Orientadores: Marco Aurélio Zezzi Arruda, Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-23T02:17:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mataveli_LidianeRaquelVerola_D.pdf: 1935019 bytes, checksum: 059066ee53b01850e2858460ba23617e (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Este trabalho consistiu em estudos de metalômica comparativa de sementes de soja transgênica (T) e não-transgênica (NT). Para tanto, as sementes de soja T e NT foram comparadas, em um primeiro, momento levando-se em conta: concentração total dos elementos, comportamento dos elementos durante extração utilizando-se fracionamento sequencial, e bioacessibilidade dos elementos após procedimento de digestão gastrointestinal simulada (in vitro). As análises preliminares foram feitas utilizando-se ICP-MS com analisador de massas quadrupolar, e as análises posteriores utilizando espectrometria de massas de alta resolução com plasma acoplado indutivamente (HR-ICP-MS). Foram determinados 25 elementos em concentrações variando de ng g até %. Foi observado que as sementes de soja T e NT exibem diferenças estatisticamente significantes nas concentrações de Cu, Fe e Sr, sendo os dois primeiros apresentando maiores concentrações na semente T, e, o último, com maior concentração nas sementes de soja NT. Estes resultados também se refletiram nos conteúdos desses elementos em extratos aquosos e resíduos obtidos por meio de fracionamento sequencial. Ainda, os experimentos de bioacessibilidade realizados mostraram que as frações bioacessíveis de Cu, Fe, e outros elementos (Mn, S, Zn) contribuíram em maior porcentagem para a concentração total dos elementos nas sementes de soja T do que para as sementes de soja NT. Posteriormente, foi dada continuidade aos estudos utilizando cromatografia líquida bidimensional off line para as amostras de sementes de soja, sendo a primeira dimensão constituída de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC,) e a segunda dimensão constituída de cromatografia de troca aniônica (AEX). Na primeira dimensão cromatográfica foram identificadas três frações contendo metais por meio da hifenação SEC-ICP-MS: a primeira correspondendo a massas molares entre 38,1 e 181,1 kDa, a segunda correspondendo a massas molares entre 8,2 e 17,2 kDa, e a terceira fração correspondendo a massas molares entre 0,4 e 3,8 kDa. As três frações identificadas foram separadas, liofilizadas, e separadas novamente utilizando a cromatografia de troca aniônica. Foram detectados metais em todas as frações separadas por SEC: três sub-frações da primeira fração, uma sub-fração na segunda fração e três sub-frações na terceira fração. Os eluatos foram coletados, liofilizados, digeridos e levados ao espectrômetro de massas com fonte de ionização por electrospray (ESI-MS) para identificação de proteínas. Foram identificadas 33 e, entre elas, duas proteinas previamente relacionadas a metais foram encontradas: seed lipoxygenase 1 e b-conglycinin. Após a separação na segunda dimensão cromatográfica, as sub-frações resultantes foram liofilizadas e submetidas a uma terceira dimensao de separacao, utilizando a eletroforese em gel de poliacrilamida unidimensional (SDS-PAGE). As bandas obtidas por SDS-PAGE foram recortadas e digeridas a fim de analisar os metais presentes nas mesmas, destacando os resultados obtidos para Fe, onde o mesmo foi quantificado nas bandas da sub-fração onde o pico deste elemento foi encontrado nas análises por AEX-ICP-MS. Ainda, as bandas foram digeridas tripticamente a fim de identificar as proteínas presentes, e, novamente, proteínas associadas a metais foram identificadas: chain A lipoxygenase-3 (Soybean) complex with 13(S)-hydroperoxy- 9(Z),11(E)-octadecadienoic acid; beta-amylase [Glycine max]; seed lipoxygenase-1, lipoxygenase [Glycine max], seed lipoxygenase-2 (PISUM SATIVUM) e beta-conglycinin / Abstract: This work consisted of comparative metallomics studies of transgenic (T) and nontransgenic (NT) soybean seeds. To that end, T and NT seeds were compared at first taking into account: the total concentration of the elements, the elements behavior during extraction using sequential fractionation, and bioacessibility of the elements after simulated gastrointestinal digestion procedure (in vitro). Preliminary analyzes were done using ICP-MS with quadrupole mass analyzer, and the subsequent analysis using high-resolution inductively coupled plasma mass spectrometry, (HR-ICP-MS). 25 elements were determined at concentrations ranging from 1 ng g up to %. It was observed that T and NT soybean seeds exhibit statistically significant differences in the concentrations of Cu, Fe and Sr, the first two having higher concentrations in the T seeds, and the last with the highest concentration in soybeans NT. These results were also reflected in the contents of these elements in aqueous extracts and residues obtained through sequential fractionation. Also, the contributions of bioaccessible fractions of Cu, Fe and other elements (Mn, S, Zn) to the total content of the elements in T soybean seeds were higher than those found in NT soybean seeds. Subsequently, studies were continued using bidimensional liquid chromatography, the first dimension consisting of size exclusion chromatography (SEC) and the second dimension of anion exchange chromatography (AEX). In the first chromatographic dimension three fractions containing metals were identified using hyphenation SEC-ICP-MS, the first corresponding to molar masses between 38.1 and 181.1 kDa, the second corresponding to molar masses between 8.2 and 17.2 kDa and the third fraction corresponding to molar masses between 0.4 and 3.8 kDa. The three identified fractions were separated and lyophilized, and again separated using anion exchange chromatography (AEX). Metals were found in all the separated fractions by SEC: three sub-fractions of the first fraction, a subfraction in the second fraction and three sub-fractions in the third fraction. These peaks were collected, lyophilized, digested and taken to the mass spectrometer for protein identification. 33 proteins were identified, and, among them, two proteins previously related to metals were found: seed lipoxygenase 1 and b-conglycinin. After chromatographic separation in the second dimension, the resultant subfractions were lyophilized and subjected to a third separation dimension using onedimensional polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After the separation, the bands were cut out and digested to examine the metals contained therein, highlighting the results obtained for Fe, which was quantified in the bands of the sub-fraction where the peak of the element is found in the analysis by ICP-AEX - MS. Also, the bands were digested triptically to identify the proteins, and once again proteins associated to metals were identified: 3-lipoxygenase A chain (Soybean) complex with 13 (S)-Hydroperoxy-9 (Z), 11 ( E)-octadecadienoic acid, beta-amylase [Glycine max]; seed lipoxygenase-1, lipoxygenase [Glycine max] seed lipoxygenase-2 (Pisum sativum) and beta-conglycinin / Doutorado / Quimica Analitica / Doutora em Ciências

O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de um método analítico para a especiação de mercúrio em água com preparação de amostra por microextração em sorvente empacotado (MEPS) e determinação das espécies de mercúrio utilizando cromatografia líquida de alta eficiência hifenada à espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (HPLC-ICP-MS). Para isso foram otimizadas as condições do sistema cromatográfico, do sistema de detecção e do procedimento de extração, considerando os parâmetros que influenciam diretamente na eficiência da análise, como o solvente de eluição, o agente complexante, o número de ciclos de extração e a velocidade de amostragem da seringa semi-automática eVol®. As melhores condições para o preparo de amostra foram encontradas com o uso de ditizona 0,001% m/v como agente complexante e eluição com 50?L de fase móvel, composta por 2-mercaptoetanol 0,05% v/v + L-cisteína 0,4% m/v + acetato de amônio 0,06 mol.L-1. Esse método apresentou valores de limite de detecção (LOD) de 0,19ng/L, 0,13ng/L e 0,16ng/L e recuperação de 100 ± 3%, 112 ± 0,9% e 91 ± 0,9% para mercúrio inorgânico (IHg), metilmercúrio (MeHg) e etilmercúrio (EtHg), respectivamente. A precisão intra-dia para cada espécie apresentou valores inferiores a 6,2% e a precisão inter-dia, valores interiores a 8,3%. Finalmente, o método proposto é uma excelente alternativa para a especiação química de mercúrio em amostras de água, garantindo uma melhor sensibilidade e reduzido volume de amostra. Além disso, poderá ser uma boa opção para pré-concentração de espécies de mercúrio in loco em estudos de contaminação ambiental em locais de difícil acesso e com pouca infraestrutura. / The aim of this study was to develop and validate a novel preconcentration method for determination of mercury species in water using a microextraction by packed sorbent (MEPS) based protocol followed by high performance liquid chromatography hyphenated to inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). The optimized conditions of the HPLC and ICP-MS were determined and critical factors in MEPS protocol were established, including elution solvent, complexing agent, number of extraction cycles and sample flow rate of the semi-automated MEPS format (eVol®). The best sample preparation conditions were found with the use of dithizone 0,001% m/v as complexing agent and elution in 50?L of the mobile phase, containing 2-mercaptoethanol 0,05% v/v + L-cysteine 0,4% m/v + ammonium acetate 0,06 mol/L. The proposed method detection limit (LOD) was 0,19ng/L, 0,13ng/L and 0,16ng/L and the recovery was 100 ± 3%, 112 ± 0,9% and 91 ± 0,9% for inorganic mercury (IHg), methylmercury (MeHg) and ethylmercury (EtHg), respectively. The within-day precision was always lower than 6,2%, while the between-day precision was lower than 8,3% for the species determined. Finally, the proposed method is an excellent alternative for mercury speciation in water samples, ensuring a better sensitivity associated to small sample volume. Additionally, it may be a good option for preconcentration of mercury species in situ for environmental contamination studies in places of difficult access and poor infrastructure

O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de um método analítico para a especiação de mercúrio em água com preparação de amostra por microextração em sorvente empacotado (MEPS) e determinação das espécies de mercúrio utilizando cromatografia líquida de alta eficiência hifenada à espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (HPLC-ICP-MS). Para isso foram otimizadas as condições do sistema cromatográfico, do sistema de detecção e do procedimento de extração, considerando os parâmetros que influenciam diretamente na eficiência da análise, como o solvente de eluição, o agente complexante, o número de ciclos de extração e a velocidade de amostragem da seringa semi-automática eVol®. As melhores condições para o preparo de amostra foram encontradas com o uso de ditizona 0,001% m/v como agente complexante e eluição com 50?L de fase móvel, composta por 2-mercaptoetanol 0,05% v/v + L-cisteína 0,4% m/v + acetato de amônio 0,06 mol.L-1. Esse método apresentou valores de limite de detecção (LOD) de 0,19ng/L, 0,13ng/L e 0,16ng/L e recuperação de 100 ± 3%, 112 ± 0,9% e 91 ± 0,9% para mercúrio inorgânico (IHg), metilmercúrio (MeHg) e etilmercúrio (EtHg), respectivamente. A precisão intra-dia para cada espécie apresentou valores inferiores a 6,2% e a precisão inter-dia, valores interiores a 8,3%. Finalmente, o método proposto é uma excelente alternativa para a especiação química de mercúrio em amostras de água, garantindo uma melhor sensibilidade e reduzido volume de amostra. Além disso, poderá ser uma boa opção para pré-concentração de espécies de mercúrio in loco em estudos de contaminação ambiental em locais de difícil acesso e com pouca infraestrutura. / The aim of this study was to develop and validate a novel preconcentration method for determination of mercury species in water using a microextraction by packed sorbent (MEPS) based protocol followed by high performance liquid chromatography hyphenated to inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). The optimized conditions of the HPLC and ICP-MS were determined and critical factors in MEPS protocol were established, including elution solvent, complexing agent, number of extraction cycles and sample flow rate of the semi-automated MEPS format (eVol®). The best sample preparation conditions were found with the use of dithizone 0,001% m/v as complexing agent and elution in 50?L of the mobile phase, containing 2-mercaptoethanol 0,05% v/v + L-cysteine 0,4% m/v + ammonium acetate 0,06 mol/L. The proposed method detection limit (LOD) was 0,19ng/L, 0,13ng/L and 0,16ng/L and the recovery was 100 ± 3%, 112 ± 0,9% and 91 ± 0,9% for inorganic mercury (IHg), methylmercury (MeHg) and ethylmercury (EtHg), respectively. The within-day precision was always lower than 6,2%, while the between-day precision was lower than 8,3% for the species determined. Finally, the proposed method is an excellent alternative for mercury speciation in water samples, ensuring a better sensitivity associated to small sample volume. Additionally, it may be a good option for preconcentration of mercury species in situ for environmental contamination studies in places of difficult access and poor infrastructure

Com o aumento das exigências regulatórias e estabelecimento de limites mais restritos para impurezas elementares em fármacos e excipientes usados em formulações farmacêuticas, ocorreu uma busca por técnicas analíticas capazes de quantificar elementos em níveis traço e assegurar a qualidade e a segurança dos medicamentos. A espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) é uma técnica multielementar, que apresenta alta sensibilidade e é empregada com eficiência na análise de elementos traço em diferentes matrizes. O ICP-MS, acoplado a um sistema separador como o cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC), possibilita a especiação de elementos químicos, o que é importante, pois a toxicidade pode estar diretamente ligada à forma química do elemento, como ocorre para o Hg e As. Neste sentido, os objetivos deste trabalho foram desenvolver e validar um método de análise simples, rápido e com alta sensibilidade, para determinação de 15 impurezas elementares: As, Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, V, Ir, Pd, Pt, Rh, Ru, Hg, Os e Mo, em diferentes fármacos e excipientes, em níveis que atendam aos novos critérios estabelecidos pelos órgãos regulatórios, avaliar a utilização da cela de reação dinâmica (DRC) para eliminação de interferências espectrais na determinação de As, Cr e V, realizar a especiação de As e Hg, e aplicar esta metodologia para análise de diversas amostras comprovando sua robustez, versatilidade e vantagens para utilização em rotina. Foram avaliadas cinco estratégias de preparo de amostra: digestão em micro-ondas sistema fechado e digestão em micro-ondas - sistema aberto, digestão em banho-maria, diluição direta em meio ácido e extração utilizando ponteira de ultrassom. Através de ensaios de recuperação e materiais de referência certificados, os melhores resultados (84 a 101%) foram obtidos com a digestão das amostras em sistema fechado de micro-ondas e extração por ponteira de ultrassom. Os limites de detecção variaram entre 0,001 ng g-1 (103Rh) e 0,083 ng g-1 (75As). Em seguida, a metodologia analítica foi empregada para determinação dos elementos em estudo em 74 amostras de fármacos e excipientes. O elemento mais frequentemente encontrado foi o Cu, seguido por Cr, Mo, Ni, Pd e V. Já os elementos químicos Ir, Pt, Os e Ru não foram detectados. Cabe destacar que as concentrações de Pd, Rh, As, Cd, Cr, Cu, Ni, V e Mo encontraram-se acima do limite preconizado pela farmacopeia americana em algumas amostras. A análise por especiação química de As mostrou que as amostras possuíam apenas as formas inorgânicas e mais tóxicas. Em relação ao Hg, apenas uma amostra apresentou níveis detectáveis deste elemento, mas a concentração estava abaixo do limite estabelecido pela farmacopeia americana. / Due to quality and safety reasons, regulatory requirements and establishment of more restricted limits for elemental impurities in drugs and excipients are increasing. These regulations promoted a search for simple and robust analytical techniques for quantification of trace elements. Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) is an attractive technique for this purpose, presenting multielement and high sensitivity capabilities. ICP-MS can be hyphenated to separation techniques such as high-performance liquid chromatography (HPLC), enabling chemical speciation analysis. Speciation analysis may reveal the chemical form of the element that may be more directly related to the toxicity. In this sense, the objectives of this work were to develop and validate a simple, fast and highly sensitive method for the determination of 15 elemental impurities: As, Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, V, Ir, Pd, Rh, Ru, Hg, Os and Mo, in different drugs and excipients, at levels that meet the new criteria established by the regulatory agencies. We also evaluated the use of the dynamic reaction cell (DRC) to eliminate spectral interferences for As, Cr And V. Finally, for As and Hg, speciation methods were applied. All analysis were performed focusing on robustness, versatility and sample high-throughput. We tested five sample preparation strategies: closed microwave system digestion, microwave digestion - open system, water bath digestion, direct acid dilution and ultrasound probe extraction. Recovery studies in ordinary samples and reference certified materials were observed with the closed microwave digestion system and ultrasound probe extraction (84 and 101%). Detection limits ranged from 0.001 ng g-1 for 103Rh to 0.083 ng g-1 for 75As. The analytical methodology was then applied for the determination of the elements in study in 74 samples of drugs and excipients. The most frequently found element was Cu, followed by Cr, Mo, Ni, Pd and V. The chemical elements Ir, Pt, Os and Ru were not detected. It should be mention that the concentrations of Pd, Rh, As, Cd, Cr, Cu, Ni, V and Mo were above the limit recommended by the American pharmacopeia in some samples. Only inorganic arsenic (most toxic forms) was found in samples by applying speciation analysis. Regarding Hg, only one sample had detectable levels of this element, but the concentration was below the limit established by the American pharmacopeia

Com o aumento das exigências regulatórias e estabelecimento de limites mais restritos para impurezas elementares em fármacos e excipientes usados em formulações farmacêuticas, ocorreu uma busca por técnicas analíticas capazes de quantificar elementos em níveis traço e assegurar a qualidade e a segurança dos medicamentos. A espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS) é uma técnica multielementar, que apresenta alta sensibilidade e é empregada com eficiência na análise de elementos traço em diferentes matrizes. O ICP-MS, acoplado a um sistema separador como o cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC), possibilita a especiação de elementos químicos, o que é importante, pois a toxicidade pode estar diretamente ligada à forma química do elemento, como ocorre para o Hg e As. Neste sentido, os objetivos deste trabalho foram desenvolver e validar um método de análise simples, rápido e com alta sensibilidade, para determinação de 15 impurezas elementares: As, Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, V, Ir, Pd, Pt, Rh, Ru, Hg, Os e Mo, em diferentes fármacos e excipientes, em níveis que atendam aos novos critérios estabelecidos pelos órgãos regulatórios, avaliar a utilização da cela de reação dinâmica (DRC) para eliminação de interferências espectrais na determinação de As, Cr e V, realizar a especiação de As e Hg, e aplicar esta metodologia para análise de diversas amostras comprovando sua robustez, versatilidade e vantagens para utilização em rotina. Foram avaliadas cinco estratégias de preparo de amostra: digestão em micro-ondas sistema fechado e digestão em micro-ondas - sistema aberto, digestão em banho-maria, diluição direta em meio ácido e extração utilizando ponteira de ultrassom. Através de ensaios de recuperação e materiais de referência certificados, os melhores resultados (84 a 101%) foram obtidos com a digestão das amostras em sistema fechado de micro-ondas e extração por ponteira de ultrassom. Os limites de detecção variaram entre 0,001 ng g-1 (103Rh) e 0,083 ng g-1 (75As). Em seguida, a metodologia analítica foi empregada para determinação dos elementos em estudo em 74 amostras de fármacos e excipientes. O elemento mais frequentemente encontrado foi o Cu, seguido por Cr, Mo, Ni, Pd e V. Já os elementos químicos Ir, Pt, Os e Ru não foram detectados. Cabe destacar que as concentrações de Pd, Rh, As, Cd, Cr, Cu, Ni, V e Mo encontraram-se acima do limite preconizado pela farmacopeia americana em algumas amostras. A análise por especiação química de As mostrou que as amostras possuíam apenas as formas inorgânicas e mais tóxicas. Em relação ao Hg, apenas uma amostra apresentou níveis detectáveis deste elemento, mas a concentração estava abaixo do limite estabelecido pela farmacopeia americana. / Due to quality and safety reasons, regulatory requirements and establishment of more restricted limits for elemental impurities in drugs and excipients are increasing. These regulations promoted a search for simple and robust analytical techniques for quantification of trace elements. Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) is an attractive technique for this purpose, presenting multielement and high sensitivity capabilities. ICP-MS can be hyphenated to separation techniques such as high-performance liquid chromatography (HPLC), enabling chemical speciation analysis. Speciation analysis may reveal the chemical form of the element that may be more directly related to the toxicity. In this sense, the objectives of this work were to develop and validate a simple, fast and highly sensitive method for the determination of 15 elemental impurities: As, Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, V, Ir, Pd, Rh, Ru, Hg, Os and Mo, in different drugs and excipients, at levels that meet the new criteria established by the regulatory agencies. We also evaluated the use of the dynamic reaction cell (DRC) to eliminate spectral interferences for As, Cr And V. Finally, for As and Hg, speciation methods were applied. All analysis were performed focusing on robustness, versatility and sample high-throughput. We tested five sample preparation strategies: closed microwave system digestion, microwave digestion - open system, water bath digestion, direct acid dilution and ultrasound probe extraction. Recovery studies in ordinary samples and reference certified materials were observed with the closed microwave digestion system and ultrasound probe extraction (84 and 101%). Detection limits ranged from 0.001 ng g-1 for 103Rh to 0.083 ng g-1 for 75As. The analytical methodology was then applied for the determination of the elements in study in 74 samples of drugs and excipients. The most frequently found element was Cu, followed by Cr, Mo, Ni, Pd and V. The chemical elements Ir, Pt, Os and Ru were not detected. It should be mention that the concentrations of Pd, Rh, As, Cd, Cr, Cu, Ni, V and Mo were above the limit recommended by the American pharmacopeia in some samples. Only inorganic arsenic (most toxic forms) was found in samples by applying speciation analysis. Regarding Hg, only one sample had detectable levels of this element, but the concentration was below the limit established by the American pharmacopeia

Orientadores: Marco Aurélio Zezzi Arruda, Fábio Augusto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-21T15:26:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_ElidianeGomesda_D.pdf: 2153115 bytes, checksum: 5169aef7da6fd6ddcc74f0fd71a98fe7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: No Capítulo 1, é proposta a combinação das técnicas de microextração em fase sólida com a espectrometria de absorção atômica em forno de grafite para extração de Se(IV) derivado, seguida de detecção por GC-MS. O método é aplicado com sucesso na determinação de Se total em materiais de referência certificado (BCR-414 and SRM 1643e), sendo obtidas recuperações de 97% para a água (SRM 1643e) e 101% para o plâncton (BCR-414). O método também é aplicado para determinação de selênio em amostra de medicamento manipulado a base de quelato de selênio. No Capítulo 2, a técnica de HPLC com troca aniônica acoplada a ICP-MS, é usada para identificação e determinação de quatro espécies de selênio (Se(IV), Se(VI), selenometionina e selenocistina) em amostras biológicas (plâncton, castanha-do-pará, urina e folhas de girassol). A extração das espécies, presente em plâncton (BCR-414), castanha-do-pará e folhas de girassol, é realizada com água, e um teste de simulação de digestão gastrointestinal também é aplicado para identificar as espécies de selênio bioacessíveis em castanha do Pará. O Se(IV) é a principal espécie extraída no plâncton, com maior concentração de selênio no extrato. A castanha-do-pará possui, principalmente, selenocistina e selenometionina, sendo que somente a selenometionina é identificada como bioacessível. O estudo de especiação de selênio por HPLC-ICP-MS sugere a presença de selenocistina em urina de homens e mulheres. As folhas de girassol, de plantas cultivadas com solução de selenito apresentam um maior número de espécies de selênio, em comparação a planta controle / Abstract: In Chapter 1, the combination of the techniques of solid phase microextraction with atomic absorption spectrometry graphite furnace is proposed, using an SPME fiber device and graphite furnace (GF) for extracting Se compounds. The extracted compounds are separated and detected by GC-MS. The method is successfully applied to the total Se determination in certified reference materials (BCR-414 and SRM 1643e). The SPME-GF method combined with GC-MS is also applied to the determination of total selenium in a commercial drug sample (selenium chelate). In Chapter 2, the anion-exchange HPLC technique coupled to ICP-MS is used for identification and determination of four selenium species (Se(IV), Se(VI), selenomethionine and selenocystine) in biological samples (plankton, Brazil nuts, urine and sunflower leaves). The extraction of the species is carried out using water for plankton (BCR-414), Brazil nuts and sunflower leaf. A simulated gastrointestinal digestion is also used to identify bioaccessible selenium in Brazil nuts. The Se(IV) is the predominant specie in the plankton, with the highest selenium concentration in the extract. The Brazil nuts contain selenomethionine and selenocystine species, but only selenomethionine is identified as bioaccessible. The study of selenium speciation by HPLC-ICP-MS suggests the presence of selenocystine in the urine of women and men. The sunflower leaves of plants cultivated with selenite have a higher number of selenium species compared to the control plants / Doutorado / Quimica Analitica / Doutora em Ciências

L'arsenic est un élément présent dans tous les compartiments de l'environnement, et les produits de la pêche représentent une source majeure d'exposition à l'arsenic par le biais de l'alimentation. Même s'il n'existe pas à ce jour de législation sur les teneurs en arsenic dans les aliments en France, les agences gouvernementales évaluent généralement les risques liés à la présence d'arsenic dans les produits de la pêche en se basant essentiellement sur la concentration totale de l'élément, sans tenir compte des différentes espèces présentes ni de leur bioaccessibilité. Par conséquent, le développement de méthodes d'analyse de spéciation revêt un intérêt particulier dans le cadre de l'évaluation des risques. La première partie de ce mémoire présente des informations générales sur les propriétés de l'arsenic, son occurrence dans les différents compartiments de l'environnement et sa toxicité, ainsi qu'une étude bibliographique des méthodes analytiques existantes pour étudier la spéciation de l'arsenic dans les matrices alimentaires, en particulier les produits de la pêche (extraction et séparation/détection). Les différentes approches pour l'évaluation de sa bioaccessibilité et de celle d'autres éléments traces métalliques d'intérêt sont également présentées. La deuxième partie de ces travaux porte sur la validation d'une méthode d'analyse de spéciation des principales espèces d'arsenic dans les produits la pêche (As(III), MA,DMA, As(V), AsB, TMAO, AsC) par couplage entre la chromatographie d'échange d'ions (IEC) et la spectrométrie de masse à plasma induit (ICP-MS) après extraction assistée par micro-ondes (MAE). L'évaluation des performances analytiques de la méthode, les contrôles qualités internes et externes mis en place et les différentes applications, en particulier les données d'occurrence des différentes espèces d'arsenic dans les produits de la pêche les plus consommés par la population française sont présentés et discutés. Dans la troisième partie, la bioaccessibilité maximale de l'arsenic et d'autres éléments d'intérêt est estimée à l'aide d'une méthode de lixiviation en ligne (impliquant la mesure en temps réel par ICP-MS de la fraction libérée par les différents fluides digestifs artificiels). La combinaison de ce procédé avec la méthode d'analyse de spéciation validée permet ainsi d'estimer la bioaccessibilité des différentes espèces d'arsenic. / Arsenic is an element present in all compartments of the environment, and seafood constitutes a major source of exposure to arsenic through human consumption. Although there is currently no legislation on arsenic in food in France, government agencies generally assess the safety of food items based solely on the total concentration of the element, without taking into account its different species or their bioaccessibility. Therefore, the development of speciation analysis methods is particularly relevant in the context of risk assessment. The first part of this thesis focuses on the properties of arsenic, its occurrence in the different compartments of the environment and its toxicity, and a literature review of existing analytical methods to study the speciation of arsenic in food matrices, especially seafood products (extraction and separation / detection). Different approaches for evaluating its bioaccessibility and that of other trace metals of interest are also presented.The second part of this work concerns the validation of a speciation analysis method for major arsenic species in seafood (As (III), MA, DMA, As (V), AsB, TMAO, AsC) by coupling ion exchange chromatography (IEC) with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) after microwave-assisted extraction (MAE). Evaluation of the analytical performance of the method, internal and external quality controls in place and applications of the method, particularly occurrence data of arsenic species in seafood most consumed by the French population are presented and discussed. In the third part, the maximum bioaccessibility of arsenic and other elements of interest is assessed using a continuous leaching method (involving the real-time measurement by ICP-MS of the fraction released by the different artificial digestive fluids). By coupling this leaching method with the above validated speciation analysis method, the bioaccessibility of different arsenic species is also assessed.

O Mercúrio (Hg) é um dos mais tóxicos poluentes do meio ambiente. Ele existe basicamente em três formas: Mercúrio elementar (Hg0), ou Hg metálico, mercúrio inorgânico (Hg-i), principalmente o cloreto mercúrico e o mercúrio orgânico (Hg-o), representado principalmente pelo metilmercúrio (MeHg) e etilmercúrio (EtHg), sendo que as formas orgânicas do Hg são mais tóxicas. Sendo assim, é de suma importância que se tenha métodos de fracionamento (Hg t, Hg-i e Hg-o pela diferença) e de especiação de mercúrio (Hg-i, MeHg, EtHg) para diferenciação das espécies de mercúrio em matrizes biológicas. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivos o desenvolvimento de três métodos analíticos rápidos, simples e sensíveis para: i) fracionamento entre Hg-t e Hg-i em sangue/plasma (Hg-o pela diferença) utilizando sistema de geração de vapor frio em linha com ICP-MS (CV ICP-MS); ii) especiação de Hg em amostras de sangue e plasma utilizando o acoplamento HPLC-ICP-MS; iii) especiação de Hg em amostras de sangue utilizando o acoplamento GC-ICP-MS. No método de fracionamento de mercúrio foi feito o preparo de amostras utilizando hidróxido de tetrametilamônio (TMAH) à temperatura ambiente. No método de especiação por HPLC-ICP-MS foi feita a extração das espécies utilizando banho ultrassônico, ao passo que no método GC-ICP-MS foi feita a extração das espécies assistida por microondas. O método CV ICP-MS foi comparado com a geração de vapor utilizando absorção atômica (CV AAS) não tendo diferença estatística entre os dois métodos. Para validação dos métodos foi utilizado Material de Referência Certificado (NIST 966) e outros Materiais de Referência. Os métodos foram aplicados para análise de amostras de sangue de populações Ribeirinhas da Amazônia brasileira expostas ao mercúrio. Os métodos demonstraram ser simples e rápidos, podendo facilmente serem implantados em rotina de laboratórios clínicos. / Mercury (Hg) is one of the most toxic environmental pollutants. It exists primarily in three forms: elemental mercury (Hg0), or metallic mercury, inorganic mercury (Hg-i), particularly mercuric chloride and organic mercury (Hg-o), mainly represented by methylmercury (MeHg) and ethylmercury (EtHg), and the organic forms of mercury are more toxic than the inorganic ones. Then, it is very important the development of simple and fast methods for mercury fractionation (T-Hg, Hg-i and Hg-o by the difference) or speciation (Hg-i, MeHg, EtHg) in biological samples. Then, the aims of this work were to evaluate three analytical methods for: i) mercury fractionation in blood/plasma samples (Hg-t, Hg-i and Hg-o by difference) by using a ICP-MS on line coupled to a cold-vapor generation system (CV ICP-MS), ii) Hg speciation in blood and plasma by using LC coupled to ICP-MS; iii) Hg speciation in blood samples with the use of GC coupled to ICP-MS. For the fractionation method, samples were previously incubated with tetramethylammonium hydroxide (TMAH) at room temperature. On the other hand, for the speciation of Hg in blood/plasma by using HPLC-ICP-MS the extraction of Hg species was carried out with the use of ultrasonic energy. For the speciation methodology with GC-ICP-MS the extraction of Hg species was carried out with the use of microwave-assisted extraction. Validation of the proposed methods were evaluated based on the analysis of the SRM NIST 966 and ordinary blood samples collected from riparians living in the Brazilian Amazon exposed to mercury. In general the proposed methodologies proved to be simple, fast and easily applied in routine analysis by clinical laboratories.

Ce travail a développé une nouvelle méthode pour l'identification et la quantification des peptides, par l'optimisation de certaines stratégies disponibles appropriées pour le marquage des peptides avec des métaux lanthanide, une séparation par nano-HPLC et détection UV, et suivi par MALDI MS. Tout d'abord, les peptides ont été marqués avec les trois métaux lanthanides différents et un réactif fonctionnel - DOTA. Les résultats montrent que la réaction de transformation en dérivé à l'aide du réactif chélateur DOTA-NHS-ester a été efficace pour des peptides individuels et des mélanges de peptides, vérifiées à partir de la relation m/z obtenue par MALDI MS. L'application optimisée d’un complexe (Cytochrome C digest) a montré des résultats comparables à ceux obtenus avec des peptides modèles. En parallèle, nous avons effectué l’optimisation pour la purification de métalloprotéine dans la bile de poisson, qui est signalée entant que biomarqueurs de contamination métallique de l'environnement. Des procédures différentes (différents moments de centrifugation et différentes températures de traitement thermique) et les agents (DTT, β-mercaptoéthanol et TCEP) réduisant ont été apliqués pour purifier les MT isolées de la bile et du foie des poissons (Oreochromis niloticus). Des analyses spectrophotométriques ont été utilisées pour quantifier les échantillons de MT, et le gel SDS-PAGE a été utilisé pour évaluer qualitativement les différents résultats de la procédure. Chaque procédure a en suíte été évaluée statistiquement, une méhtode des surfaces de réponse a été appliquée. Les MT de la bile semblent être plus adéquate pour la surveillance de l'environnement en ce qui concerne l'exposition récente à des xénobiotiques qui peuvent influer sur l'expression protéomique et metalloproteomique de cette matrice biologique. Une procédure d’exposition à des métaux dans le laboratoire a montré que les métaux étaient significativement importante pour l’évaluation de la contamination à partir de la quantification de MT, selon le traitement de données par une techinique de réseau neural. / This work developed a new method for the identification and quantification of peptides, by optimizing some of the available strategies suitable for labeling peptides with lanthanide metals with subsequent separation by nano-HPLC with UV detection, matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry (MALDI MS). First, peptides were labeled with the three different lanthanide metals using a functional DOTA-based reagent. The results demonstrate that the derivatization reaction using the chelating reagent DOTA-NHS-ester was effective for single peptides and peptide mixtures, verified from the m/z relation obtained by MALDI MS. The application of the optimized method in a more complex matrix (Cytochrome C digest) showed results comparable to those obtained with model peptides. In parallel, environmental analyses were conducted, by performing the standardization of metalloprotein purification in fish bile, since this matrix has been reported as a biomarker for environmental metal contamination. Different procedures (varying centrifugation times and heat-treatment temperatures) and reducing agents (DTT, β-mercaptoethanol and TCEP) were applied to purify MT isolated from fish (Oreochromis niloticus) bile and liver. Spectrophotometrical analyses were used to quantify the resulting MT samples, and SDS-PAGE gels were used to qualitatively assess the different procedure results. Each procedure was then statistically evaluated. A response surface methodology was applied for bile samples, in order to further evaluate the responses for this matrix. In an environmental context, biliary MT was lower than liver MT, and, bile MT seems to be more adequate in environmental monitoring scopes regarding recent exposure to xenobiotics that may affect the proteomic and metalloproteomic expression of this biological matrix. A procedure for exposure to metals in the laboratory showed that some metals are significantly important for the assessment of contamination from the quantification of MT, according to the data processing by atifical neural network (ANN).

[pt] O consumo de suplementos alimentares tem apresentado um aumento significativo nos últimos anos principalmente pelo grande apelo desse produto em relação a complementação da dieta com elementos essenciais e a melhora e manutenção da saúde. A combinação do crescente consumo e o livre acesso a esse produto, aliado a ausência de fiscalização por parte dos órgãos governamentais torna seu consumo descontrolado, um potencial risco a saúde da população. Nesse cenário o desenvolvimento de métodos analíticos destinados ao controle de qualidade incluindo a determinação da concentração de selênio total e de suas espécies torna-se uma necessidade. Para isso, foram desenvolvidas metodologias para a quantificação de selênio total por ICP-MS e suas espécies inorgânicas (Se IV e Se VI) e selenometionina por HPLC-ICP-MS em amostras de suplementos alimentares enriquecidos em selênio e em amostra de levedura enriquecida isotopicamente em 78Se. A metodologia para determinação de selênio total, utilizando diferentes gases de reação, foi otimizada empregando planejamento experimental e os limites de detecção encontrados foram entre 0,01 mg kg(-1) (CH4) e 0,1 mg kg(-1) (NH3) e a concordância com o MRC Selm-1 de entre 99 por cento (NH3) e 104 por cento (CH4). Os resultados encontrados referentes à concentração de selênio nas amostras de suplementos alimentares apresentaram uma discrepância em relação ao valor informado no rótulo entre -29 por cento e +170 por cento e, de maneira complementar, o acoplamento do HPLC ao ICP-MS permitiu realizar a especiação de selênio nas amostras de suplemento alimentar. O emprego das técnicas ICP-MS, HPLC-ICP-MS e ESI-MS possibilitou a caracterização de uma amostra de levedura enriquecida isotopicamente em 78Se em termos de sua distribuição isotópica, concentração de selênio total e selenometionina bem como proteínas com peso molecular de aproximadamente 12 kDa. / [en] The consumption of dietary supplements has a significant increase in recent years mainly for a great appeal of this product in relation to a complementation of the diet with essential elements and an improvement and maintenance of health. The combination of increased consumption and free access to this product, associated to the lack in the inspection by government, makes their consumption uncontrolled and a potential risk to the citizen health. In this scenario the development of analytical methods for quality control, including a determination of the total selenium concentration and its species becomes a primordial necessity. For this, methodologies were developed for quantification of total selenium by ICP-MS and its inorganic species (Se IV and Se VI) and selenomethionine by HPLC-ICP-MS in samples of selenium-based food supplements and in isotopically enriched yeast sample in 78Se. The methodology for total selenium determination was optimized by experimental design and the limits of detection were in the range of 0.01 mg kg(-1) (CH4) and 0.1 mg kg(-1) (NH3) and the agreement with the CRM Selm-1 were between 99 percent (NH3) and 104 percent (CH4). The results found for selenium content in the food supplements samples presented a discrepancy in relation to the labeled value between -29 percent and + 170 percent and, complementarily, coupling of HPLC to ICP-MS allowed an speciation analysis in the food supplements samples. The use of the ICP-MS, HPLC-ICP-MS and ESI-MS techniques enabled a characterization of a 78Se isotopically enriched yeast sample in terms of its isotopic distribution, total selenium concentration and selenomethionine as well as proteins with molecular weight of approximately 12 kDa.