The synthesis and characterisation of novel bisnaphthalimidopropyl polyamine (BNIPP) derivatives, has gained pace over the last couple of years, as they have enhanced aqueous solubility, without loss of biological activity, in contrast to parent bisnaphthalimide derivatives. Recent work has shown that bisnaphthalimidopropyl spermidine (BNIPSpd) bis-intercalates to DNA, induces oxidative DNA damage, depletes polyamine levels and causes cell death, by apoptosis, in human colon cancer CaCO-2 and HT-29 cells. The aim of this thesis was to synthesise new BNIPP derivatives to highlight the important structural features required for biological activity, particularly, bisnaphthalimidopropyl functionality, and investigate their subsequent modes of action in breast cancer MDA-MB-231 and breast epithelial MCF-10A cells. Initially, work focused on determining the DNA binding affinities and biological activity of BNIPP derivatives. All BNIPP derivatives, except bisphthalimidopropyl diaminodecane (BPHPDadec) and mononaphthalimidopropylamine (NPA) (Δ Tm values of 15.8 and 10.2 °C, respectively, C50 values of > 10 μM, IC50 values of > 40 μM), exhibited strong DNA binding affinities and cytotoxic properties in both cell lines. Results indicate that BNIPP derivatives interact with DNA by bis-intercalation suggesting, therefore, that BNIPP derivatives target DNA. For the first time, an investigation into the mechanism of cellular entry, via the polyamine transport (PAT) system, was studied. However, none of the BNIPP derivatives utilised the MGBG-specific PAT system, suggesting that BNIPP derivatives utilise other modes of cellular entry. Two BNIPP derivatives, BNIPSpd and BNIPDaCHM, were further investigated, and results show that these derivatives significantly induced a dose dependent increase in DNA strand breaks from ≥ 0.1 μM, after 4 hours. BNIPSpd and BNIPDaCHM (at non toxic concentrations) also inhibited the repair of oxidative (H2O2) and methylative (MMS)-induced DNA strand breaks. Based on phosphatidylserine exposure and membrane integrity analyses, early apoptotic cell death was determined as a mode of cell death utilised by both BNIPSpd and BNIPDaCHM (5 μM), after only 0.5 hours treatment in MDA-MB-231 cells. Interestingly, BNIPDaCHM was identified, using HDAC assay kits, as a potent and selective SIRT2 enzyme inhibitor, thus, identifying, a novel structural backbone for the selective inhibition of HDAC enzymes.

Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un rétrovirus B-lymphotrope qui a été identifié comme l’agent étiologique de la leucose bovine enzootique. L’infection par le BLV se caractérise par l’absence de virémie due à la latence du virus dans la majorité des cellules infectées. Cette latence résulte de la répression transcriptionnelle du provirus in vivo; elle favorise très probablement le développement tumoral en permettant aux cellules infectées d’échapper au système immunitaire de l’hôte. Cependant, la transcription du BLV peut être activée de manière rapide et très efficace par la protéine virale TaxBLV. La trans-activation par TaxBLV joue un rôle crucial dans la pathogenèse associée au BLV car elle permet la production de nouvelles particules virales nécessaires à la propagation du virus. Au cours de notre travail de thèse, nous avons étudié différents mécanismes impliqués au cours de ces deux phases clés (latence et trans-activation par TaxBLV) de l’expression du BLV. Le promoteur unique de la transcription du BLV se situe à l’extrémité 5’ du génome proviral, dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) composée des régions U3, R et U5. Les mécanismes impliqués dans la trans-activation du LTR 5’ par TaxBLV sont encore mal connus. La trans-activation du LTR 5’ du BLV par TaxBLV requiert la présence de trois répétitions imparfaites de 21pb (TxREs pour Tax Responsive Elements) agissant en cis et situées dans la région U3. Chacune des TxREs possède dans sa partie centrale un motif imparfait de 8 nucléotides correspondant au site de liaison des protéines de la famille CREB/ATF (sites CREs pour cAMP-Responsive Element). Des expériences de retard de migration sur gel ont montré que les protéines CREB, ATF-1 et ATF-2 lient les CREs viraux in vitro. Comme TaxBLV ne semble pas capable de lier directement l’ADN du LTR, il a été suggéré que les facteurs CREB/ATF serviraient de médiateurs de la trans-activation par TaxBLV. De plus, il a également été suggéré au cours de ces dernières années que les facteurs de transcription CREB/ATF jouent aussi un rôle essentiel en l’absence de TaxBLV lors de l’initiation de la transcription virale. CREB/ATF sont connus pour recruter les co-activateurs CBP/p300 qui possèdent une activité histone-acétyltransférase, suggérant qu’à l’instar d’autres rétrovirus tels que HIV-I ou HTLV-I, l’acétylation protéique pourrait jouer un rôle important dans la régulation de la transcription du BLV. Au cours de la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence un synergisme transcriptionnel entre TaxBLV et les inhibiteurs de désacétylases TSA et NaBut, indiquant que l’acétylation protéique joue un rôle important dans la trans-activation par TaxBLV. Nous avons ensuite montré que ni TaxBLV, ni son médiateur CREB ne sont acétylés in vivo au niveau d’un résidu lysine interne, mais que la TSA synergise avec TaxBLV via un mécanisme indirect, sensible à l’inhibition de la synthèse protéique. Fonctionnellement, CREB/ATF semblent jouer un rôle crucial dans le synergisme TaxBLV/TSA car la mutation des CREs viraux ou la sur-expression d’un dominant négatif CREB inhibent ce synergisme. Des expériences de gel retard et de ChIP ont démontré, in vitro et in vivo, que les inhibiteurs de désacétylases augmentent la liaison des facteurs CREB/ATF aux TxREs. Nos résultats suggèrent donc que le synergisme TaxBLV/TSA serait dû à une augmentation de la trans-activation par TaxBLV observée suite à l’augmentation, induite par la TSA, du recrutement de CREB/ATF au niveau des TxREs. CREB/ATF appartiennent à la famille des facteurs de transcription CREB/CREM/ATF agissant au niveau des promoteurs contenant des éléments CREs. Cependant, la liaison de CREM aux CREs imparfaits du LTR du BLV n’a jamais été étudiée. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons montré que des isoformes du gène CREM sont exprimées dans des PBMCs isolés à partir d’un mouton infecté par le BLV et que ces protéines CREM sont capables de lier in vitro et in vivo le promoteur du BLV, via les motifs CREs présents au centre de chacune des TxREs. Des analyses fonctionnelles ont ensuite montré qu’en l’absence de TaxBLV, la surexpression de l’isoforme activatrice CREMt induit la transcription dirigée par le LTR 5’ du BLV. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que CREMt serait capable d’activer la transcription du BLV en réponse à l’activation des cellules B infectées, via la phosphorylation de la sérine 117 de CREMt et via le recrutement par CREMt des co-activateurs CBP/p300. CREMt serait donc impliqué dans les stades précoces de l’initiation de la transcription du BLV. Cependant, nous avons montré que CREMt n’est pas impliqué dans les stades tardifs de l’expression virale puisqu’il ne semble pas capable d’induire la trans-activation par TaxBLV. Au contraire, nous avons montré par des expériences de compétition que CREMt diminue la trans-activation par TaxBLV lorsque celle-ci est induite par CREB, probablement en entrant en compétition avec CREB pour la liaison au niveau des TxREs. L’expression du gène CREM est régulée transcriptionnellement et post-transcriptionnellement et mène à la production de différentes isoformes capables d’agir comme des activateurs ou des répresseurs de la transcription. Des expériences de RT-PCR nous ont permis de mettre en évidence la présence d’isoformes répressives ICER dans les cellules YR2 infectées par le BLV. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons montré qu’ICER est capable de réprimer la trans-activation par TaxBLV, suggérant qu’ICER retarderait la trans-activation par TaxBLV afin d’échapper au système immunitaire de l’hôte infecté jusqu’à ce qu’un niveau suffisant du trans-activateur TaxBLV soit produit.

Breast cancer is the most commonly occurring cancer in women, with incidence rates approaching 1.38 million cases per year worldwide. Over the last few decades, there have been numerous attempts to develop, synthesise and advance into the clinic novel and selective breast cancer therapies. Research work has shown that bisnaphthalimidopropyl diaminodicyclohexylmethane (BNIPDaCHM) exerts potent in vitro anti-cancer activities and strong DNA binding properties. The aim of this thesis was to synthetise novel bisnaphthalimidopropyl derivatives (BNIPs) and investigate their subsequent modes of action within two human metastatic breast cancer cell lines, MDA-MB-231 and SKBR-3. A series of novel BNIPs, bisnaphthalimidopropyl-piperidylpropane (BNIPPiProp), bisnaphthalimidopropyl- ethylenedipiperidine (BNIPPiEth) and (trans(trans))-4,4’-methylenebis-cyclohexylamine (trans,trans-BNIPDaCHM) were synthesised, characterised and studied in comparison to BNIPDaCHM for their DNA binding and anti-cancer activities against MDA-MB-231 and SKBR-3 cells. Thermal denaturation studies have shown that BNIPs can intercalate and stabilize the double helix of Calf Thymus, each BNIP can competitively displace EtBr from DNA in a dose dependent manner and by UV binding studies, high affinity was found for the three novel BNIPs. After 24 hours treatment, all novel BNIPs, exhibited strong cytotoxicity with IC50 values ranging from 1.4 μM to 3.3 μM in MDA-MB-231 cells and 0.2 - 0.7 μM in SKBR-3 cells, confirming the importance of bisnaphthalimidopropyl functionality. BNIPs were also found to increase intracellular ROS levels after 8 hours treatment and induce a significant increase in DNA strand breaks compared to endogenous levels, after 24 hour treatment in both cell lines. After cell synchronisation, cell cycle distribution was studied, revealing that trans,trans-BNIPDaCHM induces sub-G1 cell population arrest in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells, after 24 hours treatment. In addition, BNIPs induced apoptotic phosphatidylserine exposure, after 0.5 hours treatment, inhibited Caspase-3 activity and increased autophagy, after 24 hour treatment in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells. Moreover, BNIPs inhibited histone deacetylases (HDAC) activity after 24 hours treatment in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells and BNIPDaCHM was identified as a potential SIRT2 inhibitor, in SKBR-3 cells. According to Proteome Profiler Arrays, BNIPDaCHM and BNIPPiEth altered the expression of cell stress-related proteins in a cell dependent manner and bioinformatic analysis revealed two novel, putative pathways for BNIP-induced oxidative stress-mediated cell death in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells. The above findings indicate that BNIPs represent promising candidates for future breast cancer studies and cancer treatment.

Melatonin is an indoleamine hormone with neuromodulatory and neuroprotective properties. It mediates many of its effects by its two G protein-coupled receptors, MT1 and MT2. We have shown that valproic acid (VPA) induces melatonin receptor expression in cultured rat C6 glioma cells, and in the rat hippocampus. VPA is known to affect gene expression through several mechanisms, including the modulation of intracellular kinase pathways and/or transcription factors, as well as the inhibition of histone deacetylase (HDAC) activity. In this study, we show that HDAC inhibitors of distinct chemical classifications, including suberanilohydroxamic acid (SAHA) and 4-(dimethylamino)-n-[7-(hydroxyamino)-7-oxoheptyl] benzamide (M344), parallel the effects of VPA on MT1 induction in vitro. However valpromide, a VPA analogue that lacks the ability to inhibit HDAC activity, does not. The observed increase in MT1 expression by VPA is matched by an increase in global histone H3 acetylation. More importantly, an enrichment of histone H3 acetylation occurs along the rat MT1 promoter following treatment with VPA, indicating that histone acetylation and chromatin remodelling are a primary mechanism underlying this induction. Independent of VPA, the rat MT1 gene may be regulated by a number of intracellular kinase pathways and transcription factors, which are also targeted by VPA. KG501-mediated CREB inhibition did not block MT1 upregulation by VPA. Blockade experiments targeting the PKC, PI3K/AKT, or GSK3β signaling pathways suggest that VPA induces melatonin receptor expression independent of these intracellular signaling cascades as well. The relevance of melatonin receptor upregulation was assessed using in vivo VPA and melatonin combination treatments on neuroprotective gene expression. The results of this study provide evidence that expression of the melatonin receptor is epigenetically induced by VPA by means of promoter histone acetylation. Melatonin receptor upregulation by VPA, or other HDAC inhibitors, may represent a therapeutic strategy for the management of several nervous system disorders. / Dissertation / Doctor of Philosophy (PhD)

No description available.

Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un rétrovirus B-lymphotrope qui a été identifié comme l’agent étiologique de la leucose bovine enzootique. L’infection par le BLV se caractérise par l’absence de virémie due à la latence du virus dans la majorité des cellules infectées. Cette latence résulte de la répression transcriptionnelle du provirus in vivo; elle favorise très probablement le développement tumoral en permettant aux cellules infectées d’échapper au système immunitaire de l’hôte. Cependant, la transcription du BLV peut être activée de manière rapide et très efficace par la protéine virale TaxBLV. La trans-activation par TaxBLV joue un rôle crucial dans la pathogenèse associée au BLV car elle permet la production de nouvelles particules virales nécessaires à la propagation du virus. Au cours de notre travail de thèse, nous avons étudié différents mécanismes impliqués au cours de ces deux phases clés (latence et trans-activation par TaxBLV) de l’expression du BLV.<p><p>Le promoteur unique de la transcription du BLV se situe à l’extrémité 5’ du génome proviral, dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) composée des régions U3, R et U5. Les mécanismes impliqués dans la trans-activation du LTR 5’ par TaxBLV sont encore mal connus. La trans-activation du LTR 5’ du BLV par TaxBLV requiert la présence de trois répétitions imparfaites de 21pb (TxREs pour Tax Responsive Elements) agissant en cis et situées dans la région U3. Chacune des TxREs possède dans sa partie centrale un motif imparfait de 8 nucléotides correspondant au site de liaison des protéines de la famille CREB/ATF (sites CREs pour cAMP-Responsive Element). Des expériences de retard de migration sur gel ont montré que les protéines CREB, ATF-1 et ATF-2 lient les CREs viraux in vitro. Comme TaxBLV ne semble pas capable de lier directement l’ADN du LTR, il a été suggéré que les facteurs CREB/ATF serviraient de médiateurs de la trans-activation par TaxBLV. De plus, il a également été suggéré au cours de ces dernières années que les facteurs de transcription CREB/ATF jouent aussi un rôle essentiel en l’absence de TaxBLV lors de l’initiation de la transcription virale.<p><p>CREB/ATF sont connus pour recruter les co-activateurs CBP/p300 qui possèdent une activité histone-acétyltransférase, suggérant qu’à l’instar d’autres rétrovirus tels que HIV-I ou HTLV-I, l’acétylation protéique pourrait jouer un rôle important dans la régulation de la transcription du BLV. Au cours de la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence un synergisme transcriptionnel entre TaxBLV et les inhibiteurs de désacétylases TSA et NaBut, indiquant que l’acétylation protéique joue un rôle important dans la trans-activation par TaxBLV. Nous avons ensuite montré que ni TaxBLV, ni son médiateur CREB ne sont acétylés in vivo au niveau d’un résidu lysine interne, mais que la TSA synergise avec TaxBLV via un mécanisme indirect, sensible à l’inhibition de la synthèse protéique. Fonctionnellement, CREB/ATF semblent jouer un rôle crucial dans le synergisme TaxBLV/TSA car la mutation des CREs viraux ou la sur-expression d’un dominant négatif CREB inhibent ce synergisme. Des expériences de gel retard et de ChIP ont démontré, in vitro et in vivo, que les inhibiteurs de désacétylases augmentent la liaison des facteurs CREB/ATF aux TxREs. Nos résultats suggèrent donc que le synergisme TaxBLV/TSA serait dû à une augmentation de la trans-activation par TaxBLV observée suite à l’augmentation, induite par la TSA, du recrutement de CREB/ATF au niveau des TxREs.<p><p>CREB/ATF appartiennent à la famille des facteurs de transcription CREB/CREM/ATF agissant au niveau des promoteurs contenant des éléments CREs. Cependant, la liaison de CREM aux CREs imparfaits du LTR du BLV n’a jamais été étudiée. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons montré que des isoformes du gène CREM sont exprimées dans des PBMCs isolés à partir d’un mouton infecté par le BLV et que ces protéines CREM sont capables de lier in vitro et in vivo le promoteur du BLV, via les motifs CREs présents au centre de chacune des TxREs. Des analyses fonctionnelles ont ensuite montré qu’en l’absence de TaxBLV, la surexpression de l’isoforme activatrice CREMt induit la transcription dirigée par le LTR 5’ du BLV. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que CREMt serait capable d’activer la transcription du BLV en réponse à l’activation des cellules B infectées, via la phosphorylation de la sérine 117 de CREMt et via le recrutement par CREMt des co-activateurs CBP/p300. CREMt serait donc impliqué dans les stades précoces de l’initiation de la transcription du BLV. Cependant, nous avons montré que CREMt n’est pas impliqué dans les stades tardifs de l’expression virale puisqu’il ne semble pas capable d’induire la trans-activation par TaxBLV. Au contraire, nous avons montré par des expériences de compétition que CREMt diminue la trans-activation par TaxBLV lorsque celle-ci est induite par CREB, probablement en entrant en compétition avec CREB pour la liaison au niveau des TxREs.<p><p>L’expression du gène CREM est régulée transcriptionnellement et post-transcriptionnellement et mène à la production de différentes isoformes capables d’agir comme des activateurs ou des répresseurs de la transcription. Des expériences de RT-PCR nous ont permis de mettre en évidence la présence d’isoformes répressives ICER dans les cellules YR2 infectées par le BLV. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons montré qu’ICER est capable de réprimer la trans-activation par TaxBLV, suggérant qu’ICER retarderait la trans-activation par TaxBLV afin d’échapper au système immunitaire de l’hôte infecté jusqu’à ce qu’un niveau suffisant du trans-activateur TaxBLV soit produit.<p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation chimie / info:eu-repo/semantics/nonPublished