Insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs) are known to be important modulators of the insulin-like growth factor (IGF-I). However, their precise role is as yet unclear. Further, recent studies have indicated that IGFBP-3 has a receptor mediated growth inhibitory response of its own. In the present study, we quantified the binding characteristics of IGFBP-3 to bovine aortic endothelial (BAE) cells. Binding studies at 4 ^oC were conducted and a specific binding curve for IGFBP-3 was obtained. IGFBP-3 was found to bind with an equilibrium dissociation constant (K_D) value of 3.1 x 10^-10 M. The role of heparan sulfate proteoglycans (HSPG) in the IGFBP-3 binding mechanism was also examined. It was seen that inactivation of the cell surface HSPGs with 75 mM sodium chlorate did not affect IGFBP-3 binding. Further, there have been reports of inhibition of IGFBP-3 binding by heparin in the media. Hence, the most probable interaction of HSPG with IGFBP-3 occurs in the extracellular region, with soluble HSPGs acting as receptors for IGFBP-3 and decreasing the net cell associated ligand receptor interaction. This is likely, since IGFBP-3 is known to possess a heparin binding domain. Simultaneous introduction of IGF-I and IGFBP-3 into the extracellular media decreased IGFBP-3 binding to the cell surface, which might imply that IGF-I and IGFBP-3 regulate each other's action. / Master of Science

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Les protéoglycanes à héparane-sulfates (HSPGs) sont des macromolécules ubiquitaires situées à la surface des cellules et au sein des matrices extracellulaires jouant un rôle clé dans le contrôle des interactions cellules-matrice et du micro-environnement tumoral. Leur biosynthèse est assurée par une machinerie enzymatique complexe impliquant des glycosyltransférases et sulfotransférases, lesquelles ajoutent des motifs sulfatés en différentes positions des résidus de la chaîne glucidique. Ces modifications confèrent aux HSPGs la capacité d’interagir avec de nombreux ligands comme les facteurs de croissance et leurs récepteurs permettant de réguler divers processus physiopathologiques tels que la prolifération et la survie cellulaires, l’angiogenèse et le développement tumoral. J’ai focalisé mon étude sur une famille de sulfotransférases, les 3-O-sulfotransférases (3-OSTs) responsables d’une modification rare et terminale des chaînes de HS et en particulier sur l’isoforme 3A (3-OST3A) dont le rôle dans le développement tumoral a été précédemment mis en évidence par notre équipe. L’objectif de ce travail de thèse est d’explorer le rôle de la 3-OST3A dans la régulation du développement du cancer du sein. Ces travaux mettent en évidence que le gène 3-OST3A est régulé épigénétiquement dans un panel de lignées cellulaires cancéreuses mammaires. Les tests cellulaires de prolifération et d’apoptose montrent que la 3-OST3A exerce une action oncogénique ou suppresseur de tumeur dépendante de la signature moléculaire des cellules cancéreuses mammaires. Au niveau clinique, un fort taux d’expression de la 3-OST3A dans les tumeurs est corrélé négativement avec la survie des patientes atteintes d’un cancer du sein de sous-type HER2+. Ces travaux sont les premiers à mettre en évidence un rôle fonctionnel de la 3-OST3A en tant que régulateur du comportement tumoral des cellules cancéreuses mammaires et permettent de l’envisager comme marqueur pronostique de l’évolution du sous-type de tumeur mammaire HER2. La poursuite de cette étude a pour objectif de comprendre les mécanismes qui expliquent les conséquences délétères de la forte expression de la 3-OST3A sur l’agressivité du cancer du sein HER2+. Mes résultats suggèrent que la 3-OST3A induirait l’activation du récepteur HER2 par une voie dépendante de la formation du complexe ternaire HS 3-O-sulfatés/FGF-7/FGFR2IIIb dans les cellules SKBR3, un modèle de cellules cancéreuses mammaires surexprimant le récepteur HER2 responsable du caractère agressif du cancer du sein HER2+ / Heparan sulfate proteoglycans (HSPG) are ubiquitous macromolecules located at the cell plasma membrane and in extracellular matrices playing a key role in the control of cell-matrix interactions and in the tumor micro-environment. Their biosynthesis is performed by a complex enzymatic machinery involving glycosyltransferases and sulfotransferases, the latter adding a sulfate group at different residue positions of the polysaccharide chain. These modifications provide to the HSPG the ability to interact with many ligands such as growth factors and their receptors, and to regulate multiple pathophysiological processes such as cell proliferation and survival, angiogenesis and tumor development. I focused on a sulfotransferase family, the heparan sulfate 3-O-sulfotransferases (HS3STs) responsible for a rare, terminal modification of HS chains. Specifically, we investigated the HS3ST3A isoform whose role in tumor development has been previously demonstrated by our team. Here I explored the role of HS3ST3A in breast cancer. My studies demonstrate that HS3ST3A gene is epigenetically regulated in a panel of breast cancer cell lines. Cell proliferation and apoptosis assays in cellulo showed that HS3ST3A exerts an oncogenic or tumor suppressor effect in a cell-dependent context. A clinical study performed in a cohort of breast cancer patients showed that a high expression level of HS3ST3A in tumors is associated with reduced relapse-free survival in HER2+ patients. For the first time, we report a functional role of HS3ST3A as a tumor regulator of breast cancer cells behavior and this study allows considering it as a prognostic marker of the HER2 breast cancer evolution. The last part of my work attempted to understand the mechanisms that explain the deleterious consequences of the high expression level of HS3ST3A on the aggressiveness of HER2+ breast cancer. In this regard, my results suggested that the HS3ST3A may induce HER2 receptor activation following the formation of the ternary complex HS 3-O-sulphated/FGF-7/FGFR2IIIb in SKBR3 (HER2+) cells

L’infection par le virus de l’hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladies hépatites sévères et constitue un problème majeur de santé public. Le HCV est associé aux lipopoprotéines formant une lipoviroparticule (LVP) qui est la forme infectieuse du virus. L’apolipoprotéine E (apoE), associée aux lipoprotéines, est impliquée dans les étapes précoces et tardives de l’infection. Elle interagit avec de récepteurs impliqués dans le métabolisme lipidique tels les héparanes sulfates protéoglycanes (HSPG). Durant ma thèse, j’ai démontré que les acides aminés chargés positivement du domaine de liaison aux HSPG d’apoE sont impliqués dans l’entrée du HCV dans l’hépatocyte. J’ai également démontré que la production et/ou l’infectiosité des particules virales est corrélée au taux d’expression d’apoE dans les cellules sans avoir d’impact sur la traduction ou la réplication virales. Enfin, j’ai identifié syndecan-4, un membre de la famille des HSPG, comme l’HSPG principal impliqué dans l’entrée du HCV dans les lignées Huh7.5.1. L’ensemble de ces résultats démontre qu’HCV utilise l’interaction apoE-SDC4 pour établir une infection virale efficace. / Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of liver disease worldwide and represents a major health problem. HCV associates with host lipoproteins forming host/viral hybrid complexes termed lipoviral particles. Apolipoprotein E (apoE) is a lipoprotein component that interacts with heparan sulfate proteoglycans (HSPG) to mediate hepatic lipoprotein uptake, and may likewise mediate HCV entry. I sought to define the functional regions of apoE with an aim to identify critical apoE binding partners involved in HCV infection. I demonstrated a direct correlation of apoE expression and HCV infectivity, whereas no correlation exists with viral protein translation or replication. Mutating the HSPG binding domain (HSPG-BD) of apoE revealed key residues that are critical for mediating HCV infection. Finally, I identified Syndecan-4 (SDC4), an HSPG family member, as the principal HSPG mediating HCV entry. Our data demonstrate that HCV uses apoE-SDC4 interactions to enter hepatocytes and establish efficient viral infection.

Janus Kinase (JAK) activity specifies the cell fates of the follicular epithelium during Drosophila oogenesis by establishing a gradient of JAK activity with highest levels at the A/P poles. Unpaired (Upd), a ligand for the pathway, is expressed and secreted exclusively from the polar cells potentially establishing the JAK activity gradient. This project proposed that Upd acts as a morphogen to directly establish the JAK activity gradient, specifying the fates of the follicular epithelium. The aims of this work were to investigate the extracellular distribution of Upd and, in addition, factors that may be involved. Furthermore, upd3, a gene encoding a protein with sequence similarity to Upd, is also co-expressed with upd in the polar cells. An additional aim of this project was to determine what role, if any, Upd3 plays in follicular development. Immunostaining was used to reveal Upd distribution during oogenesis. The data revealed an Upd gradient on the apical membrane of the follicular epithelium. By virtue of the extracellular gradient, Upd fulfills the requirements necessary to be classified as a morphogen. Some morphogens are dependent on heparan sulphate proteoglycans (HSPGs) for distribution. Using mitotic recombination to make mosaics, this work reveals that Dally, a glypican, is essential for the distribution of Upd and establishment of the JAK gradient during oogenesis. The data suggests Dally is involved with stability of extracellular Upd. Mosaic analysis of an additional HSPGs revealed that they are not essential for the Upd gradient or JAK activity during oogenesis. upd3 mutant flies have small eyes and outstretched wings, a phenotype consistent reduced JAK activity. In upd3 mutant ovaries it is shown that there is a higher frequency of deteriorating egg chambers, a higher frequency of egg chamber fusions, and a decrease in border cells per egg chamber compared to wildtype controls; all of which support a reduction of JAK activity. Furthermore, ovarian phenotypes of upd3 get worse as the fly ages suggesting that upd3 is required over time. The data presented suggests that Upd3 does act to maintain JAK activity in the ovary as the fly ages.

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Les techniques de criblage actuelles (in vitro et in silico) sont dépendantes des efforts menés en biologie médicinale pour identifier des cibles biologiques pertinentes ; cibles difficiles à définir pour les maladies génétiques dites "perte de fonction". De plus, les composés issus de ces cribles s'avèrent souvent inefficaces et/ou toxiques une fois confrontés à la complexité physiologique d'un organisme entier. Pour contourner ce problème, nous proposons d'utiliser le nématode C. elegans, notamment pour des maladies répondant aux critères suivants : i) physiopathologie complexe et/ou mal comprise excluant le développement à court terme de médicaments sur une base rationnelle, ii) peu d’espoir de thérapie génique/cellulaire à court terme, iii) conservation chez C. elegans du gène relié à la maladie humaine et induisant un phénotype exploitable une fois inactivé. Nous démontrons ici que ce petit nématode permet de tester, à moindre coût, un grand nombre de composés chimiques tout en conservant la complexité physiologique d'un animal entier. De plus, la souplesse génétique de cet animal permet d'apporter rapidement des informations sur le mode d'action des composés identifiés. Ainsi, en plus du but initial visant à identifier des molécules bioactives à intérêt thérapeutique, cette approche peut permettre de dégager de nouvelles cibles moléculaires utiles pour l'industrie chimique, et cruciales pour la recherche de traitements contre les maladies perte de fonction. Finalement, nous présentons comment mettre en place une telle stratégie, notamment pour la myopathie de Duchenne, l'amyotrophie spinale et le syndrome de Schwartz-Jampel. Enfin, nous présentons les résultats obtenus lors des différentes campagnes de criblage, les validations des molécules les plus prometteuses et les travaux effectués pour tenter de comprendre leur mode d'action chez le nématode. / Current high-throughput screening methods for drug discovery rely on the existence of targets. Moreover, most of the hits generated during screenings turn out to be invalid after further testing in animal models. To by-pass these limitations, efforts are now being made to screen chemical libraries on whole animals. One of the most commonly used animal model in biology is the murine model Mus musculus. However, its cost limits its use in large-scale therapeutic screening. In contrast, the nematode Caenorhabditis elegans is gaining momentum as screening chemical tool. This tiny worm combines genetic amenability, low cost, and culture conditions that are compatible with large-scale screens. Its main advantage is to allow high-throughput screening in a whole-animal context. Moreover, its use is not dependent on the prior identification of a target and permits the selection of compounds with an improved safety profile. Here, we introduce this approach with the Duchenne Muscular Dystrophy, the Spinal Muscular Dystrophy and the Schwartz-Jampel syndrome. We present the methodology used with each model to screen up to 7,000 compounds and the results of these screening campaigns. We further present the validation of our best hits and try to understand their mechanism of action.

Les techniques de criblage actuelles (in vitro et in silico) sont dépendantes des efforts menés en biologie médicinale pour identifier des cibles biologiques pertinentes ; cibles difficiles à définir pour les maladies génétiques dites "perte de fonction". De plus, les composés issus de ces cribles s'avèrent souvent inefficaces et/ou toxiques une fois confrontés à la complexité physiologique d'un organisme entier. Pour contourner ce problème, nous proposons d'utiliser le nématode C. elegans, notamment pour des maladies répondant aux critères suivants : i) physiopathologie complexe et/ou mal comprise excluant le développement à court terme de médicaments sur une base rationnelle, ii) peu d'espoir de thérapie génique/cellulaire à court terme, iii) conservation chez C. elegans du gène relié à la maladie humaine et induisant un phénotype exploitable une fois inactivé. Nous démontrons ici que ce petit nématode permet de tester, à moindre coût, un grand nombre de composés chimiques tout en conservant la complexité physiologique d'un animal entier. De plus, la souplesse génétique de cet animal permet d'apporter rapidement des informations sur le mode d'action des composés identifiés. Ainsi, en plus du but initial visant à identifier des molécules bioactives à intérêt thérapeutique, cette approche peut permettre de dégager de nouvelles cibles moléculaires utiles pour l'industrie chimique, et cruciales pour la recherche de traitements contre les maladies perte de fonction. Finalement, nous présentons comment mettre en place une telle stratégie, notamment pour la myopathie de Duchenne, l'amyotrophie spinale et le syndrome de Schwartz-Jampel. Enfin, nous présentons les résultats obtenus lors des différentes campagnes de criblage, les validations des molécules les plus prometteuses et les travaux effectués pour tenter de comprendre leur mode d'action chez le nématode.