L'alcool (EtOH) est une des substances d'abus les plus consommées en France chez les adolescents comme chez les adultes. La consommation d'EtOH induit des déficits mnésiques en perturbant les phénomènes de plasticité synaptique de type potentialisation à long terme (PLT) et dépression à long terme (DLT) dépendants du récepteur NMDA (PLTNMDA et DLTNMDA), et qui constituent la base cellulaire des apprentissages et de la mémoire, notamment au niveau de l'hippocampe. La composition en sous-unités GluN2A et GluN2B du récepteur NMDA peut influencer l'induction de ces deux formes de plasticité synaptique selon le modèle théorique de Bienenstock et al. (1982). De plus, la plasticité synaptique est sous l'influence de mécanismes épigénétiques et/ou de facteurs de transcription. A l'heure actuelle, les mécanismes cellulaires qui sous-tendent la perturbation de la plasticité synaptique suite à la consommation d'EtOH demeurent mal compris. Durant ma thèse, j'ai testé l'hypothèse que les perturbations de la plasticité synaptique dépendante du NMDA impliqueraient une modulation des sous-unités GluN2A et GluN2B dans un modèle de binge drinking-like chez le rat jeune adulte et dans un modèle d'alcoolisation chronique chez des souris adultes. Afin de comprendre les mécanismes sous-tendant ces perturbations, j’ai étudié l'implication des facteurs épigénétiques et le rôle d'un facteur de transcription de la famille des heat shock factor, HSF2. Pour cela, j'ai utilisé la technique d'enregistrement de potentiel de champs somatique et dendritique (potentiel postsynaptique excitateur NMDA ; PPSE-NMDA) dans l'aire CA1 de tranches d'hippocampe. De manière intéressante, nos résultats montrent que les deux types d'alcoolisation, aigue et chronique, augmentent la sensibilité du PPSE-NMDA à un antagoniste de la sous-unité GluN2B alors que la sensibilité à l'antagoniste de la sous-unité GluN2A diminue. Chez le rat jeune adulte, ces modifications sont accompagnées d'une forte réduction de la DLTNMDA et d'un déficit d'apprentissage (test de reconnaissance de nouvel objet). Dans ce modèle, l'inhibition de l'activité des enzymes HDACs, responsables de la désacétylation des histones, prévient l'ensemble des effets de l’EtOH (sensibilité pharmacologique du PPSE-NMDA, DLTNMDA et apprentissage). Concernant HSF2 et avant toute alcoolisation, des souris adultes hsf-/- présentent une absence de DLTNMDA accompagnée d'une plus grande sensibilité du PPSE-NMDA à un antagoniste GluN2B comparé à des souris sauvages. L'exposition chronique à l'EtOH induit chez les souris sauvages, une abolition de la DLTNMDA accompagnée d'une augmentation de la sensibilité du PPSE-NMDA à un antagoniste GluN2B et à une diminution de la sensibilité de ce signal à un antagoniste GluN2A. En revanche, les souris hsf-/- ne présentent aucune de ces modifications. Ainsi, l'ensemble de mes travaux de thèse montre que quel que soit le type d'alcoolisation, aigue ou chronique, mais aussi l'espèce animale utilisée, rat ou souris, l'EtOH induit des adaptations du réseau hippocampique qui consiste en une augmentation de la sensibilité du PPSE-NMDA à un antagoniste GluN2B et en une diminution de sa sensibilité à un antagoniste GluN2A ; modifications qui accompagnent une abolition de la DLT. Cette réponse globale à l'EtOH mettrait en jeu des facteurs épigénétiques modulant l'état d'acétylation de l'ADN et des facteurs transcriptionnels de type heat shock / Alcohol (EtOH) remains one of the most consumed substances of abuse in France among adolescents and adults EtOH consumption, inducing learning deficits through disturbances of the NMDA-dependent form of synaptic plasticity (long term potentiation, LTP and long-term depression, LTD), the cellular signal responsible for learning and memory, notably into the hippocampus, involved in memory formation in mammals. Importantly, induction of NMDA-dependent synaptic plasticity relies on the subunit composition of the NMDA receptor (GluN2A and GluN2B) while mechanisms of genome regulation such as epigenetic or some transcription factors may have important role in determining the quality of synaptic plasticity signals. However, the molecular mechanisms by which EtOH disrupts NMDA-dependent synaptic plasticity are still unclear. During my thesis work, I tested the hypothesis that NMDA-dependent synaptic plasticity is disrupted by EtOH through the modulation of the involvement of GluN2B and GluN2A subunits of the receptor whatever the type of EtOH exposure, either acute in young adult (binge-drinking like model) rodents or chronic in adult rodents. I further tested the involvement of epigenetic and the role of HSF2, a transcription factor in the modifications induced by EtOH. Using pharmacological tools and field potential recordings in CA1 area of hippocampal slices from adolescent rats and adult mice, I found that both acute and chronic ethanol exposure increased field NMDA excitatory post synaptic potential (fNMDA-EPSP) sensitivity to a GluN2B antagonist while sensitivity to GluN2A antagonist was decreased. In adolescent rats, these modifications were accompanied with a lower LTD without affecting LTP and with memory impairment. Interestingly, inhibition of enzymes responsible for chromatin deacetylation (HDAC) in binge like adolescent rat model, prevents the EtOH effects in learning performance associated with a correction of the GluN2A/GluN2B balance and LTD. Concerning the role of HSF2, I found that before chronic EtOH consumption, fNMDA-EPSPs of HSF2 KO adult mice lack LTD and showed the opposite sensitivity to GluN2A and GluN2B antagonists compared to WT mice. Chronic EtOH exposure in HSF2 KO mice induced different adaptations than in WT animals. Altogether, my thesis work show that, 1) regardless the type of EtOH exposure, the hippocampus neuronal network adapt via changes in the balance between GluN2A and GluN2B subunits leading to LTD reduction and learning impairment; 2) these EtOH-induced changes in fNMDA-EPSPs involved epigenetic processes and 3) some transcription factors, affecting basal conditions of the role for GluN2A/GluN2B balance determines the capacity to respond to EtOH exposure

The heat-shock response is one of the many complex physiological systems that organisms have developed in order to protect their cells against stress. This response is initiated by the binding of heat shock factor 1 (HSF1) to the promoters of genes containing heat-shock elements (HSEs,) which results in the expression of several proteins, among them the proteo-protective inducible heat-shock protein (hsp70i). Due to HSF1s critical role in this process, an active area of research is trying to understand of how HSF1 executes its function. Considering the rapidity with which the field of cell biology is expanding, in particular the sub-field of nuclear compartmentalization, this study seeks to understand how nuclear structure affects the function of HSF1. Specifically, this study investigates the potential role for the interaction between HSF1 and the translocated promoter region protein (Tpr,) a structural component of the nuclear pore, an interaction initially identified by yeast two-hybrid analysis, in the transcription of hsp70i. Due to Tprs location and its putative function in nucleo-cytoplasmic trafficking, this works seeks to answer to the question, Does Tpr play a role in the export of HSF1-driven mRNAs? In a similar vein, heat-shock transcription factor 2 (HSF2,) a less well-understood member of the heat-shock transcription factor family, also interacts with Tpr in the yeast two-hybrid assay. HSF2 has recently been shown to have an active role during mitosis, when the hsp70i gene is being bookmarked for potential expression that might be needed in early G1, when most genes are unable to be expressed. This body of work also seeks to answer the question of, Does the Tpr/HSF2 interaction have a role in positioning the gene in relation to the nuclear pore after mitosis? This study was performed using both novel and standard in vivo and in vitro molecular biology techniques. It ultimately aims to clarify the less understood, although much broader, subject of how does transcription occur in the three-dimensional space of the nucleus.

At the beginning of mitosis, chromosomes are condensed and segregated to facilitate correct alignment later in cytokinesis. Condensin is the pentameric enzyme responsible for this DNA compaction and is composed of two structural maintenance of chromosomes (SMC) subunits and three non-SMC subunits. Condensin mutations generate chromosomal abnormalities due to improper segregation, leading to genome instability and eventual malignant transformation of the cell. Cdc2 phosphorylation of the non-SMC subunits, CAP-G, CAP-D2, and CAP-H, has been demonstrated to be important for condensin supercoiling activity and function. While these subunits are thought to be phosphorylated by Cdc2, the exact sites have not yet been identified and characterized. The basis of this research was to determine the Cdc2 phosphorylation sites in the CAP-G subunit of the condensin enzyme and to characterize the functional significance of the sites in the regulation of condensin activity using site-directed mutagenesis and immunofluoresence microscopy. While DNA condensation represents a critical step early in mitosis, formation of the mitotic spindle represents a vital event leading to the division of a cell into two daughter cells in a process known as cytokinesis. Protein regulating cytokinesis 1 (PRC1) is a mitotic protein essential for cytokinesis that participates in formation of the mitotic spindle in a phosphorylation dependent manner. PRC1 possesses microtubule bundling properties. Loss of PRC1 leads to mis-segregation of chromosomes and abnormal cytokinesis. HSF2 is a transcription factor known to be important in development and differentiation. Previous research has determined that HSF2 plays a significant mechanistic role in the process of hsp70i gene bookmarking during mitosis. Bookmarking is an epigenetic phenomenon whereby certain gene promoters remain uncompacted, in contrast to the majoritiy of genomic DNA during mitosis. This lack of compaction allows quick reassembly to a transcriptionally competent in G1 of the cell cycle and ensures the ability of the cell to induce expression of the cytoprotective hsp70i protein. HSF2 and PRC1 were found to interact in a yeast-two hybrid screen. Given the importance of both of these proteins during mitosis, this study seeks to characterize the HSF2/PRC1 interaction and determine the potential role for PRC1 in hsp70i gene bookmarking.

Un certain nombre d’études épidémiologiques font état d’une augmentation de l’infertilité masculine durant ces cinquante dernières années, en particulier dans les pays industrialisés, mais aussi d’une augmentation des malformations de l’appareil reproducteur masculin telles que la cryptorchidie (absence de migration des testicules dans les bourses) ou l’hypospadias (malformation du pénis), et des cancers testiculaires. Des données expérimentales suggèrent que ces anomalies du tractus génital mâle sont liées. Ces symptômes forment le syndrome de dysgénésie testiculaire. Les causes d’apparition ce syndrome semblent être d’origine environnementale. En effet, les évolutions relativement rapides de ce syndrome suggèrent des facteurs dynamiques, en lien avec le mode de vie ou l’environnement. Une des hypothèses est que, l’exposition durant la vie fœtale ou néonatale à des composés présents dans l’environnement capables d’interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens environnementaux, PEEs), serait responsable de l’augmentation de l’incidence de ces pathologies. Au banc des principaux accusés, les molécules qui possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. A ce jour, les mécanismes d’action à l’origine du syndrome de dysgénésie testiculaire sont encore mal connus. Certaines études suggèrent des mécanismes de type épigenétique dans les effets à long terme des PEEs. L’objectif de notre travail était d’identifier et caractériser les mécanismes d’action de type épigenétique impliqué dans l’infertilité mâle. Pour cela, nous avons utilisé un modèle expérimental (rats nouveau-nés) reposant sur une exposition développementale à un estrogène (estradiol benzoate). Ce modèle induit chez le rat adulte un phénotype d’hypospermatogenèse liée à une à apoptose chronique des cellules germinales testiculaires. Nous montrons que ce phénotype est lié à l’altération de deux voies, impliquant en amont des effecteurs épigénétiques. La première voie implique la famille des miR-29s. Ainsi, nous observons une augmentation de l’expression des miR-29a, b, c qui provoque une diminution de deux de ses cibles: la protéine antiapoptotique MCL-1 et les enzymes de méthylation de l’ADN DNMTs. La chute des DNMTs entraine une hypométhylation globale (estimée à travers le gène Line-1) et spécifique du facteur de choc thermique HSF1. Ceci provoque une réexpression de ces facteurs entrainant l’apoptose des cellules germinales adultes. La deuxième voie implique le miR-18a. L’augmentation de son expression provoque une chute de l’expression de sa cible HSF2 qui régule la protéine de choc thermique HSP70/HSPA2. Le faible taux d’HSPA2 est une autre explication de l’apoptose des cellules germinales dans notre modèle. Nous montrons aussi que ce phénotype est irréversible lorsque l’exposition à lieu chez le nouveau-né alors qu’il est réversible quand l’exposition à lieu à l’âge adulte. Ces données suggèrent que l’exposition néonatale à l’estradiol benzoate induit une programmation développementale de l’hypospermatogenèse.Enfin, les anomalies tissulaires d’expression des miRNAs se retrouvent au niveau sanguin, suggérant leur utilisation potentielle comme biomarqueurs. Nous avons validé cet aspect chez l’homme en montrant que l’expression des miR29s et du miR-18a était plus élevée chez les patients oligo- ou azoospermiques que les chez patients normospermiques.En conclusion, nos résultats indiquent que l’hypospermatogenèse due à une apoptose chronique des cellules germinales observée chez l’animal adulte après exposition néonatale à l’EB met en jeu une modification d’expression de plusieurs effecteurs épigénétiques clés: miR-29s, miR-18a et DNMTs. De plus, les miR-29s et miR-18a pourraient être de nouveaux biomarqueurs circulants non invasifs de la stérilité masculine dans le contexte d’une oligo ou azoospermie chez l'homme. / Epidemiological studies have reported an increase in male infertility over the past fifty years, especially in industrialized countries, but also an increase in malformations of the male reproductive tract such as cryptorchidism (no migration of the testes into the scrotum) and hypospadias (malformation of the penis), and testicular cancers. Experimental data suggest that these abnormalities of the male genital tract are related. These symptoms form the testicular dysgenesis syndrome. The causes of the occurrence of this syndrome appear to be environmental in origin. Indeed, the relatively rapid evolution of this syndrome suggests dynamic factors related to lifestyle or environment. One hypothesis is that exposure during fetal or neonatal life to compounds present in the environment can interfere with the hormonal system (environmental endocrine disruptors), would be responsible for the increased incidence of these pathologies. Bench of the main accused, molecules that have estrogenic or anti-androgenic activity types. To date, the mechanisms of action behind the testicular dysgenesis syndrome are poorly understood. Some studies suggest that epigenetic mechanisms are at playThe objective of our work was to identify and characterize the epigenetic mechanisms of action involved in male infertility induced by neonatal exposure to xenoestrogen. For this, we used an experimental model based on a developmental exposure to estrogen (estradiol benzoate). This model induced in adult rats a hypospermatogenesis phenotype due to chronic apoptosis of germ cells.We show that this phenotype is related to an alteration of two pathways, involving upstream effectors epigenetic. The first pathway involves the family of miR- 29s. Thus, we observe an up-regulation of miR -29a, b, c, which causes a decrease in two of his targets: the anti-apoptotic protein MCL- 1 and the enzymes of DNA methylation DNMTs. Falling DNMTs leads to a global hypomethylation (estimated through the Line -1 gene) and to specific hypomethylation of the heat shock factor, HSF1. This causes a re-expression of factors that induce apoptosis in adult germ cells. The second pathway involves up-regulation of miR -18a that causes a down-regulation of its target HSF2 which regulates the heat shock protein HSP70/HSPA2. The down-regulation of HSPA2 is another explanation of germ cell apoptosis in our model. We also show that this phenotype is irreversible when the estrogen exposure takes place in the newborn whereas it is reversible when exposure takes place in adulthood, suggesting that neonatal exposure to estradiol benzoate induced a developmental programming of hypospermatogenesis.Finally, abnormal tissue expressions of miRNAs are found in the blood, suggesting their potential use as biomarkers. We validated this aspect in humans showing that the expression of miR29s and miR-18a was higher in patients with decrease or no sperm counts compared to normal sperm count. In conclusion, our results indicate that hypospermatogenesis due to chronic germ cell apoptosis observed in adult animals after neonatal exposure to EB involves a change in expression of several key epigenetic effectors: miR-29, miR-18a and DNMTs. In addition, miR-29 and miR-18a could be new non invasive circulating biomarkers of men infertility.

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) regulates numerous biological functions. In a previous study we found that sumoylation of HSF2 is involved in regulating HSF2 bookmarking function, but the mechanism that mediates this regulation was unknown. The results in my work support the intriguing hypothesis that polycomb protein, Mel-18, actually functions as an anti-SUMO E3 protein, interacting both with HSF2 and the SUMO E2 Ubc9, but acting to inhibit Ubc9 activity and thereby decrease sumoylation of the HSF2. This study also suggested that Mel-18 negatively regulates the sumoylation of other cellular proteins, and we extend its targets to RanGAP1 protein. The results also show that RanGAP1 sumoylation is decreased during mitosis, and that this is associated with increased interaction between RanGAP1 and Mel-18. Previous studies showed little evidence of anti-SUMO E3 proteins, however, my study, taken together, found Mel-18 actually functions as a novel anti-SUMO E3 protein, interacting both with substrates and the SUMO E2 Ubc9 but acting to inhibit Ubc9 activity to decrease sumoylation of target proteins and also provide an explanation for how mitotic HSF2/RanGAP1 sumoylation is regulated. This finding also gives a clue for a future study direction in Mel-18 as a tumor suppressor: the anti-SUMO E3 function. Additionally, we identify a single-nucleotide polymorphism in another human PcG protein, Bmi-1, that changes a cysteine residue within its RING domain, cysteine 18, to a tyrosine. This C18Y polymorphism is associated with a significant decrease in levels of the Bmi-1 protein. Furthermore, the C18Y Bmi-1 protein exhibits a very high level of ubiquitination compared to wild-type Bmi-1, suggesting that that the low levels of this form of Bmi-1 are due to its destruction by the ubiquitin-proteasome system. Consistent with this hypothesis, treatment of cells with the proteasome inhibitor MG-132 results in a significant increase in levels of C18Y Bmi-1. This is the first example of a polymorphism in human Bmi- 1 that reduces levels of this important protein.

Un certain nombre d'études épidémiologiques font état d'une augmentation de l'infertilité masculine durant ces cinquante dernières années, en particulier dans les pays industrialisés, mais aussi d'une augmentation des malformations de l'appareil reproducteur masculin telles que la cryptorchidie (absence de migration des testicules dans les bourses) ou l'hypospadias (malformation du pénis), et des cancers testiculaires. Des données expérimentales suggèrent que ces anomalies du tractus génital mâle sont liées. Ces symptômes forment le syndrome de dysgénésie testiculaire. Les causes d'apparition ce syndrome semblent être d'origine environnementale. En effet, les évolutions relativement rapides de ce syndrome suggèrent des facteurs dynamiques, en lien avec le mode de vie ou l'environnement. Une des hypothèses est que, l'exposition durant la vie fœtale ou néonatale à des composés présents dans l'environnement capables d'interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens environnementaux, PEEs), serait responsable de l'augmentation de l'incidence de ces pathologies. Au banc des principaux accusés, les molécules qui possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. A ce jour, les mécanismes d'action à l'origine du syndrome de dysgénésie testiculaire sont encore mal connus. Certaines études suggèrent des mécanismes de type épigenétique dans les effets à long terme des PEEs. L'objectif de notre travail était d'identifier et caractériser les mécanismes d'action de type épigenétique impliqué dans l'infertilité mâle. Pour cela, nous avons utilisé un modèle expérimental (rats nouveau-nés) reposant sur une exposition développementale à un estrogène (estradiol benzoate). Ce modèle induit chez le rat adulte un phénotype d'hypospermatogenèse liée à une à apoptose chronique des cellules germinales testiculaires. Nous montrons que ce phénotype est lié à l'altération de deux voies, impliquant en amont des effecteurs épigénétiques. La première voie implique la famille des miR-29s. Ainsi, nous observons une augmentation de l'expression des miR-29a, b, c qui provoque une diminution de deux de ses cibles: la protéine antiapoptotique MCL-1 et les enzymes de méthylation de l'ADN DNMTs. La chute des DNMTs entraine une hypométhylation globale (estimée à travers le gène Line-1) et spécifique du facteur de choc thermique HSF1. Ceci provoque une réexpression de ces facteurs entrainant l'apoptose des cellules germinales adultes. La deuxième voie implique le miR-18a. L'augmentation de son expression provoque une chute de l'expression de sa cible HSF2 qui régule la protéine de choc thermique HSP70/HSPA2. Le faible taux d'HSPA2 est une autre explication de l'apoptose des cellules germinales dans notre modèle. Nous montrons aussi que ce phénotype est irréversible lorsque l'exposition à lieu chez le nouveau-né alors qu'il est réversible quand l'exposition à lieu à l'âge adulte. Ces données suggèrent que l'exposition néonatale à l'estradiol benzoate induit une programmation développementale de l'hypospermatogenèse.Enfin, les anomalies tissulaires d'expression des miRNAs se retrouvent au niveau sanguin, suggérant leur utilisation potentielle comme biomarqueurs. Nous avons validé cet aspect chez l'homme en montrant que l'expression des miR29s et du miR-18a était plus élevée chez les patients oligo- ou azoospermiques que les chez patients normospermiques.En conclusion, nos résultats indiquent que l'hypospermatogenèse due à une apoptose chronique des cellules germinales observée chez l'animal adulte après exposition néonatale à l'EB met en jeu une modification d'expression de plusieurs effecteurs épigénétiques clés: miR-29s, miR-18a et DNMTs. De plus, les miR-29s et miR-18a pourraient être de nouveaux biomarqueurs circulants non invasifs de la stérilité masculine dans le contexte d'une oligo ou azoospermie chez l'homme.