Depuis plusieurs années, le rôle joué par le cytomégalovirus humain (HCMV) dans le développement des maladies inflammatoires et du cancer a été étudié par plusieurs groupes de recherche. Divers tissus tumoraux, notamment dans le cancer du colon, du foie, de la prostate, du cerveau (glioblastome, médulloblastome) et du sein, ont montré la présence d’antigènes ou d’ADN du HCMV. Cette accumulation de preuves de l'implication de l'infection par le HCMV dans les maladies malignes de diverses entités cancéreuses a conduit au développement du concept d'«oncomodulation», qui est expliqué par la capacité du HCMV à contribuer au processus d’oncogenèse, sans toutefois aucun potentiel de transformation directe. HCMV-DB (KT959235) est un isolat clinique provenant d'un échantillon de col de l'utérus d'une femme enceinte de 30 ans, préalablement isolé dans notre laboratoire. Cette souche virale a montré sa capacité à infecter les macrophages primaires et a montré une réplication productive dans les cellules épithéliales mammaires humaines (HMECs). Les HMECs infectées entraînaient l’établissement d’un environnement cellulaire pro-oncogène avec une hyperphosphorylation de Rb et une activité fonctionnelle réduite de p53, une régulation positive de c-Myc, une surexpression de l'activité télomérase et de STAT3, et une régulation positive de la cycline D1, provoquant une prolifération cellulaire accrue. En outre, HCMV-DB a montré son potentiel pour transformer les HMECs primaires par test de formation de colonies sur gélose molle, un test connu pour l’observation de la transformation cellulaire. De manière intéressante, les HMECs infectées par HCMV-DB en culture ont montré l’émergence d’amas de cellules sphéroïdes, qui ont été désignées cellules CTH (HMECs transformées par le CMV). Dans notre thèse, nous avons caractérisé le profil génomique de la souche HCMV-DB et nous l’avons comparé à des souches soit cliniques soit de laboratoire. HCMV-DB a été caractérisée comme proche des génomes des souches Toledo et JP, et cette dernière est une souche clinique isolée à partir d’un tissu glandulaire, la prostate. Nous avons également comparé les gènes impliqués dans l’entrée virale par des analyses phylogénétiques et nous avons observé la proximité de HCMV-DB avec la souche prototypique du HCMV, Merlin. En étudiant le profil transcriptomique des HMECs infectées par HCMV-DB, nous avons trouvé qu’elles présentent un phénotype basal-like triple négatif, ER-/PR-/HER2-, ainsi que des caractéristiques oncogéniques, incluant une up-régulation de l’expression de plusieurs oncogènes, de gènes pro-survie (avec down-régulation de la caspase 8), et de marqueurs de la prolifération, du caractère souche des cellules et de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Le profil transcriptomique des HMECs infectées par HCMV-DB a également montré des modifications variées dans la signalisation cellulaire, l’angiogenèse et la protéolyse. Au niveau de la chromatine, les HMECs inféctées par HCMV-DB ont révélé une hypométhylation globale. En cherchant la présence du génome de HCMV-DB dans les cellules CTH formées, nous avons détecté une signature du génome de HCMV-DB, à savoir le lncRNA4.9. Globalement, nos données ont montré que le transcriptome des HMECs infectées par HCMV-DB révèle clairement des traits pro-oncogéniques et la détection d’une partie du génome de HCMV-DB suggère que cette partie du génome viral peut être responsable de la transformation cellulaire obtenue. / Since several years, the role played by human cytomegalovirus (HCMV) in the development of inflammatory diseases and cancer has been extensively studied and addressed by different research groups. Various tumor tissues originating from colon, liver, prostate, brain (glioblastoma, medulloblastoma) and breast cancer have shown to harbor either the antigen or the DNA of HCMV. These growing evidences about the implication of HCMV infection in malignant entities had led to the emergence of the concept of “Oncomodulation”. This is explained by the ability of the virus to contribute to the oncogenic processes, however without any direct transformatory potential. HCMV-DB (KT959235) is a clinical isolate obtained from a cervical swab specimen of a 30-year-old pregnant woman previously isolated in our laboratory. This viral strain had shown its ability to infect the primary macrophages and to replicate productively in the human mammary epithelial cells (HMECs). In fact, HMECs infected by HCMV-DB resulted in the establishment of a pro-oncogenic cellular environment characterized by retinoblastoma (Rb) hyperphosphorylation and a decreased p53 functional activity, enhanced telomerase activity, upregulation of c-Myc, activation of Akt and STAT3, and upregulation of cyclin D1 causing an enhanced cellular proliferation. Furthermore, HCMV-DB had shown its potential to transform the primary HMECs by colony formation on soft agar, a well know assay to perceive transformation. Interestingly, HCMV-DB infected HMECs in culture showed the emergence of clusters of spheroid cells that were named CTH cells (CMV Transformed HMECs). In our thesis we characterized the genomic profile of HCMV-DB strain and compared it to either clinical or laboratory strains. HCMV-DB was shown to be close to the genomes of Toledo and JP strains where the JP strain is a clinical strain that was isolated from a glandular tissue, the prostate. We also compared the genes that are involved in virus entry using phylogenetic analyses and we observed that HCMV-DB is close to the prototypic HCMV strain, Merlin. By studying the transcriptomic profile of HMECs infected with HCMV-DB, we found that it displays a triple negative basal-like phenotype, ER−/PR−/HER2−, and presents oncogenic characteristics with upregulated expression of several oncogenes, pro-survival genes (with a down-regulation of caspase 8), proliferation markers, stemcellness and epithelial mesenchymal transition (EMT). The transcriptomic profile of HMECs infected with HCMV-DB also displays variant modifications in cell signaling, angiogenesis and proteolysis. At the chromatin level, HMECs infected with HCMV-DB reveals a global hypomethylation state. By screening for the presence of HCMV-DB genome in the formed CTH cells, we detected a signature of the HCMV-DB genome, namely a lncRNA4.9. Taken together, our data showed that the transcriptome of HMECs infected with HCMV-DB clearly reveals a pro-oncogenic traits and the detection of part of the HCMV-DB genome suggests that this part of the viral genome might be responsible for the obtained cellular transformation.

La sénescence est un état d’arrêt prolifératif mis en place par les cellules en réponse à des dommages à l’ADN. Elle est considérée comme un mécanisme de protection qui s’oppose à l’initiation et au développement d’un cancer. Or, les mécanismes de sénescence et la capacité des cellules à s’échapper de cet état et à générer des cellules transformées semblent varier selon les types cellulaires. Chez les kératinocytes humains normaux de peau (NHEKs), la sénescence est transitoire et débouche pour la plupart des cellules sur une mort par autophagie et, pour environ une sur dix mille, sur une émergence néoplasique post-sénescence. Les cellules émergentes présentent des caractères de transformation et accumulent des mutations et des délétions. Cet échappement néoplasique de la sénescence n’est jamais observé dans les fibroblastes normaux de peau (NHDFs) qui, au contraire, une fois en sénescence sont bloqués irréversiblement dans le cycle cellulaire.J’ai participé dans un premier temps à l’étude du rôle de l’autophagie dans la balance échappement néoplasique et mort des NHEKs sénescents. Nous avons pu démontrer que les progéniteurs de cellules néoplasiques ont une activité autophagique modérée plus faible que ceux qui subissent la mort. Ainsi, ils échappent à la mort par autophagie tout en gardant un niveau d’activité autophagique de ménage suffisant pour éliminer leurs composés altérés par le stress oxydant et être capable de ré-entrer en mitose.J’ai ensuite cherché à caractériser les dommages oxydants mutagènes impliqués dans l’échappement néoplasique. Ma stratégie a été d’analyser de façon comparative les NHEKs par rapport aux NHDFs, puisque les uns mais non les autres développent une émergence néoplasique. J’ai ainsi pu constater que le taux de cassures augmente à la sénescence dans les deux types cellulaires, mais que ces cassures sont de nature différente, uniquement des SSBs (Single Strand Breaks) pour les NHEKs et principalement des DSBs (Double Strand Breaks) pour les NHDFs. L’accumulation de DSBs à la sénescence des NHDFs s’accompagne d’une induction robuste de la voie DDR (DNA Damage Response), d’une activation la voie p53-p21 et d’un arrêt stable dans le cycle cellulaire. Dans le cas des NHEKs, l’augmentation du taux de SSBs est la conséquence de l’augmentation du niveau de stress oxydant et de la perte de l’expression et de l’activité de la PARP1. Ceci contribue à une agglomération aberrante de XRCC1 au niveau des cassures engendrant une induction de la voie p38MAPK - p16INK4a et un arrêt dans le cycle cellulaire caractéristique de la sénescence. D’une manière paradoxale, l’échappement néoplasique de la sénescence dépend également de cette accumulation de SSBs non réparés. Ainsi, la nature des dommages à l’ADN influence le devenir des cellules sénescentes. Les DSBs renforcent la stabilité de l’arrêt du cycle cellulaire alors que les SSBs promeuvent l’acquisition de mutations et l’échappement néoplasique. / Senescence is a permanent cell-cycle arrest activated in response to DNA damage. If a cell escapes from this state, it should inherit mutations and could potentially initiate a tumor. NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) display a classical irreversible and stable senescence plateau. In contrast, senescent NHEKs (Normal Human Epidermal Keratinocytes) experience two different outcomes. Most of them undergo autophagic cell death and about one on 10000 spontaneously resumes mitosis and generates clones of transformed, mutated and tumorigenic cells.I contributed in a first time to studying the role of macroautophagy in the cell death / post-senescence neoplastic emergence balance of senescent NHEKs. We have shown that macroautophagy plays antagonistic roles during senescence, inducing cell death or promoting neoplastic transformation, depending on its level of activation. Indeed, the progenitors of post-senescent emergent cells display oxidative stress and autophagic activity levels slightly lower than the average, what allows them to avoid autophagic cell death and to ensure the quality control indispensable for mitosis re-entry.Since oxidative stress is the motor of the post-senescence neoplastic emergence in NHEKs, I wondered next whether oxidative stress could operate through the generation of some mutagenic DNA damage. I took advantage of the comparison of senescent NHEKs to NHDFs. I have shown that unlike NHDFs, NHEKs do not suffer from significantly shortened telomeres, nor accumulate DSBs, do not activate a DDR (DNA Damage Response) pathway and in consequence do not significantly activate the p53/p21 pathway. Instead, they suffer from a decrease in PARP1 expression, which compromises the repair of SSBs generated by oxidative stress. In consequence, SSBR foci, precisely XRCC1 foci, become persistent. These persistent foci initiate a signalization, through p38MAPK, which leads to up-regulation of p16INK4A and to cell cycle arrest. Notably, the accumulation of unrepaired SSBs is sufficient for the post-senescence neoplastic emergence phenomenon, in addition, paradoxically to its involvement in the onset of senescence.In conclusion, senescence results from the persistence of a DNA damage signalization, but the exact nature of the damages could vary in different cell types depending on their repair capacities and could dictate completely different outcomes. Namely, persistent DSBs, including telomeric ones, dictate a permanent tumor-suppressor cell cycle arrest, whereas persistent SSBs are permissive to mutation and senescence evasion.

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