L'infection chronique ou occulte par le virus de l'hépatite B (HBV) est l'un des facteurs de risque les plusimportants pour le développement de carcinome hépatocellulaire viro-induit. Malgré la petite taille dugénome et les contraintes imposées par l'organisation de ce génome, le HBV présente une grandevariabilité génétique qui est le résultat des erreurs générées lors de l’étape de reverse transcription maisaussi, lors des processus de sélection et d’adaptation. Durant l'infection, une relation étroite hôte-viruss'établit. La population virale est caractérisée par la présence de quasi-espèces pouvant influencerl'évolution de la maladie hépatique et favoriser les phénomènes d'échappement. Le but de notre travail aété 1) d'étudier la variabilité virale associée aux infections occultes et l'impact de certaines modificationsde l'AgHBs (sY100C) sur la reconnaissance des tests de détection enzymatiques, et l'impact des mutations(sK122R, sD144E) sur la reconnaissance des anticorps anti-HBs d'un patient 2) de développer un nouveloutil d'amplification de génomes entiers de HBV que nous avons appliqué à l'étude préliminaire de quasiespècesd'un mutant Core. Cet outil d'amplification est plus sensible que les techniques existantes, et ilpermet l'étude des propriétés moléculaires et fonctionnelles des isolats virales. En conclusion, nous avonspu montrer que les processus d'échappement sont complexes, et font intervenir des facteurs du virus et del'hôte. Ce travail contribue à l'amélioration de la compréhension de la biologie de l'infection par le HBV,et illustre la complexité des interactions hôte-virus. / Pas de résumé en anglais / A infecção crônica e a infecção oculta pelo vírus da hepatite B (HBV) representam fatores de riscoconhecidos para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular. Apesar do pequeno tamanho do genomae as restrições impostas pela organização do genoma, o HBV tem uma alta variabilidade genética que é oresultado dos erros gerados durante a etapa de transcrição reversa e também durante o processo de seleçãoe adaptação do vírus. Durante a infecção uma relação de proximidade se estabelece entre o vírus e ohospedeiro. A população viral é caracterizada pela presença de quasispecies que poderiam influenciar aevolução da doença hepática, e também promover a seleção de variantes de escape imunológico. Osobjetivos do nosso estudo foram 1) estudar a variabilidade do HBV associada às infecções ocultas e oimpacto de certas modificações do HBsAg (sY100C) no reconhecimento de testes de detecçãoenzimáticos. Estudar também o impacto das mutações (sK122R, sD144E) sobre o reconhecimento deanticorpos anti-HBs de um paciente, 2) desenvolver um novo método para amplificar o genoma completodo HBV que foi aplicado a um estudo para identificação de quasispecies de um mutante da região do coreviral. Este método de amplificação é mais sensível do que as técnicas existentes e permite o estudo depropriedades moleculares e funcionais dos virus. Em conclusão, mostramos que os processos de escapeviral são complexas e envolvem fatores relacionados tanto com o vírus como com o hospedeiro. Estetrabalho contribui de maneira significativa para a compreensão da biologia da infecção pelo HBV eilustra a complexidade das interações vírus-hospedeiro.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:32:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8105_1.pdf: 1882884 bytes, checksum: e39c1a843287ccbea7f187b84dbe1593 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A ocorrência de co-infecção pelo HIV e hepatites B e C tem sido relatada desde a era- HAART (do inglês Highly Active Antinetrovial Therapy), quando a mortalidade nas pessoas infectadas pelo HIV começou diminuir. Como conseqüência do fato de terem as mesmas rotas de transmissão, a co-infecção do HBV ou HCV em pessoas infectadas pelo HIV tem aumentado e tornou-se um problema de saúde pública. No Brasil, a prevalência média da coinfecção HIV e hepatites, encontrada pelo Ministério da Saúde é em torno de 40%, com a maioria em grupos de usuários de drogas. Freqüências variáveis de co-infecção têm sido relatadas, dependendo da população e da região estudada. O objetivo principal deste estudo foi identificar a freqüência de marcadores sorológicos para hepatite B e C em pacientes infectados pelo HIV, acompanhados em um hospital escola e os possíveis fatores associados à presença de tais marcadores. Quatrocentos e vinte e nove pacientes foram estudados, de ambos os sexos e com idade variando entre 18 a 77 anos. Os participantes respondiam um questionário específico, com características sócio-demográficas e tinham uma amostra de sangue testada para os marcadores HBsAg, Anti-HBc total e Anti-HCV, utilizando a técnica MEIA-Axym-Abbott. A freqüência encontrada de marcadores foi 10,3% para o HBsAg, 38,7% para o Anti-HBc total e 10,7% para o Anti-HCV. Dentre os pacientes, 1,4% possuíam tanto HBsAg quanto Anti-HCV positivos. Não houve associação significante estatisticamente entre as variáveis parceiro homossexual, uso de drogas endovenosas, ingesta de álcool, tatuagem ou piercing, cirurgia, procedimentos invasivos e hemotransfusão e a infecção pelo HBV, expressa pela positividade do HBsAg. A única variável que mostrou associação com infecção pelo HBV foi uso de drogas inalatórias. Nenhuma destas variáveis, incluindo, parceiro homossexual, uso de drogas endovenosas, uso de drogas inalatórias, ingesta de álcool, tatuagem ou piercing, cirurgia, procedimentos invasivos e hemotransfusão tiveram associação significativa estatisticamente com a presença do Anti-HCV. Este estudo encontrou freqüências comparáveis com outros relatados no Brasil, mas com freqüências de coinfeccção menores que aqueles das regiões Sul e Sudeste. Entretanto, nenhuma associação específica com comportamentos de risco foi encontrada neste estudo, mostrando importante diferença quando comparado com estudos realizados em outras regiões do Brasil

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação - Alline Torquato Vasconcelos - 2014.pdf: 3499445 bytes, checksum: 93905607504e61e452d7ce82396c17a9 (MD5) Previous issue date: 2014-06-06 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Lamivudine (β-L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine, 3TC) is a nucleoside-based anti-HIV/HBV drug that has provided insights into the nucleic acid double-stranded helix assembly. Two crystal structures thereof assembled with nucleobase pairing and helical stacking as mimicries of DNA, but without the phosphodiester linkages in the fiber periphery, have recently demonstrated that nucleosides bring themselves the chemical information to assemble DNA duplexes even if the covalent backbone is absent. Here, we report the third structural example in which nucleosides are base-paired and helically base-stacked. A DNA-like double stranded helix was prepared cocrystallizing lamivudine with fumaric acid. We have named it as lamivudine duplex III. When substituting maleic acid present in the first example of lamivudine duplex for its trans-stereoisomer, the formation of a DNA-mimicry is still observed but with changes in the crystal stoichiometry, nucleobase pairing pattern and duplex backbone. Lamivudine duplex III exhibits both base pairing motifs present in the antecedent duplexes. In this structure, there are four protonated lamivudine molecules paired in-plane with four neutral ones. These crystallographically independent base pairs are held together through three hydrogen bonds as occurs in lamivudine duplex I made up of cytosine-cytosine+ base pairing only. But, contrarily to the duplex I with pairing between neutral and cationic drug units only, the duplex III has one neutral 3TC=3TC pair in its asymmetric unit. These molecules are kept in contact through only two peripheral N―H•••O hydrogen bonds as in two of the three neutral lamivudine pairs of the second example of lamivudine duplex. In both structures, each neutral pair is face-to-face stacked on top of one another and face-to-tail stacked on bottom of another one. Even in agreement with its higher structural complexity, the duplex III is present with very puckering conformations besides the three different orientations of the OH moiety at C5’. Five-membered oxathiolane ring adopts three envelop puckering modes and two twist conformations. This is the first report of a twist pucker for lamivudine despite of the large number of reported crystal structures thereof. Another remarkable characteristic of the duplex III is in its fiber periphery. There are hydrogen bonds between the 5’-OH moieties of neighbor pairs pointing in the direction of the missing phosphodiester linkages that would covalently bond two adjacent monomers in the strand. Furthermore, the geometry of these interactions reveals the antiparallel orientation of each strand relative to one another into the nucleoside duplex backbone. Noteworthy similarities between the duplexes crystallizing together with either hydrogen maleate or hydrogen fumarate are their left handedness and the outline of surface grooves of similar depth. But, while all hydrogen maleate counterions are lodged on the grooves of the duplex I, some hydrogen fumarate units are also interacting with themselves into one-dimensional chain of counterions. The third example of unusual double-stranded helices of lamivudine strengthens the fact that nucleosides can self-aggregate into DNA-like duplexes even without the covalent phosphodiester linkages in fiber periphery. Besides that, the structure described here adds knowledge on lamivudine versatility to assemble DNA-mimicry in crystals. / A lamivudina (β-L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine, 3TC) é um fármaco a base de nucleosídeos utilizado para o tratamento de SIDA e Hepatite B. A obtenção de estruturas do tipo dupla hélice de ácidos nucleicos com esse fármaco tem sido alvo de estudo. Recentemente foram reportadas duas estruturas cristalinas mimetizando DNA, formadas por pares de nucleosídeos empacotados em uma dupla hélice, mas sem ligações fosfodiéster na periferia da cadeia. Estas estruturas demonstraram que os nucleosídeos possuem informação química suficiente para a formação de estruturas dessa natureza mesmo com a ausência das ligações covalentes fosfodiéster. Neste trabalho um terceiro exemplo de uma estrutura contendo bases de nuclosídeos pareadas e sobrepostas helicoidalmente, mimetizando DNA, é reportado. Essa modificação cristalina foi preparada através da cocristalização da lamivudina com o ácido fumárico e a estrutura obtida foi denominada duplex III. Com a substituição do ácido maleico, presente no primeiro exemplo de dupla hélice de lamivudina, pelo seu estéreoisômero trans, o ácido fumárico, a formação de uma estrutura mimetizando o DNA também foi observada, porém, com diferenças na estequiometria do cristal, nos padrões de interação do pareamento das bases, assim como no esqueleto da dupla hélice. O pareamento das bases na duplex III de lamivudina possui padrões de interação semelhante a ambas estruturas precedentes. Na duplex III existem quatro pares parcialmente protonados, onde uma lamivudina protonada está pareada com outra neutra. Esse tipo de pareamento se dá através de três ligações de hidrogênio e é semelhante ao pareamento presente na estrutura da duplex I de lamivudina composto apenas por pares do tipo 3TC+≡3TC. Diferentemente da duplex I que possui exclusivamente pares parcialmente protonados, a duplex III possui também um par neutro do tipo 3TC=3TC na sua unidade assimétrica. O pareamento dessas bases é formado apenas por duas ligações de hidrogênio do tipo N―H•••O, semelhante a dois dos três pares neutros que constituem a duplex II de lamivudina. O empacotamento dos pares neutros na duplex III é semelhante ao da duplex II, cada par neutro empacota com uma padrão face a face com o par que o antecede e face a cauda com o par subsequente. Devido à grande complexidade estrutural da duplex III, temos uma maior variação nas conformações assumidas tanto pelo anel oxatiolano quanto pelo fragmento citosinico, assim como nas três orientações adotadas pelo grupo hidroxílico ligado ao carbono C5’. O anel oxatiolano de cinco membros, adota três diferentes conformações do tipo envelope e duas conformações do tipo cambaleante. Apesar de essas serem as primeiras estruturas reportadas com conformações do tipo cambaleante para a lamivudina, esse tipo de conformação é comum para várias outras estruturas cristalinas. Outra característica que merece destaque na estrutura obtida da duplex III está nos padrões de interação presentes na periferia da dupla hélice. Nota-se a presença de ligações de hidrogênio entre os grupos 5’-OH de pares vizinhos, que ocorrem na direção onde as ligações fosfodiéster deveriam existir entre dois monômeros adjacentes. Além disso, a geometria dessas ligações de hidrogênio revelam uma orientação antiparalela de uma fita em relação a outra no esqueleto da duplex. Existem algumas semelhanças notáveis entre as duplexes I e III, cristalizadas com hidrogenomaleato e hidrogenofumarato, como a espiralização a esquerda e o fato de ambas não possuírem diferença entre sulcos principais e secundários, uma vez que todos os sulcos ao longo da cadeia possuem dimensões semelhantes. Porém, todos os contraíons estão acomodados nos sulcos da duplex I, enquanto que na duplex III alguns contraíons interagem entre si formando uma cadeia unidimensional de contraíons. Esse terceiro exemplo de uma estrutura atípica de dupla hélice de lamivudina reforça o fato de que nucleosídeos podem se agregar em estruturas semelhantes a dupla hélice do DNA, mesmo com a ausência das ligações covalentes fosfodiéster. Além disso a estrutura da duplex III adiciona conhecimento quanto a versatilidade da lamivudina em formar estruturas mimetizando DNA em cristais.

L'infection chronique ou occulte par le virus de l'hépatite B (HBV) est l'un des facteurs de risque les plusimportants pour le développement de carcinome hépatocellulaire viro-induit. Malgré la petite taille dugénome et les contraintes imposées par l'organisation de ce génome, le HBV présente une grandevariabilité génétique qui est le résultat des erreurs générées lors de l'étape de reverse transcription maisaussi, lors des processus de sélection et d'adaptation. Durant l'infection, une relation étroite hôte-viruss'établit. La population virale est caractérisée par la présence de quasi-espèces pouvant influencerl'évolution de la maladie hépatique et favoriser les phénomènes d'échappement. Le but de notre travail aété 1) d'étudier la variabilité virale associée aux infections occultes et l'impact de certaines modificationsde l'AgHBs (sY100C) sur la reconnaissance des tests de détection enzymatiques, et l'impact des mutations(sK122R, sD144E) sur la reconnaissance des anticorps anti-HBs d'un patient 2) de développer un nouveloutil d'amplification de génomes entiers de HBV que nous avons appliqué à l'étude préliminaire de quasiespècesd'un mutant Core. Cet outil d'amplification est plus sensible que les techniques existantes, et ilpermet l'étude des propriétés moléculaires et fonctionnelles des isolats virales. En conclusion, nous avonspu montrer que les processus d'échappement sont complexes, et font intervenir des facteurs du virus et del'hôte. Ce travail contribue à l'amélioration de la compréhension de la biologie de l'infection par le HBV,et illustre la complexité des interactions hôte-virus.