu lors de régulations physiologiques ou lors de développement pathologiques.Ces résultats ont permis d'ouvrir la voie à l'analyse des HS directement au niveau des cellules par RMN du solide. Les études dans ce contexte représentent un enjeu majeur pour la compréhension des différents rôles des HS et leur capacité à interagir avec une myriade de protéines in vivo. / Glycosaminoglycans (GAGs) belong to a linear polysaccharide family which are found within all tissues, at the extracellular matrix and cell surfaces levels. Heparan Sulfates (HS) are one of the major members of this family, they are bound to a core protein to form altogether the so-called proteoglycan (PG). Depending on the localization and on the core protein, the HS – composed of a N-acetylglucosamine (GlcNAc) and a glucuronic acid (GlcA) [-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-] building block – undergo various modifications. Indeed, HS can be sulfated at different positions on both monosaccharide and the GlcA can be epimerized into an iduronic acid (IdoA). The fine structures of the polysaccharide will be able to interact with a large range of proteins and play a plethora of roles such as in inflammation processes, cell proliferation, angiogenesis, immune responses, viral attachment…The HS structural studies, due to the flexibility and heterogeneity of the polysaccharide, have so far been restricted to HS fragments able to bind proteins. The depolymerization techniques induce valuable information losses such as epimerization.In this work, we have successfully developed a nuclear magnetic resonance (NMR)-based approach to study HS features from 13C metabolically enriched cells. For this, an effective protocol to label and purify HS has been set up. By integrating peaks' volumes at well-resolved 1H-13C chemical shifts by NMR, the sulfation, epimerization and disaccharide profile can be determined from full-length HS. This method has been used to study HS from various cell types and is of important interest to better understand changes in HS structures that occur through physiologic and pathologic events.The results obtained open the way to analyze HS directly at the cell surface via solid state NMR techniques. In this context, these studies are a major challenge to decipher the different roles of HS and their ability to interact with so many partners in vivo.

La mucopolysaccharidose IIIB (MPSIIIB) est une maladie de surcharge lysosomale (MSL) causée par une accumulation d’oligosaccharides d’héparane sulphate (OHS), induisant chez les enfants atteints un retard mental progressif, une neurodégénérescence et une mort prématurée. Les mécanismes physiopathologiques impliqués sont mal compris. Il est nécessaire d’élucider ces mécanismes, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement par thérapie génique en regard de la perte de la plasticité neuronale, et pour définir les meilleures conditions de traitement. Pour cela, de nouveaux modèles cellulaires de la maladie ont été créés. Des cellules souches pluripotentes induites ont été générées à partir de fibroblastes de patients, lesquelles ont ensuite été différenciées en une lignée neuronale. Un modèle HeLa a également été créé dans lequel l’expression de shRNAs dirigés contre la a-N-acétylglucosaminidase (NAGLU), l’enzyme manquante dans la MPSIIIB, est induite par la tétracycline. Ces modèles ont été isolés avec succès, et présentent les caractéristiques pathologiques fondamentales de la MPSIIIB. L’étude de ces modèles a montré que : I) Les OHS excrétés dans la matrice extracellulaire modifient la perception cellulaire des signaux environnementaux, affectant les voies de signalisation en aval avec des conséquences sur la morphologie du Golgi. II) L’accumulation de vésicules de stockage intracellulaires qui caractérisent les MSLs est due à la surexpression de la protéine cis-golgienne GM130 et aux altérations du Golgi qui en résultent. Ces vésicules sont possiblement des lysosomes anormaux formés dans le Golgi cis et médian qui sont déroutés à une étape précoce de la biogenèse du lysosome, donnant naissance à un compartiment « cul-de-sac ». III) D’autres fonctions cellulaires contrôlées par GM130 sont affectées dont la morphologie du centrosome ou la nucléation des microtubules. Ces données suggèrent de possibles conséquences sur la polarisation et la migration cellulaire, et la neuritogenèse. / Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) is a lysosomal storage disease (LSD) characterized by accumulation of heparan sulfate oligosaccharides (HSO), which results in progressive mental retardation, neurodegeneration and premature death in children. The underlying mechanisms are poorly understood. Coming to a better understanding of the pathophysiology of MPSIIIB has become a necessity to assess the efficacy of gene therapy treatment regarding loss of neuronal plasticity, and to define the best conditions for treatment. To address the link between HSO accumulation and downstream pathological events, new cell models of MPSIIIB were created. First, induced pluripotent stem cells (iPSc) were generated from fibroblasts of affected children, followed by differentiation of patient-derived iPSc into a neuronal progeny. Second, a HeLa cell model was created in which expression of shRNAs directed against a-N-acetylglucosaminidase (NAGLU), the deficient enzyme in MPSIIIB, is induced by tetracycline. Success in the isolation of these different models was pointed by the presence of cardinal features of MPSIIIB cell pathology. Studies in these models showed that: I) HSO excreted in the extracellular matrix modifies cell perception of environmental cues, affecting downstream signalling pathways with consequences on the Golgi morphology. II) Accumulation of intracellular storage vesicles, a hallmark of LSDs is due to overexpression of the cis-Golgi protein GM130 and subsequent Golgi alterations. It is likely that these vesicles are abnormal lysosomes formed in the cis- and medial-Golgi which are misrouted at an early step of lysosome biogenesis, giving rise to a dead-end compartment. III) Other cell functions controlled by GM130 are affected, including centrosome morphology and microtubule nucleation. These data point to possible consequences on cell polarization, cell migration and neuritogenesis.

L’Héparane Sulfate (HS) est un polysaccharide linéaire hautement sulfaté largement présent à la surface des cellules ou dans la matrice extracellulaire des tissus animaux. L’HS est l'un des polymères les plus hétérogènes et présente une alternance de domaines fortement sulfatés (S) et faiblement sulfatés (A). L'exposition à la surface cellulaire de ces domaines SAS permet d'établir des interactions spécifiques avec des protéines basiques présentant des topologies de charges complémentaires, permettant la régulation de leurs activités biologiques. CXCL12, une protéine de la famille des chimiokines se liant aux chaînes d’HS, est l'unique ligand naturel du récepteur CXCR4. La signalisation CXCL12/CXCR4 est impliquée dans divers processus biologiques dont l'hématopoïèse, la réponse immunitaire et la migration des cellules cancéreuses et leur prolifération. La conception de glycoligands pouvant se lier spécifiquement à CXCL12 pourrait permettre de moduler son interaction avec son récepteur et donner accès à une substance thérapeutique innovante pour le traitement de plusieurs types de cancer. Nous avons ainsi imaginé la construction d’un ligand tridentate symétrique comportant une partie centrale de type fragment d’HS synthétique (dp4) dont les extrémités réductrice (ER) et non réductrice (ENR) seraient reliées à des ligands capables d'occuper une partie du site de liaison à CXCR4.Grâce à de précédents travaux sur l'IFN-γ, une cytokine se liant aux chaînes HS, notre laboratoire a déjà démontré que la préparation de mimes de SAS pouvait être obtenue en reliant deux fragments d’HS synthétiques (domaines S) par leur ER via des bras espaceurs de type PEG et de longueur différente pour mimer les domaines A. Afin d’adapter cette stratégie à la préparation de neutraligands de CXCL12 et d’une nouvelle génération de mimes de SAS, ce programme doctoral visait (i) à établir une stratégie générale de modification de l’ER et l’ENR de fragments d’HS, (ii) à établir des conditions efficaces de réactions de couplage pour (iii) synthétiser des ligands de CXCL12 ainsi que de nouveaux mimes de SAS. Nous avons sélectionné deux réactions orthogonales de couplage dans le panel de Chimie Click, à savoir la formation de triazole «CuAAC» et la «ligation oxime». Afin de déterminer la faisabilité de transformation des deux extrémités de fragments d’HS pour réaliser ces réactions de couplage, nous avons optimisé les conditions de ces modifications sur un disaccharide modèle dérivé du cellobiose. Tout d’abord, en utilisant la procédure de couplage thiol-ène décrite par notre équipe, nous avons introduit une amine sur l'ER de ce disaccharide et optimisé les conditions d’une séquence monotope transfert de diazo/CuAAC permettant la conversion sélective de cette amine en azoture puis son couplage avec des alcynes vrais. Cette séquence a également pu être appliquée à des acides aminés libres pour la préparation de dérivés organofluorés. Ensuite, l'installation d'un motif aldéhyde sur l’ENR du composé modèle a été obtenue par une séquence en trois étapes comportant une allylation décarboxylante de type Tsuji-Trost de la position O-4 de l'unité NR, une dihydroxylation de l’éther d’allyle obtenu et enfin une coupure oxydante du diol formé. En plus d'explorer la sélectivité de la coupure oxydante en faveur de diols vicinaux acycliques en présence de diols cycliques portés par le squelette saccharidique, nous avons également optimisé les conditions de la réaction de formation d’oximes pour obtenir une seconde procédure monotpe de coupure oxydante/formation d’oxime pour la modification rapide de l’ENR de fragments d’HS. Cette stratégie de fonctionnalisation sélective de l’ER et l’ENR d’oligosaccharides a été implémentée dans notre voie actuelle de synthèse de fragments d’HS : elle a été appliquée de manière représentative à un fragment tétrasaccharidique d’HS qui permettra la préparation de neutraligands de CXCL12 et de mimes de SAS. / Heparan sulfate (HS) is a class of linear and highly sulfated polysaccharides widely present in animal tissues, onto the cell surface or into the extracellular matrix. HS is one of the most heterogeneous polymers and presents an alternation of highly sulfated domains (S domains) and weakly sulfated one (A domains). Exposition of those SAS domains at the cell surface permits the establishment of specific interactions with proteins displaying complementary charge topologies, leading to the regulation of their biological activities.CXCL12, a HS-binding protein, member of the chemokine family of pro-inflammatory mediators, is the unique natural ligand of CXCR4 receptor. CXCL12/CXCR4 signaling is involved in several biological processes, including hematopoiesis, immune response and cancer metastasis. The design of HS type ligands that could bind specifically to CXCL12 to block or modulate its interaction with its receptor should give access to therapeutic substance being able to modulate its activity and allow treatment of several cancer types. To this aim, we planed to construct a symmetric tridentate ligand of CXCL12 in which the reducing end (RE) and non-reducing end (NRE) of a short synthetic HS fragment (dp4) would be connected to ligands able to occupy part of the CXCR4 binding site. Thanks to previous investigation onto IFN-γ, a cytokine that binds tightly to HS chains, our lab already demonstrated that the preparation of SAS mimics should be reached by connecting two synthetic HS fragments (S domains) by their RE through a PEG-type spacer differing in length to mimic internal A domain. To adapt this strategy to the preparation of CXCL12 neutraligands and new type of SAS mimics, this PhD program aimed (i) to establish a general strategy of modification of the HS fragments RE and NRE, (ii) to setup efficient conditions of ligation reactions for (iii) the preparation of CXCL12 neutraligands as well as a second generation of SAS mimics. We selected our two orthogonal ligation reactions into the Click Chemistry panel: “the CuAAC” triazole formation and the “oxime ligation”. In order to setup the practicability of this strategy of transformation of the two HS fragments ends, we optimized reaction conditions onto model disaccharide derived from cellobiose. On one hand, by using thiol-ene coupling procedure reported by our lab, we introduced an amino group to the RE of this disaccharide and optimized reactions conditions of a one-pot diazotransfer reaction/CuAAC sequence, allowing the selective conversion of this amino group into azide and its coupling with alkyne derivatives. To demonstrate the robustness of this sequence, we applied it to the direct modification of free amino acids for the preparation of organofluorine derivatives. On the other hand, the installation of an aldehyde motif onto the NRE of the model compound was obtained via a three steps sequence involving a Tsuji-Trost decarboxylative allylation of the position O-4 of the NRE unit, dihydroxylation of the resulting allyl ether and finally oxidative cleavage of the formed diol. Besides exploring the possibility of the selectivity of the oxidative cleavage in favor of vicinal acyclic diols without affecting cyclic diols of the disaccharide backbone, we also optimized the reaction conditions of oxime ligation to obtain a second one-pot procedure of oxidative cleavage/oxime ligation for the rapid modification of the NRE of HS fragments. This strategy of functionalization of the RE and NRE of oligosaccharides was implemented into our current synthetic pathway of preparation of HS fragments: a tetrasaccharidic HS fragment was representatively modified using this strategy for the synthesis of CXCL12 neutraligands and SAS mimics.

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293. / With the aim to express a protein of interest, the transfer of exogenous genetic material into host cells was established in early 70s with the development of genetic engineering. Approximately ten years later, insulin was the first human recombinant protein (r-protein) produced at large scale in Escherichia coli and commercialized. Challenges associated with the production of more complex and glycosylated r-proteins brought the pharmaceutical industry to develop mammalian expression platforms. Thus, the expressed r-proteins are correctly folded and biologically actives. As a means to transfer genetic materials of interest into mammalian cells, the synthetic vector polyethylenimine (PEI) is probably the most popular due to its efficacy, ease of use, cost-effectiveness and stability in solution. Consequently, PEI is largely employed for the production of r-proteins by large scale and extensively studied in the context of non-viral gene therapy. PEI is capable to efficiently condense plasmid DNA (expression vector containing the gene of interest) to form small nanoparticles termed polyplexes. The latter must circumvent several steps to deliver the gene of interest to the cell nucleus. When formed at the optimum conditions, polyplexes exhibit a net positive charge which can interact electrostatically with negatively charged heparan sulfate proteoglycans (HSPG) located at the cell surface. There are two major families of HSPG that are largely expressed at the surface of mammalian cells: the syndecans (4 members, SDC1-4) and the glypicans (6 members, GPC1-6). Although it is generally accepted that HSPG are involved in the binding of polyplexes, their individual role toward polyplex binding and the subsequent phases of gene transfer need to be confirmed. Following optimization of the mammalian CHO and HEK293 cells transfection conditions, we undertook an in-depth study of polyplexes uptake, internalization kinetics, as well as transgene expression kinetics with the aim to better understand the mechanisms underlying gene transfer. We observed several contrasting differences between the two cell lines and the type of PEI used. Our results presented as a scientific article, establish strong basis of the gene transfer process over-time. Every cell type possesses its own expression profile of HSPG which can display individual potency toward gene transfer. Indeed, a preliminary study conducted in our laboratory showed that SDC1 and SDC2 have distinct features with regard to gene transfer. While both are capable to bind polyplexes at the cell surface, the expression of SDC1 enhances polyplexes internalization whereas the expression of SDC2 drastically inhibits it. Furthermore, when SDC1 is expressed at the surface of HEK293 cells, the transfection efficiency is increased by twelve percent compared to control cells. By using the ability of SDC1 to mediate efficient internalization of polyplexes, we have studied the intracellular traffic of SDC1 / polyplexes complexes. Our conclusions lead to new insights concerning the path by which polyplexes can mediate efficient transfection. In the context of gene transfer, HSPG have been essentially studied in their entirety. Although the role of syndecans is the subject of some studies, that of glypicans is unexplored. Thanks to a series of chemical and enzymatic treatments leading to « loss of functions », the importance of sulfation as post-translational modification, the effect of HS chains and of glypicans on the attachment, internalization of polyplexes as well as transgene expression were investigated in CHO and HEK293 cells. Taken together, our observations indicate clearly that the role of HSPG should be investigated individually instead of collectively. Consequently, the individual potency of each HSPG member regarding gene transfer remains to be defined. We demonstrated that, in fact, the transient expression of some HSPG in CHO cells have a beneficial effect on polyplexes uptake while others have a negative effect. Unfortunately, this method did not allow concluding about their effect on transfection efficacy. However, when present in the culture medium, the extracellular domain of HSPG decreases transfection efficacy of CHO cells without inducing polyplexes dissociation. Strangely, when each HSPG is stably expressed in CHO cells, only subtle modulations of the gene expression level were observed. This study contributed to a better understanding of the mechanisms underlying PEI mediated gene transfer in CHO and HEK293 cells and clarify the role of HSPG in gene transfer.

Les Héparanes sulfates (HS) appartiennent à la famille des glycosaminoglycanes (GAGs) qui sont des polysaccharides existants sur la surface cellulaire ou dans la matrice extracellulaire des cellules animales. Les GAGs jouent des rôles essentiels dans plusieurs processus biologiques via leurs interactions avec certaines protéines (chemokines, cytokines, facteurs de croissance, enzymes…) dont ils modulent les activités biologiques. Ils sont constitués par la répétition d’un motif disaccharidique de base comportant un acide uronique lié à un 2-amino-sucre. Une diversité moléculaire considérable provient de l’existence de divers motifs de O-et/ou N-sulfatation ainsi que de motifs d’épimérisation au niveau de l’acide uronique. Cette diversité qui est responsable d’interactions spécifiques de haute affinité avec différentes protéines serait due à l’action des différentes enzymes de biosynthèse. Ce travail de thèse vise à développer de nouvelles méthodologies nécessaires à la préparation d’une chimiothèque octasaccharidique de fragments d’HS, dans le but d’étudier la spécificité des enzymes de biosynthèse des HS et principalement la N-déacétylase N-sulfotransférase (NDST) et la C-5 épimérase. La chimiothèque octasaccharidique peut être obtenue à partir d’un seul octasaccharide dont les quatre atomes d’azote seraient protégés par des groupements protecteurs différents (octasaccharide « N-différencié »). La synthèse de cet octasaccharide constitue notre objectif principal.Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l’optimisation de la synthèse d’une brique disaccharidique impliquée dans la synthèse des fragments d’héparane sulfate. Dans cet objectif nous avons mis au point une méthode d’acétylation sélective de l’hydroxyle primaire, une méthode de benzylation compatible avec la présence à l’acétate et une procédure « one-pot » comportant quatre étapes de synthèse du disaccharide et facilitant l’accès au disaccharide avec 45 % de rendement global.Par la suite, nous avons optimisé la réaction de glycosylation entre les briques disaccharidiques en utilisant le donneur N-phényltrifluoroacétimidate, dans le but d’avoir une stéréosélectivité α maximale et d’améliorer le rendement de glycosylation. Les conditions optimisées ont permis l’accès au tétrasaccharide et à l’octasaccharide ayant les fonctions amines sous forme de groupements azido, avec un excellent rendement (95 %) et une bonne stéréosélectivité (96/4) en faveur de l’anomère α et sont reproductibles à grande échelle. La troisième partie était consacrée à une étude méthodologique afin de permettre la synthèse de l’octasaccharide « N-différencié » précurseur de la chimiothèque octasaccharidique. Dans ce but, nous avons choisi les groupements Fmoc, Alloc, pNZ et N3 comme groupements protecteurs des fonctions amines de l’octasaccharide. Nous avons préparé différents accepteurs ayant les fonctions amines protégées avec ces groupements afin d’étudier l’influence des différents groupements N-protecteurs de la fonction amine de l’accepteur sur la réaction de glycosylation. Les différents tétrasaccharides ont été obtenus avec d’excellents rendements (87–97 %) et une bonne stéréosélectivité (autour de 95/5 en faveur de l’anomère α). Enfin, nous avons effectué une étude de l’orthogonalité de la déprotection de ces groupements protecteurs (N3, Alloc, Fmoc et pNZ). Cette étude est essentielle avant la préparation de l’octasaccharide pour prouver la stratégie de la synthèse. En plus cette étude facilitera la préparation de la chimiothèque octasaccharidique une fois l’octasaccharide « N-différencié » préparé. / Heparan sulfate (HS), a highly sulfated glycosaminoglycan present in the extracellular matrix and at the cell surface, is known to play vital functional roles in various biological processes due to its interactions with proteins (chemokines, cytokines, growth factors, enzymes ...). HS consist of a repeating disaccharide unit, composed of a glucosamine and a hexuronic acid (glucuronic acid or its C5 epimer, iduronic acid).The HS chains are further modified by some epimerases and sulfotransferases during their biosynthesis. These sulfation/epimerization patterns provide considerable complexity. These modifications are required for interaction with many protein ligands.This thesis aims to develop new methodologies for the preparation of a library of octasaccharides, HS fragments, in order to study the specificity of HS biosynthesis enzymes, mainly N-deacetylase N-sulfotransferase (NDST) and the C-5 epimerase. The library can be obtained starting from a single octasaccharide whose four nitrogen atoms are protected by various protecting groups (octasaccharide N-differentiated). The synthesis of this octasaccharide is our main goal.We are interested in first to optimize the synthesis of a fully protected disaccharide which is used as building block in our heparan sulfate fragments synthesis. For this purpose we have developed a regioselective acetylation method of a disaccharide bearing three hydroxyl groups using a temporary protection, a benzylation method compatible with the presence of one acetate group using silver oxide and a one-pot procedure incorporating up to four steps, reducing work-up and time-consuming purifications. In the second chapter, we optimized the glycosylation reaction between two disaccharides using the N- phényltrifluoroacétimidate donor in order to have good α stereoselectivity and yield. We are now able to obtain the tetrasaccharide and the octasaccharide with 95 % yield and (α/β : 96/4) stereoselectivity.The third part was devoted to the methodological study to obtain the N-differentiated octasaccharide, precursor of a octasaccharides library. For this purpose, we chose Fmoc, Alloc, pNZ and N3 as protecting groups of the amine groups. We have prepared various acceptors with these different protecting groups in order to study them in glycosylation reactions. The tetrasaccharides were obtained with excellent yields (87-97%) and good stereoselectivity (around 95/5 for the α anomer) with the four protecting groups. Finally, we conducted a study to deprotect these protecting groups (N3, Alloc, Fmoc and pNZ) on the tetrasaccharides. This study is essential before preparing the octasaccharide as a proof of the synthesis strategy. In addition this study will facilitate the preparation of the octasaccharides library once the N-differentiated octasaccharide prepared.

L'objectif de cette thèse est le développement d'une langue électronique avec une méthode simplifiée d'obtention de récepteurs à réactivité croisée. Ces récepteurs sont préparés par une approche combinatoire novatrice qui consiste au mélange et à l'auto-assemblage de deux disaccharides. Le couplage de ces récepteurs avec un système de détection d'imagerie par résonance des plasmons de surface nous a permis de réaliser une langue électronique capable de différencier des échantillons de différentes complexités, y compris des protéines pures et des mélanges complexes. Cela se fait grâce aux profils et images d'évolution continue, assimilés à des « empreintes digitales » des échantillons. D'un autre côté, ce système peut être utilisé en tant qu'outil pour la conception de surfaces biomimétiques 2D et 3D. Ce système est prometteur pour l'étude des interactions sucre-protéine et pour la préparation de nanovecteurs biomimétiques qui ciblent de façon spécifique des protéines d'intérêt. / L'objectif de cette thèse est le développement d'une langue électronique avec une méthode simplifiée d'obtention de récepteurs à réactivité croisée. Ces récepteurs sont préparés par une approche combinatoire novatrice qui consiste au mélange et à l'auto-assemblage de deux disaccharides. Le couplage de ces récepteurs avec un système de détection d'imagerie par résonance des plasmons de surface nous a permis de réaliser une langue électronique capable de différencier des échantillons de différentes complexités, y compris des protéines pures et des mélanges complexes. Cela se fait grâce aux profils et images d'évolution continue, assimilés à des « empreintes digitales » des échantillons. D'un autre côté, ce système peut être utilisé en tant qu'outil pour la conception de surfaces biomimétiques 2D et 3D. Ce système est prometteur pour l'étude des interactions sucre-protéine et pour la préparation de nanovecteurs biomimétiques qui ciblent de façon spécifique des protéines d'intérêt.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune d’origine inconnue qui est caractérisée par des atteintes vasculaires, des dérèglements cellulaire et immunitaire. La majorité des patients atteints de ScS possède des auto-anticorps dirigés contre des protéines nucléaires. Ces auto-anticorps sont associés à des manifestations cliniques spécifiques favorisant la classification et le diagnostic de la ScS. Les anti-ADN topoisomérase I (antitopo) sont l’un des principaux auto-anticorps retrouvés dans la ScS. Ils sont associés à la forme la plus grave de la maladie, soit la forme diffuse. Celle-ci se caractérise par une importante fibrose progressant vers une atteinte viscérale. La fibrose résulte d’une production excessive et dérégulée de matrice extracellulaire par les fibroblastes. Bien que les anti-topo soient associés à un très mauvais pronostic et qu’ils corrèlent avec l’activité et la sévérité de la maladie, leur rôle dans la pathogenèse de la ScS n’est pas élucidé. Toutefois, depuis que certains auto-antigènes ont démontré des fonctions additionnelles lorsque retrouvés dans le milieu extracellulaire, leur contribution suscite un intérêt marqué. En effet, ces auto-antigènes, dits bifonctionnels, influencent la physiologie de certaines cellules en se liant à leur surface. Ainsi, la détermination du rôle de ces autoantigènes ouvre la voie pour l’exploration du rôle potentiellement pathogène de leurs autoanticorps. Tout d’abord, nous avons démontré que l’auto-antigène topo, ciblée par les antitopo, pouvait influencer la physiologie du fibroblaste suite à l’activation de voies de signalisations intracellulaires stimulant la migration cellulaire. Nos résultats suggèrent fortement que la topo stimule le fibroblaste suite à son interaction avec le CCR7, un récepteur de chimiokine, présent à sa surface. Nous avons également démontré que la topo utilisait les protéoglycans à chaînes d’héparanes sulfates (HSPG) à titre de corécepteurs. Il avait été démontré que la topo liée à la surface des fibroblastes entraînait le recrutement d’anti-topo, l’adhésion et l’activation monocytaires. Nous avons ici démontré que la présence d’anticorps anti-topo entraîne l’amplification de la liaison de la topo au niveau des HSPG. De ce fait, le complexe immun à la surface des fibroblastes pourrait contribuer à l’initiation d’une cascade inflammatoire propice au développement d’une fibrose, caractéristique de la ScS. En dernier lieu, nos résultats nous ont permis de suggérer l’utilisation de l’héparine et des héparines de bas poids moléculaires comme approche thérapeutique pour la ScS puisqu’elles permettent autant de prévenir la liaison du complexe immun topo/anti-topo au niveau des HSPG que de le dissocier une fois lié. En résumé, notre étude soutient d’abord le rôle actif de l’auto-antigène dans la physiologie des fibroblastes mais également le rôle pathogène des anti-topo en présence de la topo dans la ScS. Finalement, les résultats de notre étude permettent de proposer une approche thérapeutique potentielle pour inhiber le développement d’une cascade inflammatoire et pro-fibrotique. / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease of unknown etiology characterized by vascular damage, cellular and immunological disorders. The vast majority of patient sera are characterized by the presence of autoantibodies directed against nuclear proteins. The autoantibodies are associated with specific clinical manifestations and thus useful for diagnostic and classification of the disease. One of the major autoantibody groups are the anti-DNA topoisomerase I (anti-topo). They are associated with the diffuse form of the disease which is characterized by extensive cutaneous and visceral fibrosis. Increased extracellular matrix synthesis and deposition by fibroblast result in the development of fibrosis. Although anti-topo are associated with the worst form of the disease, correlated with the activity and the severity of SSc, their exact role in the pathogenesis of SSc is controversial and still unravelled. On the other hand, there is now strong evidence for active contribution of autoantigens, targeted by autoantibodies, in autoimmune diseases. Indeed, numerous cells have been shown to be influenced by the interaction of autoantigens with their cognate receptors present on their surface. These autoantigens display cytokine-like effects toward their target cell and are called bifunctional autoantigen. Hence, determination of the exact role of these autoantigens and characterization of their interaction with their target cell may open up research perspectives for the elucidation of the potential pathogenic role of their autoantibodies. In our study, we demonstrated that topo activates intracellular signaling pathways leading to the stimulation of fibroblast migration. We undertook experiments to characterize the interaction of the autoantigen topo with fibroblasts responsible of these cellular effects. Our results strongly suggest a direct interaction of topo with CCR7, a chemokine receptor, present on the surface of fibroblasts. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG), abundantly present on fibroblast surfaces, were found to act as coreceptors for topo binding. Previous work has demonstrated that once bound to fibroblast surfaces, topo recruits anti-topo autoantibodies, which subsequently lead to adhesion and activation of monocytes. Here, we demonstrated that anti-topo autoantibodies from SSc sera lead to the amplification of topo binding to HSPG on fibroblast surfaces. The binding of topo/anti-topo IC could mediate the initiation and maintenance of an inflammatory cascade and further fibrosis development. Hence, perturbing the binding of topo/anti-topo immune complexes to HSPG became an interesting therapeutic approach. Heparin and low molecular weight heparins were found to prevent the binding of topo and topo/anti-topo immune complexes to the fibroblast surfaces. Moreover, topo/anti-topo immune complexes could be dissociated from fibroblast surfaces by these molecules. Hence, the prevention of topo/anti-topo immune complexes binding to HS chains could result in the absence of the inflammatory cascade initiation. Overall, our results support an active role for topo as a bifunctional autoantigen toward fibroblasts and a pathogenic role for anti-topo autoantibodies in SSc. Finally, a potential therapeutic approach is proposed which could target inflammatory and fibrotic development characteristic of SSc.