Η Νουκλεολίνη είναι μια πρωτεΐνη που λειτουργεί ως υποδοχέας για διάφορα μόρια, όπως αυξητικοί παράγοντες, μόρια κυτταρικής προσκόλλησης, ακόμα και ιοί (HIV, coxsackie B, κ.ά.), που εμπλέκονται σε παθοφυσιολογικές διεργασίες. Συμμετέχει στις διαδικασίες της ογκογένεσης και της αγγειογένεσης και ανιχνεύεται στον πυρήνα, το κυτταρόπλασμα των κυττάρων, καθώς επίσης και στην επιφάνεια καρκινικών και μιτωτικά ενεργών ενδοθηλιακών κυττάρων. Το συνθετικό πεπτίδιο ΗΒ‐19 συνδέεται στη Νουκλεολίνη της επιφάνειας και καταστέλλει την ογκογένεση, αλλά και την αγγειογένεση Η ερευνητική ομάδα του εργαστηρίου έδειξε, σε προηγούμενες εργασίες, ότι το ΗΒ‐19 καταστέλλει την in vivo αγγειογένεση στο μοντέλο μελέτης της CAM σε έμβρυο όρνιθας. Βρέθηκε, ακόμη, ότι καταστέλλει την in vitro προσκόλληση, μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των HUVEC, χωρίς να προκαλεί την απόπτωσή τους. Οι βιολογικές δράσεις αυτές φαίνεται να διαμεσολαβούνται και από τις κινάσες Src, ERK1/2, Akt και FAK, αφού παρατηρήθηκε ότι το ΗΒ‐19 καταστέλλει την ενεργοποίησή τους στα κύτταρα αυτά. Προκειμένου να διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο το ΗΒ‐19 ασκεί τις βιολογικές του δράσεις, καθώς επίσης και η συμμετοχή της Νουκλεολίνης στη διαδικασία αυτή, HUVEC υπέστησαν παροδικό μετασχηματισμό με χρήση siRNA που στοχεύει το mRNA της Νουκλεολίνης. Η αποσιώπηση της Νουκλεολίνης εμπόδισε την κατασταλτική δράση του ΗΒ‐19 στον πολλαπλασιασμό και την προσκόλληση των HUVEC και, από το ίδιο πείραμα, φάνηκε ότι η Νουκλεολίνη είναι ένα κομβικό μόριο, καθώς η αποσιώπησή της ήταν από μόνη της ικανή να καταστείλει τις παραπάνω λειτουργίες. Για να επιβεβαιωθεί ότι η μεταγωγή σήματος του ΗΒ‐19 ενεργοποιείται από την αλληλεπίδρασή του με τη Νουκλεολίνη, μελετήθηκαν οι επιπτώσεις του στην ενεργοποίηση των κινασών Src και ERK1/2, σε παροδικά μετασχηματισμένα (με siRNA για Νουκλεολίνη) HUVEC.Παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης των κινασών αυτών στα μετασχηματισμένα κύτταρα, συγκριτικά με τα φυσιολογικά. Ακόμη, η αποσιώπηση της Νουκλεολίνης εμπόδισε το ΗΒ‐19 να ασκήσει την κατασταλτική του δράση στη φωσφορυλίωσή τους. Συνοψίζοντας τα παραπάνω αποτελέσματα, φαίνεται ότι η αλληλεπίδραση του ΗΒ‐19 με τη Νουκλεολίνη πυροδοτεί οδούς μεταγωγής σήματος που μειώνουν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των Src και ERK1/2 και προκαλούν την καταστολή της προσκόλλησης και του πολλαπλασιασμού των HUVEC. Λαμβάνοντας υπ' όψιν και την υπάρχουσα βιβλιογραφία, φαίνεται πως το ΗΒ‐19 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην αντικαρκινική θεραπεία ως μέρος μιας στρατηγικής με στόχο τη Νουκλεολίνη. / Nucleolin is a protein serving as a receptor for various ligands such as growth factors, cell adhesion molecules and viruses (e.g. HIV, coxsackie B), implicated in pathophysiological processes. It is overexpressed on the surface of tumour and mitotic endothelial cells and recent studies have demonstrated its involvement in tumour growth and angiogenesis. The synthetic peptide HB‐19 binds to the cell surface expressed Nucleolin and inhibits tumour growth and angiogenesis as well. The lab group has shown, in previous projects, that HB‐19 inhibits in vivo angiogenesis in the chicken embryo CAM assay. Evidence has been provided, in addition, that HB‐19 inhibits the in vitro adhesion, proliferation and migration of HUVEC, while not inducing their apoptosis. The aforementioned biological actions seem to be regulated by Src, ERK1/2, Akt and FAK kinases, as HB‐19 was found to inhibit their activation in HUVEC. In order to investigate the mechanism through which HB‐19 exerts the above described actions, as well as the involvement of cell‐surface Nucleolin in them, HUVEC were transiently transfected using siRNA targeting the mRNA of Nucleolin. The inhibitory effect of HB‐19 in cell proliferation and adhesion was blocked by the knockdown of Nucleolin and, as was shown by the same experiment, Nucleolin is a crucial factor to HUVEC proliferation and adhesion, since both processes were inhibited by the down‐regulation of Nucleolin expression. In order to confirm that HB‐19 signaling is activated by its reaction with Nucleolin, its effect on the activation of Src and ERK1/2 was tested on transiently transfected HUVEC (using siRNA for Nucleolin). A decrease in phosphorylation levels of Src and ERK1/2 was induced on the transfected cells, compared to wild type cells. Furthermore, Nucleolin knockdown blocked HB‐19‐induced Src and ERK1/2 inactivation. In conclusion, these results indicate that HB‐19's interaction with Nucleolin triggers a signal transduction pathway that reduces the phosphorylation levels of Src and ERK1/2 and causes inhibition of HUVEC proliferation and adhesion. Thereof, HB‐19 could constitute a potentially interesting tool for tumour therapy, as part of a Nucleolin targeting strategy.

H νουκλεολίνη είναι μια πρωτεΐνη μοριακού βάρους 110 kDa και απαντάται στον πυρήνα, το κυτταρόπλασμα αλλά και στην επιφάνεια των κυττάρων, ενώ υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα και σε ενεργά ενδοθηλιακά κύτταρα. Πρόσφατες έρευνες υποδεικνύουν την συμμετοχή της στις διαδικασίες ανάπτυξης καρκινικών όγκων και στην αγγειογένεση. Στην επιφάνεια του κυττάρου δρα ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας αυξητικών παραγόντων, μορίων κυτταρικής προσκόλλησης (ιντεγκρίνες και σελεκτίνες) λιποπρωτεϊνών και ορισμένων ιών (HIV-1 και coxsackie B). Παρουσιάζει πλήθος λειτουργιών, αλληλεπιδρώντας τόσο με πρωτεΐνες, όσο και με νουκλεϊνικά οξέα. Το HB-19 και το Ν6L είναι συνθετικά πεπτίδια που προσδένονται στην νουκλεολίνη της κυτταρικής επιφάνειας και καταστέλλουν τόσο την ανάπτυξη καρκίνου όσο και την αγγειογένεση. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε την βιολογική δράση των πεπτιδίων αυτών και βρέθηκε ότι αναστέλλουν τον in vitro πολλαπλασιασμό και την in vitro προσκόλληση των κυττάρων HUVEC. Τα πεπτίδια αυτά παρουσιάζουν in vivo ογκοκατασταλτική δράση και βρέθηκε να αναστέλλουν την αγγειογένεση στο σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας. Επίσης αναστέλλουν τη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC στο in vitro σύστημα μελέτης της μετανάστευσης Boyden chamber. Το πεπτίδιο HB-19 αναστέλλει την έκφραση διαφόρων αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων όπως ο FGF, VEGF και των υποδοχέων τους σε επίπεδο mRNA. Το HB-19, όπως και το Ν6L επηρεάζουν την έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης MMP-2 τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο έκφρασης γονιδίου. Επιπλέον, κανένα από τα δύο πεπτίδια δεν προκαλεί απόπτωση in vitro στα κύτταρα HUVEC. Τα πεπτίδια HB-19 και Ν6L δεσμεύονται στη νουκλεολίνη της επιφάνειας του κυττάρου και φαίνεται ότι για την άσκηση των βιολογικών τους δράσεων διαμεσολαβούν οι κινάσες SRC, ERK1/2, AKT και FAK καθώς αναστέλλουν την ενεργοποίησή τους σε κύτταρα HUVEC. Τέλος, μείωση της έκφρασης της νουκλεολίνης με χρήση siRNA επιβεβαίωσε τον ρόλο της νουκλεολίνης στην βιολογική δράση των πεπτιδίων HB-19 και N6L. Συνοψίζοντας τα παραπάνω αποτελέσματα, φαίνεται ότι τόσο το HB-19 όσο και το Ν6L εμφανίζουν βιολογικές δράσεις που τα καθιστούν υποψήφια μόρια για αντινεοπλασματική χρήση. / Nucleolin is a 110 kDa protein, located in the nucleus and the cytoplasm while it is over expressed on the surface of tumor and endothelial cells. Recent studies have demonstrated the involvement of nucleolin in tumor growth and angiogenesis. Thus, this cell surface molecule serves as a receptor for various ligands implicated in pathophysiological processes such as growth factors, cell adhesion molecules (integrins and selectins), laminin-1, lipoproteins and viruses (HIV and coxsackie B). HB-19 and N6L are synthetic peptides that bind cell surface expressed nucleolin and inhibit both tumor growth and angiogenesis. In the present work, we investigated the biological actions of peptides HB-19 and N6L. Our results show that both peptides inhibit the in vivo angiogenesis on the chicken embryo CAM assay and inhibit the in vitro adhesion, proliferation, migration and motility of HUVEC cells. HB-19 peptide inhibits the expression of growth factors FGF and VEGF mRNA as well as the expression of their receptors FGFR1 and FLT-1 respectively. We also found that both enzyme activity and expression of MMP-2 was inhibited by HB-19 and N6L. Furthermore, we found that HB-19 and N6L treatment shows no toxicity in HUVEC cells in vitro. The above biological actions seem to be regulated by SRC, ERK1/2, AKT and FAK kinases as we found that HB-19, as well as N6L, inhibit their activation in HUVEC cells. Finally, down regulation of nucleolin using siRNA confirmed the implication of nucleolin in the biological actions of these peptides. Taken all the above results into account, it is indicated that HB-19 and N6L could constitute an interesting tool for tumor therapy strategy targeting nucleolin.

La recherche contre le cancer est aujourd’hui tournée vers les thérapies ciblées. Dans ce contexte, la nucléoline et la nucléophosmine sont fortement impliquées dans la croissance tumorale et l’angiogenèse associée et surexprimées dans les cellules tumorales et endothéliales activées. Elles apparaissent donc comme des cibles de choix. Le pseudopeptide HB-19 lie la nucléoline de surface, inhibe la croissance cellulaire de nombreuses lignées de cellules tumorales et induit la mort de ces cellules tumorales par apoptose. D’autre part, il inhibe, in vitro et in vivo, plusieurs étapes de l’angiogenèse tumorale. Ces deux activités mènent, in vivo, à l’inhibition de la croissance tumorale dans de nombreux modèles de croissance tumorale chez la souris. Dans le but d’améliorer les activités observées avec HB- 19, des pseudopeptides dérivés de ce dernier ont été synthétisés. Ainsi le NucAnt 6L (N6L) montre une activité 5 à 10 fois supérieure à celle de HB-19 selon les modèles. Son activité anti-métastatique a également été démontrée. L’étude du mécanisme d’action des pseudopeptides a permis d’identifier deux nouveaux récepteurs: les héparanes sulfates et la nucléophosmine. L’importance du TIMP-3 dans son activité anti-métastatique a également été soulignée. Enfin, aucune toxicité n’a été observée chez les souris aux doses employées et la synthèse de N6L peut être effectuée à l’échelle industrielle. N6L apparaît donc comme un composé prometteur pour une thérapie anti-cancéreuse / The cancer research is nowadays interested in targeting therapies. In this context, nucleolin and nucleophosmin are proteins highly involved in tumor growth and angiogenesis and over-expressed in activated endothelial and tumor cells. So, they appear as very promising targets. The pseudopeptide HB-19 binds to cell surface-expressed nucleolin, inhibits different tumor cell growth and induces cell death by apoptosis. Furthermore, it inhibits, in vitro and in vivo, several steps of angiogenesis. These two activities lead, in vivo, to the suppression of tumor growth and angiogenesis in several mice models. In order to improve the activities observed with HB-19, new compounds derived from HB-19 were synthesized. So, NucAnt 6L (N6L) show 5 to 10 fold stronger anti-tumoral activity than HB- 19 depending of the model. Study of their action mechanism allowed us to identify two new receptors: nucleophosmin and heparan sulfates. The importance of TIMP-3 in anti-metastatic activity has also been highlighted. Finally, no toxicity has been observed in mice treated with N6L which can easily industrially be synthesized. N6L appears to be a promising compound for anti-cancer therapies