O objetivo desta pesquisa foi estabelecer uma metodologia para avaliar carcinomas espinocelulares (CEC) de cabeça e pescoço, identificando e distinguindo áreas de maior atividade metabólica dentro da neoplasia, associando dados simultaneamente adquiridos, obtidos por diferentes modalidades de aquisição de imagens, combinando informações metabólicas e anatômicas num único exame. A população estudada consistiu de 17 pacientes com carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço pertencentes aos arquivos do Departamento de Imagem do Hospital do Câncer, São Paulo. As imagens de TC (tomografia computadorizada) e do 18 F-FDG-PET (tomografia por emissão de pósitrons) foram simultaneamente adquiridas utilizando um aparelho não dedicado. Os dados originais foram transferidos para uma estação de trabalho independente com programa de computação gráfica para o processamento dos grupos individuais e fusão em um único grupo, contendo os dados fisiológicos e metabólicos. Os achados foram definidos como positivos na presença de focos com aumento da concentração do radiofármaco em áreas não relacionadas à distribuição normal do mesmo. Em 77% dos casos (n=13), a hipercaptação foi detectada ao centro da lesão e em 23% (n=4) dos casos houve comportamento diferente, com hipercaptação excêntrica. A fusão de imagens simultaneamente adquiridas num único exame ( 18 F- FDG PET e TC) possibilitou o mapeamento topográfico metabólico das lesões estudadas e foi possível localizar áreas de maior atividade metabólica dentro do próprio 13 tumor, verificando recidivas ou metástases, possibilitando aumentar as opções quanto ao planejamento radioterápico ou cirúrgico a serem seguidos. / The aim of this study is to propose a methodological approach to evaluate head and neck squamous cell carcinoma (SCCA) in order to identify and to distinguish areas of higher metabolic activity inside the lesion combining the functional metabolic and morphological data simultaneously acquired in a non dedicated PET-CT device. The study population consisted of 17 patients, with SCCA of the head and neck carcinoma. These patients were submitted to a non-dedicated 18 F- FDG- PET imaging using a system with low dose CT and Positron emission coincidence acquisition capabilities. The image acquisition was then transferred to an ENTEGRA 2 NT workstation to generate groups of individual images (metabolic and anatomical data) and image fusion (CT + PET). In those patients with anomalous concentrations of 18 F-FDG, the lesion was depicted on three planes (axial, coronal and sagittal) in CT, PET, and the image fusion at the computer screen. The findings were defined as positive in the presence of well-defined focal area of increased uptake in regions unrelated to the normal biodistribution of the tracer on visual inspection. Two examiners interpreted the images in different sessions, in order to get an agreement. Subsequently, the sites of higher metabolic activity inside the tumor were identified and classified in centric or eccentric, according to their relative location. Observing the images, we found 77.00% of the patients with the site of higher activity at the center of lesion. In 23.00% of the patients a different 15 behavior, with the tracer increased eccentrically to the lesion. This technique gave a realistic view of the functional metabolism, locating the anatomical tumor area and helping in future treatment planning.

O objetivo desta pesquisa foi estabelecer uma metodologia para avaliar carcinomas espinocelulares (CEC) de cabeça e pescoço, identificando e distinguindo áreas de maior atividade metabólica dentro da neoplasia, associando dados simultaneamente adquiridos, obtidos por diferentes modalidades de aquisição de imagens, combinando informações metabólicas e anatômicas num único exame. A população estudada consistiu de 17 pacientes com carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço pertencentes aos arquivos do Departamento de Imagem do Hospital do Câncer, São Paulo. As imagens de TC (tomografia computadorizada) e do 18 F-FDG-PET (tomografia por emissão de pósitrons) foram simultaneamente adquiridas utilizando um aparelho não dedicado. Os dados originais foram transferidos para uma estação de trabalho independente com programa de computação gráfica para o processamento dos grupos individuais e fusão em um único grupo, contendo os dados fisiológicos e metabólicos. Os achados foram definidos como positivos na presença de focos com aumento da concentração do radiofármaco em áreas não relacionadas à distribuição normal do mesmo. Em 77% dos casos (n=13), a hipercaptação foi detectada ao centro da lesão e em 23% (n=4) dos casos houve comportamento diferente, com hipercaptação excêntrica. A fusão de imagens simultaneamente adquiridas num único exame ( 18 F- FDG PET e TC) possibilitou o mapeamento topográfico metabólico das lesões estudadas e foi possível localizar áreas de maior atividade metabólica dentro do próprio 13 tumor, verificando recidivas ou metástases, possibilitando aumentar as opções quanto ao planejamento radioterápico ou cirúrgico a serem seguidos. / The aim of this study is to propose a methodological approach to evaluate head and neck squamous cell carcinoma (SCCA) in order to identify and to distinguish areas of higher metabolic activity inside the lesion combining the functional metabolic and morphological data simultaneously acquired in a non dedicated PET-CT device. The study population consisted of 17 patients, with SCCA of the head and neck carcinoma. These patients were submitted to a non-dedicated 18 F- FDG- PET imaging using a system with low dose CT and Positron emission coincidence acquisition capabilities. The image acquisition was then transferred to an ENTEGRA 2 NT workstation to generate groups of individual images (metabolic and anatomical data) and image fusion (CT + PET). In those patients with anomalous concentrations of 18 F-FDG, the lesion was depicted on three planes (axial, coronal and sagittal) in CT, PET, and the image fusion at the computer screen. The findings were defined as positive in the presence of well-defined focal area of increased uptake in regions unrelated to the normal biodistribution of the tracer on visual inspection. Two examiners interpreted the images in different sessions, in order to get an agreement. Subsequently, the sites of higher metabolic activity inside the tumor were identified and classified in centric or eccentric, according to their relative location. Observing the images, we found 77.00% of the patients with the site of higher activity at the center of lesion. In 23.00% of the patients a different 15 behavior, with the tracer increased eccentrically to the lesion. This technique gave a realistic view of the functional metabolism, locating the anatomical tumor area and helping in future treatment planning.

Proteína 2 ligante de SH3 ativadora da GTPase de Ras (G3BP2) parece estar envolvido em vias importantes de sobrevivência celular como a via do NF-B. Já o fator tecidual (TF) e sua isoforma asHTF parecem estar envolvidos nos processos de angiogênese, proliferação e metástase. Assim, os genes G3BP2, TF e asHTF parecem possíveis fatores prognósticos em carcinoma epidermóide (CE) de cabeça e pescoço. Para avaliar a importância desses genes nesse tipo de câncer, foi realizada a quantificação da expressão do RNAm desses marcadores por PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real em tumores primário e mucosas adjacente de 148 pacientes com CE de cavidade oral, língua e laringe e a proteína de TF e asHTF foi determinada por Western blotting em 17 pacientes com CE de cavidade oral. Os dados da expressão do RNAm foram correlacionados com variáveis clínico-patológicos e sobrevida dos pacientes. A expressão relativa do RNAm de G3BP2 foi menor nos tumores primários em relação à mucosa adjacente em todos os sítios analisados. TF e asHTF não apresentaram nenhuma correlação entre a expressão relativa no tumor primário e na mucosa adjacente para os três sítios analisados. Quando comparados aos tumores sem comprometimento linfonodal (pN0), tumores de cavidade oral e língua com comprometimento linfonodal (pN+) apresentaram maior expressão de TF (P=0,003; P=0,033, respectivamente) e de asHTF (P=0,004; P=0,018, respectivamente Teste não paramétrico de Mann-Whitney). Em seguida, construímos as curvas de sobrevida pelo método de Kaplan-Meier considerando como positivos os pacientes com expressão maior que a mediana para cada marcador. Para os CE de cavidade oral, pacientes com expressão positiva dos genes TF (P=0,034 Teste Log-rank) e asHTF (P=0,010) apresentaram pior sobrevida livre de doença na análise univariada. Quando realizado a análise multivariada tanto TF como asHTF mantiveram a significância estatística (P=0,002 para ambos os genes), sugerindo, assim, serem fatores prognósticos independent. A análise da proteína apontou 76,4% de concordância no padrão de expressão do RNAm de TF e 58,8% para a expressão do RNAm de asHTF. Não foi observada nenhuma correlação entre esses marcadores com outros dados clínico-patológicos e nem com a sobrevida dos pacientes para os tumores de língua e laringe. Assim, sugerimos que a expressão de TF e asHTF parecem ser marcadores prognósticos nos CE de cavidade oral principalmente em relação a sobrevida livre de doença. Apoio FAPESP 06/53755-5 / GTPase activating protein (SH3 domain) binding protein 2 (G3BP2) seems to be involved in pathways important for cell survival as NF- B pathway. Tissue factor (TF) and its isoform asHTF appear to be involved in angiogenesis, proliferation and metastasis. Thus, the genes G3BP2, TF and asHTF seem possible prognostic factors in head and neck squamous cell carcinoma (SCC). To assess the importance of these genes in this type of cancer, we performed mRNA expression analysis of these markers by real time PCR (polymerase chain reaction) in primary tumors and adjacent mucosa of 148 patients with oral cavity, tongue and larynx SCC. TF and asHTF protein was determined by Western blotting in 17 patients with oral cavity SCC. mRNA expression levels were correlated with clinical and pathological variables and survival of patients. G3BP2 mRNA expression was lower in primary tumors as compared to adjacent mucosa at all sites analyzed. No difference was found between TF and asHTF expression in primary tumors and adjacent mucosa in the whole group. TF and asHTF levels mRNA expression were higher in pN+ tumors as compared to pN0 in oral cavity (P=0.003, P = 0.004, respectively) and tongue (P= 0.033, P= 0.018, respectively - Mann-Whitney test) tumors. For Kaplan Meier survival analysis patients were categorized positive (expression > tumor median relative expression) and negative (expression tumor median relative expression). For oral cavity SCC, patients with positive expression of TF (P =0.034 - log-rank test) and asHTF (P =0.010) genes presented shorter disease-free survival in univariate analysis. In multivariate analysis both TF as asHTF retained statistical significance (P=0.002 for both genes), suggesting, therefore, are independent prognostic factors. Protein analysis showed 76.4% agreement with mRNA expression for TF and 58.8% for asHTF. In patients with tongue and larynx tumors there correlation were not found. Thus, we suggest that the TF and asHTF expression seem to be prognostic markers in oral cavity SCC especially in relation to disease-free survival. Supported by FAPESP 06/53755-5

O tratamento radioterápico para pacientes com neoplasias de cabeça e pescoço pode trazer consequências secundárias graves como alterações da estrutura dental, com conseguinte prejuízo da função oral, a qual influencia negativamente a qualidade de vida. Recentemente trabalhos de pesquisa tem demonstrado que a radiação induz a expressão e ativação das metaloproteinases da matriz (MMPs), consideradas as principais enzimas responsáveis pela remodelação da matriz orgânica, incluindo os componentes e estruturas da junção amelodentinária (JAD). Questiona-se então se as alterações dentais observadas em pacientes pós-radioterapia poderiam ser causadas também pela ativação das MMPs que se encontram na JAD. O presente estudo apresentou três avaliações: a ativação e expressão das MMPs, a implementação de inibidores de proteases como método de inibição das MMPs e a ativação das MMPs devido a um desafio ácido. Para as medições foram utilizados 178 fragmentos dentais de molares, divididos aleatoriamente em 2 grupos (decíduos e permanentes) / 4 subgrupos experimentais (irradiados e não-irradiados). Os fragmentos foram expostos à radiacao com Co-60, com fracao de dose de 2 Gy, 5 dias consecutivos, ate atingirem a dose total de 60 Gy, com um total de 30 ciclos, durante 6 semanas. Com o objetivo de determinar a expressão e atividade das MMPs, foram realizados os ensaios de imunofluorescência e zimografia in situ, nos fragmentos dentais de 0,6mm, analisando os tecidos duros do esmalte, dentina e JAD. Para avaliar se produtos odontológicos inativam as MMPs, os dentes foram imersos em 0,5ml de digluconato de clorexidina a 0,12%, fluoreto de sódio a 0,05%, polifenol epigalocatequina 3-galato 400μM e água destilada (grupo controle), por 1 hora. Assim também com objetivo de avaliar se em um ambiente ácido, as MMPs apresentariam maior atividade, os dentes foram colocados em contato com 20μl de solucao desmineralizadora com pH de 4,8, por um minuto, e posteriormente lavados com 20μl de água deionizada, por um minuto. De maneira geral pudemos observar que a irradiação ativa as MMPs na JAD e estes efeitos foram mais evidentes nos dentes permanentes que nos decíduos. Com relação à expressão das diferentes MMPs, foi observada uma maior expressão das MMPs-9 e -20 para dentes decíduos, e para dentes permanentes as MMPs-2, -9 e -20 apresentaram expressão semelhante. Tendo em vista que a irradiação foi capaz de ativar as MMPs expressas na JAD de dentes permanentes, e em busca de soluções capazes de inibi-las, observamos que o Digluconato de Clorexidina, o Fluoreto de Sódio e o Polifenol Epigalocatequina 3-galato inibiram a atividade das MMPs na JAD em dentes permanentes. Por último ao investigar o efeito de um desafio ácido, na atividade das MMPs, observamos que a desmineralização não aumentou a atividade das MMPs em dentes não irradiados, porém aumentou a atividade das MMPs em dentes irradiados. Comparando dentes irradiados submetidos ou não à desmineralização, observou-se que a desmineralização incrementou a atividade das MMPs, já induzida pela irradiação. / Radiotherapy for patients with head and neck cancer can have serious secondary consequences such as changes in tooth structure, with consequent loss of oral function which negatively influences an individual\'s quality of life. Recently research work has shown that radiation induces the expression and activation of matrix metalloproteinases (MMPs) which are considered the major enzymes responsible for the remodeling of the organic matrix, including the components and structures of the dentinoenamel junction (DEJ). It is questionable if the dental changes observed in post-radiotherapy patients could also be caused by the activation of MMPs that are in the DEJ. The present study has three assessments: the activation and expression of MMPs, the implementation of protease inhibitors such as method of inactivating MMPs and the activation of MMPs due to an acid challenge. The measurements that were used were 178 molar dental fragments randomly divided into 2 groups (deciduous and permanent) / 4 experimental subgroups (irradiated and non-irradiated). The samples were exposed to radiation using Co-60 at a cumulative dose of 2 Gy fraction, 5 consecutive days, until they reached a total dose of 60 Gy, with a total of 30 cycles for 6 weeks. In order to determine the expression and activity of MMPs immunofluorescence assays were performed and in situ zymography, the dental fragments of 0.6mm, analyzing the DEJ in three areas of the tooth (cervical, cuspal and groove of pit). To assess whether MMPs inactivate dental products, the teeth were immersed in 0.5 ml of chlorhexidine digluconate at 0.12%, sodium fluoride 0.05%, polyphenol epigallocatechin-3 gallate 400μM and distilled water (control group) for 1 hour. To evaluate effects in an acidic environment, MMPs have higher activity, the teeth were put in contact with 20μl of demineralizing solution with pH 4.8, for a minute, and then washed with 20μl of deionized water, one minute. In general we observed that the radiation active MMPs in DEJ and these effects were more evident in the permanent teeth than in the primary teeth. Regarding the expression of different MMPs, showed the greatest expression of MMP-9 and -20 for deciduous teeth, and permanent teeth MMPs-2, -9 and -20 showed similar expression. Given that the irradiation was able to activate MMPs expressed in the DEJ permanent teeth, and looking for solutions that inactive them, we observed that the digluconate Chlorhexidine, the Sodium Fluoride and Polyphenol Epigallocatechin-3-gallate inhibited activity of MMPs in the DEJ in permanent teeth. Finally, to investigate the effect of an acid challenge, in the activity of MMPs, we observed that the demineralization did not increase the activity of MMPs in non-irradiated teeth but increased the activity of MMPs in irradiated teeth. Comparing irradiated whether subjected to demineralization teeth or not, it was found that demineralization increased activity of MMPs, induced by the radiation.

O objetivo deste trabalho foi avaliar as propriedades físicas e adesivas do esmalte dental após radioterapia e colagem de bráquetes ortodônticos metálicos e cerâmicos. O estudo foi dividido em duas etapas. Na primeira, foram utilizados 10 molares permanentes humanos hígidos, que foram seccionados em fragmentos de esmalte de 1 mm² e divididos entre grupo irradiado e não irradiado, de forma pareada. O grupo irradiado foi submetido à radiação ionizante, com uma dose total de 60 Gy, 2 Gy/dia, durante seis semanas, com intervalo de dois dias entre às semana. Os fragmentos de esmalte dental foram submetidos a teste mecânicos de microcisalhamento para verificar se a radioterapia alterou a resistência coesiva do esmalte dental irradiado. A segunda etapa deste estudo utilizou-se de 90 pré-molares humanos hígidos e devidamente preparados, divididos em seis grupos/subgrupos (n=15): G1 - dentes não irradiados e não envelhecidos; G2 - dentes não irradiados e envelhecidos; G3 - dentes irradiados e envelhecidos; Subgrupos: bráquetes metálicos (M) e bráquetes cerâmicos (C). Os grupos G2 e G3 foram submetidos à envelhecimento artificial acelerado por meio de termociclagem, simulando o período aproximado de 1 a 2 anos, tempo esse indicado para o início de tratamento ortodôntico em pacientes pós radioterapia. Em seguida, os grupos G2 e G3 foram submetidos à radioterapia, conforme descrito. Finalizado o ciclo radioterápico, os bráquetes foram colados no esmalte dental dos espécimes com compósito Transbond XT, sendo o bráquete metálico Morelli e cerâmico Radiance. Após 24 horas, os corpos de prova foram submetidos à teste mecânico de cisalhamento e a superfície do esmalte avaliada em microscopia confocal de varredura à laser (MCVL) avaliando o índice de remanescente adesivo (IRA) e modo de fratura. Em seguida, quatro corpos de prova que apresentaram fratura do tipo coesiva de cada grupo/subgrupos foram devidamente preparados e a interface compósito/esmalte avaliada em MCVL e microscopia eletrônica de varredura. Os fragmentos de esmalte dental submetidos à radiação apresentaram menores valores de resistência ao cisalhamento do que o esmalte dental não irradiado (p<0,05). Levando em consideração a interação dos fatores dos espécimes submetidos ao teste de cisalhamento, os grupo/subgrupos submetidos à radiação e colados bráquetes cerâmicos, apresentaram menores valores de resistência. Os grupos não submetidos à irradiação, G1-M e G2-M, apresentaram com maior frequência IRA escore 0 (sem compósito na superfície), enquanto, os grupos G1-C, G2-C, G3-M e G3-C apresentaram mais de 50% de compósito aderido à superfície Quanto ao modo de fratura, os grupos controle apresentaram em sua maioria os tipos de fratura adesiva (Ad) e coesiva resina (CR), independente do tipo de bráquete Os bráquetes metálicos colados em esmalte dental submetidos à irradiação apresentaram fratura do tipo mista coesiva resina/adesiva (CR/Ad), enquanto os bráquetes cerâmicos resultaram em fraturas coesiva resina (CR) e coesiva resina/adesiva (CR/Ad). Nas imagens obtidas da região de interface compósito/esmalte, observou-se que os tags de resina foram mais extensos no esmalte dental irradiado, circundando os prismas de esmalte. Assim, conclui-se que a radiação diminuiu a resistência coesiva do esmalte dental e que os espécimes submetidos à radioterapia apresentaram maior falha adesiva entre bráquete/compósito e tags de resina mais extensos e profundos quando comparados ao grupo controle / The objective of this study was to evaluate the physical and adhesive properties of the enamel after radiotherapy and bonding of metal and ceramic orthodontic brackets. The study was divided into two stages. In the first one, 10 human permanent molars, which were cut into fragments of enamel 1 mm² and divided between irradiated and non-irradiated group, in a paired form. The irradiated group was subjected to ionizing radiation, with a total dose of 60 Gy, 2 Gy / day for six weeks, with an interval of two days between the weeks. The enamel fragments were subjected to mechanical testing to verify that microshear radiotherapy changed cohesive strength of the irradiated enamel. In The second phase of this study, was used 90 healthy and properly prepared human premolars,divided into six groups / subgroups (n = 15): G1 - non-irradiated teeth and not aged; G2 teeth unirradiated and aged; G3 - irradiated and aged teeth; Subgroups: metallic brackets (M) and ceramic brackets (C). G2 and G3 were subjected to accelerated artificial aging by thermal cycling, simulating period of approximately 1 to 2 years, this time indicated for the beginning of orthodontic treatment in post radiotherapy patients. Then the G2 and G3 groups underwent radiotherapy as described. After the radiotherapy cycle, the brackets were bonded on the enamel specimens with Transbond XT, and the metallic and Morelli ceramic bracket Radiance. After 24 hours, the specimens were subjected to mechanical shear test and evaluated the enamel surface in confocal laser scanning microscopy (CLSM) evaluating the adhesive remnant index (ARI) and fracture mode. Then four specimens showed that the cohesive fracture type were properly prepared for each group / subgroup and the composite interface / enamel evaluated CLSM and scanning electron microscopy. Fragments enamel subjected to radiation had significantly lower shear strength than the non-irradiated enamel (p <0.05). Considering the interaction of the factors of the specimens subjected to shear stress, the group / subgroup undergoing radiation and bonded ceramic brackets showed lower resistance values. The two groups were subjected to irradiation, G1 and G2-M-M, showed more IRA frequency scores of 0 (no composite surface), while the C-G1, G2, C, G3 and G3-M-C groups had more 50% of adhesive left on the surface Concerning the fracture mode, the control groups showed mostly the types of adhesive fracture (Ad) and cohesive resin (CR), regardless of the bracket\'s metal brackets bonded submitted to enamel irradiation, that showed mixed type of cohesive resin / adhesive (CR / Ad) fracture, while ceramic brackets resulted in cohesive fractures resin (CR) and cohesive resin / adhesive (CR / Ad). In images obtained from the composite region / enamel interface, it was observed that the resin tags were more extensive in the irradiated tooth enamel surrounding the enamel prisms. Thus, it is concluded that radiation decreased the tensile strength of the enamel and the specimens treated with radiotherapy had higher adhesive failure between bracket / composite and tags of more extensive and deep resin, compared to the control group

O objetivo deste trabalho foi avaliar as propriedades físicas e adesivas do esmalte dental após radioterapia e colagem de bráquetes ortodônticos metálicos e cerâmicos. O estudo foi dividido em duas etapas. Na primeira, foram utilizados 10 molares permanentes humanos hígidos, que foram seccionados em fragmentos de esmalte de 1 mm² e divididos entre grupo irradiado e não irradiado, de forma pareada. O grupo irradiado foi submetido à radiação ionizante, com uma dose total de 60 Gy, 2 Gy/dia, durante seis semanas, com intervalo de dois dias entre às semana. Os fragmentos de esmalte dental foram submetidos a teste mecânicos de microcisalhamento para verificar se a radioterapia alterou a resistência coesiva do esmalte dental irradiado. A segunda etapa deste estudo utilizou-se de 90 pré-molares humanos hígidos e devidamente preparados, divididos em seis grupos/subgrupos (n=15): G1 - dentes não irradiados e não envelhecidos; G2 - dentes não irradiados e envelhecidos; G3 - dentes irradiados e envelhecidos; Subgrupos: bráquetes metálicos (M) e bráquetes cerâmicos (C). Os grupos G2 e G3 foram submetidos à envelhecimento artificial acelerado por meio de termociclagem, simulando o período aproximado de 1 a 2 anos, tempo esse indicado para o início de tratamento ortodôntico em pacientes pós radioterapia. Em seguida, os grupos G2 e G3 foram submetidos à radioterapia, conforme descrito. Finalizado o ciclo radioterápico, os bráquetes foram colados no esmalte dental dos espécimes com compósito Transbond XT, sendo o bráquete metálico Morelli e cerâmico Radiance. Após 24 horas, os corpos de prova foram submetidos à teste mecânico de cisalhamento e a superfície do esmalte avaliada em microscopia confocal de varredura à laser (MCVL) avaliando o índice de remanescente adesivo (IRA) e modo de fratura. Em seguida, quatro corpos de prova que apresentaram fratura do tipo coesiva de cada grupo/subgrupos foram devidamente preparados e a interface compósito/esmalte avaliada em MCVL e microscopia eletrônica de varredura. Os fragmentos de esmalte dental submetidos à radiação apresentaram menores valores de resistência ao cisalhamento do que o esmalte dental não irradiado (p<0,05). Levando em consideração a interação dos fatores dos espécimes submetidos ao teste de cisalhamento, os grupo/subgrupos submetidos à radiação e colados bráquetes cerâmicos, apresentaram menores valores de resistência. Os grupos não submetidos à irradiação, G1-M e G2-M, apresentaram com maior frequência IRA escore 0 (sem compósito na superfície), enquanto, os grupos G1-C, G2-C, G3-M e G3-C apresentaram mais de 50% de compósito aderido à superfície Quanto ao modo de fratura, os grupos controle apresentaram em sua maioria os tipos de fratura adesiva (Ad) e coesiva resina (CR), independente do tipo de bráquete Os bráquetes metálicos colados em esmalte dental submetidos à irradiação apresentaram fratura do tipo mista coesiva resina/adesiva (CR/Ad), enquanto os bráquetes cerâmicos resultaram em fraturas coesiva resina (CR) e coesiva resina/adesiva (CR/Ad). Nas imagens obtidas da região de interface compósito/esmalte, observou-se que os tags de resina foram mais extensos no esmalte dental irradiado, circundando os prismas de esmalte. Assim, conclui-se que a radiação diminuiu a resistência coesiva do esmalte dental e que os espécimes submetidos à radioterapia apresentaram maior falha adesiva entre bráquete/compósito e tags de resina mais extensos e profundos quando comparados ao grupo controle / The objective of this study was to evaluate the physical and adhesive properties of the enamel after radiotherapy and bonding of metal and ceramic orthodontic brackets. The study was divided into two stages. In the first one, 10 human permanent molars, which were cut into fragments of enamel 1 mm² and divided between irradiated and non-irradiated group, in a paired form. The irradiated group was subjected to ionizing radiation, with a total dose of 60 Gy, 2 Gy / day for six weeks, with an interval of two days between the weeks. The enamel fragments were subjected to mechanical testing to verify that microshear radiotherapy changed cohesive strength of the irradiated enamel. In The second phase of this study, was used 90 healthy and properly prepared human premolars,divided into six groups / subgroups (n = 15): G1 - non-irradiated teeth and not aged; G2 teeth unirradiated and aged; G3 - irradiated and aged teeth; Subgroups: metallic brackets (M) and ceramic brackets (C). G2 and G3 were subjected to accelerated artificial aging by thermal cycling, simulating period of approximately 1 to 2 years, this time indicated for the beginning of orthodontic treatment in post radiotherapy patients. Then the G2 and G3 groups underwent radiotherapy as described. After the radiotherapy cycle, the brackets were bonded on the enamel specimens with Transbond XT, and the metallic and Morelli ceramic bracket Radiance. After 24 hours, the specimens were subjected to mechanical shear test and evaluated the enamel surface in confocal laser scanning microscopy (CLSM) evaluating the adhesive remnant index (ARI) and fracture mode. Then four specimens showed that the cohesive fracture type were properly prepared for each group / subgroup and the composite interface / enamel evaluated CLSM and scanning electron microscopy. Fragments enamel subjected to radiation had significantly lower shear strength than the non-irradiated enamel (p <0.05). Considering the interaction of the factors of the specimens subjected to shear stress, the group / subgroup undergoing radiation and bonded ceramic brackets showed lower resistance values. The two groups were subjected to irradiation, G1 and G2-M-M, showed more IRA frequency scores of 0 (no composite surface), while the C-G1, G2, C, G3 and G3-M-C groups had more 50% of adhesive left on the surface Concerning the fracture mode, the control groups showed mostly the types of adhesive fracture (Ad) and cohesive resin (CR), regardless of the bracket\'s metal brackets bonded submitted to enamel irradiation, that showed mixed type of cohesive resin / adhesive (CR / Ad) fracture, while ceramic brackets resulted in cohesive fractures resin (CR) and cohesive resin / adhesive (CR / Ad). In images obtained from the composite region / enamel interface, it was observed that the resin tags were more extensive in the irradiated tooth enamel surrounding the enamel prisms. Thus, it is concluded that radiation decreased the tensile strength of the enamel and the specimens treated with radiotherapy had higher adhesive failure between bracket / composite and tags of more extensive and deep resin, compared to the control group

O tratamento radioterápico para pacientes com neoplasias de cabeça e pescoço pode trazer consequências secundárias graves como alterações da estrutura dental, com conseguinte prejuízo da função oral, a qual influencia negativamente a qualidade de vida. Recentemente trabalhos de pesquisa tem demonstrado que a radiação induz a expressão e ativação das metaloproteinases da matriz (MMPs), consideradas as principais enzimas responsáveis pela remodelação da matriz orgânica, incluindo os componentes e estruturas da junção amelodentinária (JAD). Questiona-se então se as alterações dentais observadas em pacientes pós-radioterapia poderiam ser causadas também pela ativação das MMPs que se encontram na JAD. O presente estudo apresentou três avaliações: a ativação e expressão das MMPs, a implementação de inibidores de proteases como método de inibição das MMPs e a ativação das MMPs devido a um desafio ácido. Para as medições foram utilizados 178 fragmentos dentais de molares, divididos aleatoriamente em 2 grupos (decíduos e permanentes) / 4 subgrupos experimentais (irradiados e não-irradiados). Os fragmentos foram expostos à radiacao com Co-60, com fracao de dose de 2 Gy, 5 dias consecutivos, ate atingirem a dose total de 60 Gy, com um total de 30 ciclos, durante 6 semanas. Com o objetivo de determinar a expressão e atividade das MMPs, foram realizados os ensaios de imunofluorescência e zimografia in situ, nos fragmentos dentais de 0,6mm, analisando os tecidos duros do esmalte, dentina e JAD. Para avaliar se produtos odontológicos inativam as MMPs, os dentes foram imersos em 0,5ml de digluconato de clorexidina a 0,12%, fluoreto de sódio a 0,05%, polifenol epigalocatequina 3-galato 400&mu;M e água destilada (grupo controle), por 1 hora. Assim também com objetivo de avaliar se em um ambiente ácido, as MMPs apresentariam maior atividade, os dentes foram colocados em contato com 20&mu;l de solucao desmineralizadora com pH de 4,8, por um minuto, e posteriormente lavados com 20&mu;l de água deionizada, por um minuto. De maneira geral pudemos observar que a irradiação ativa as MMPs na JAD e estes efeitos foram mais evidentes nos dentes permanentes que nos decíduos. Com relação à expressão das diferentes MMPs, foi observada uma maior expressão das MMPs-9 e -20 para dentes decíduos, e para dentes permanentes as MMPs-2, -9 e -20 apresentaram expressão semelhante. Tendo em vista que a irradiação foi capaz de ativar as MMPs expressas na JAD de dentes permanentes, e em busca de soluções capazes de inibi-las, observamos que o Digluconato de Clorexidina, o Fluoreto de Sódio e o Polifenol Epigalocatequina 3-galato inibiram a atividade das MMPs na JAD em dentes permanentes. Por último ao investigar o efeito de um desafio ácido, na atividade das MMPs, observamos que a desmineralização não aumentou a atividade das MMPs em dentes não irradiados, porém aumentou a atividade das MMPs em dentes irradiados. Comparando dentes irradiados submetidos ou não à desmineralização, observou-se que a desmineralização incrementou a atividade das MMPs, já induzida pela irradiação. / Radiotherapy for patients with head and neck cancer can have serious secondary consequences such as changes in tooth structure, with consequent loss of oral function which negatively influences an individual\'s quality of life. Recently research work has shown that radiation induces the expression and activation of matrix metalloproteinases (MMPs) which are considered the major enzymes responsible for the remodeling of the organic matrix, including the components and structures of the dentinoenamel junction (DEJ). It is questionable if the dental changes observed in post-radiotherapy patients could also be caused by the activation of MMPs that are in the DEJ. The present study has three assessments: the activation and expression of MMPs, the implementation of protease inhibitors such as method of inactivating MMPs and the activation of MMPs due to an acid challenge. The measurements that were used were 178 molar dental fragments randomly divided into 2 groups (deciduous and permanent) / 4 experimental subgroups (irradiated and non-irradiated). The samples were exposed to radiation using Co-60 at a cumulative dose of 2 Gy fraction, 5 consecutive days, until they reached a total dose of 60 Gy, with a total of 30 cycles for 6 weeks. In order to determine the expression and activity of MMPs immunofluorescence assays were performed and in situ zymography, the dental fragments of 0.6mm, analyzing the DEJ in three areas of the tooth (cervical, cuspal and groove of pit). To assess whether MMPs inactivate dental products, the teeth were immersed in 0.5 ml of chlorhexidine digluconate at 0.12%, sodium fluoride 0.05%, polyphenol epigallocatechin-3 gallate 400&mu;M and distilled water (control group) for 1 hour. To evaluate effects in an acidic environment, MMPs have higher activity, the teeth were put in contact with 20&mu;l of demineralizing solution with pH 4.8, for a minute, and then washed with 20&mu;l of deionized water, one minute. In general we observed that the radiation active MMPs in DEJ and these effects were more evident in the permanent teeth than in the primary teeth. Regarding the expression of different MMPs, showed the greatest expression of MMP-9 and -20 for deciduous teeth, and permanent teeth MMPs-2, -9 and -20 showed similar expression. Given that the irradiation was able to activate MMPs expressed in the DEJ permanent teeth, and looking for solutions that inactive them, we observed that the digluconate Chlorhexidine, the Sodium Fluoride and Polyphenol Epigallocatechin-3-gallate inhibited activity of MMPs in the DEJ in permanent teeth. Finally, to investigate the effect of an acid challenge, in the activity of MMPs, we observed that the demineralization did not increase the activity of MMPs in non-irradiated teeth but increased the activity of MMPs in irradiated teeth. Comparing irradiated whether subjected to demineralization teeth or not, it was found that demineralization increased activity of MMPs, induced by the radiation.

Proteína 2 ligante de SH3 ativadora da GTPase de Ras (G3BP2) parece estar envolvido em vias importantes de sobrevivência celular como a via do NF-B. Já o fator tecidual (TF) e sua isoforma asHTF parecem estar envolvidos nos processos de angiogênese, proliferação e metástase. Assim, os genes G3BP2, TF e asHTF parecem possíveis fatores prognósticos em carcinoma epidermóide (CE) de cabeça e pescoço. Para avaliar a importância desses genes nesse tipo de câncer, foi realizada a quantificação da expressão do RNAm desses marcadores por PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real em tumores primário e mucosas adjacente de 148 pacientes com CE de cavidade oral, língua e laringe e a proteína de TF e asHTF foi determinada por Western blotting em 17 pacientes com CE de cavidade oral. Os dados da expressão do RNAm foram correlacionados com variáveis clínico-patológicos e sobrevida dos pacientes. A expressão relativa do RNAm de G3BP2 foi menor nos tumores primários em relação à mucosa adjacente em todos os sítios analisados. TF e asHTF não apresentaram nenhuma correlação entre a expressão relativa no tumor primário e na mucosa adjacente para os três sítios analisados. Quando comparados aos tumores sem comprometimento linfonodal (pN0), tumores de cavidade oral e língua com comprometimento linfonodal (pN+) apresentaram maior expressão de TF (P=0,003; P=0,033, respectivamente) e de asHTF (P=0,004; P=0,018, respectivamente Teste não paramétrico de Mann-Whitney). Em seguida, construímos as curvas de sobrevida pelo método de Kaplan-Meier considerando como positivos os pacientes com expressão maior que a mediana para cada marcador. Para os CE de cavidade oral, pacientes com expressão positiva dos genes TF (P=0,034 Teste Log-rank) e asHTF (P=0,010) apresentaram pior sobrevida livre de doença na análise univariada. Quando realizado a análise multivariada tanto TF como asHTF mantiveram a significância estatística (P=0,002 para ambos os genes), sugerindo, assim, serem fatores prognósticos independent. A análise da proteína apontou 76,4% de concordância no padrão de expressão do RNAm de TF e 58,8% para a expressão do RNAm de asHTF. Não foi observada nenhuma correlação entre esses marcadores com outros dados clínico-patológicos e nem com a sobrevida dos pacientes para os tumores de língua e laringe. Assim, sugerimos que a expressão de TF e asHTF parecem ser marcadores prognósticos nos CE de cavidade oral principalmente em relação a sobrevida livre de doença. Apoio FAPESP 06/53755-5 / GTPase activating protein (SH3 domain) binding protein 2 (G3BP2) seems to be involved in pathways important for cell survival as NF- B pathway. Tissue factor (TF) and its isoform asHTF appear to be involved in angiogenesis, proliferation and metastasis. Thus, the genes G3BP2, TF and asHTF seem possible prognostic factors in head and neck squamous cell carcinoma (SCC). To assess the importance of these genes in this type of cancer, we performed mRNA expression analysis of these markers by real time PCR (polymerase chain reaction) in primary tumors and adjacent mucosa of 148 patients with oral cavity, tongue and larynx SCC. TF and asHTF protein was determined by Western blotting in 17 patients with oral cavity SCC. mRNA expression levels were correlated with clinical and pathological variables and survival of patients. G3BP2 mRNA expression was lower in primary tumors as compared to adjacent mucosa at all sites analyzed. No difference was found between TF and asHTF expression in primary tumors and adjacent mucosa in the whole group. TF and asHTF levels mRNA expression were higher in pN+ tumors as compared to pN0 in oral cavity (P=0.003, P = 0.004, respectively) and tongue (P= 0.033, P= 0.018, respectively - Mann-Whitney test) tumors. For Kaplan Meier survival analysis patients were categorized positive (expression > tumor median relative expression) and negative (expression tumor median relative expression). For oral cavity SCC, patients with positive expression of TF (P =0.034 - log-rank test) and asHTF (P =0.010) genes presented shorter disease-free survival in univariate analysis. In multivariate analysis both TF as asHTF retained statistical significance (P=0.002 for both genes), suggesting, therefore, are independent prognostic factors. Protein analysis showed 76.4% agreement with mRNA expression for TF and 58.8% for asHTF. In patients with tongue and larynx tumors there correlation were not found. Thus, we suggest that the TF and asHTF expression seem to be prognostic markers in oral cavity SCC especially in relation to disease-free survival. Supported by FAPESP 06/53755-5

Os transportadores da família ABC são proteínas transmembrânicas envolvidas com o tráfego de substâncias endógenas e exógenas do meio intracelular para o extracelular, sendo alvos de estudo na resistência celular a agentes quimioterápicos. O ABCC2 é um transportador transmembrânico que exporta ativamente fármacos aniônicos conjugados e facilita o transporte de agentes anticâncer. O ABCG2 é outro transportador transmembrânico que tem influência na farmacocinética e farmacodinâmica de certos xenobióticos e substratos endógenos; além disso, acredita-se que este gene contribui para a resistência a várias drogas. Por esses motivos identificamos por sequenciamento ou PCR-RFLP os polimorfismos dos genes ABCC2 (Val417Ile, Ser789Phe e Ala1450Thr) e ABCG2 (Val12Met, Gly126stop códon, Gly141Lys) em 90 pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HNSCC) e tentamos correlacionar a presença do polimorfismo com resposta a tratamento que incluiu cisplatina em todos os pacientes. Não encontramos nenhuma correlação entre a presença de polimorfismo para Val12Met, Gly141Lys e Val417Ile, determinados em 68 pacientes tratados exclusivamente com cisplatina e radioterapia, e a resposta ao tratamento. As curvas de sobrevida, determinadas por Kaplan-Meier, considerando polimórfico os pacientes que continham pelo menos um dos alelos alterados e selvagem os que não tivessem nenhum deles, mostraram que os pacientes selvagens para o polimorfismo Val12Met tiveram tendência a uma pior sobrevida (sobrevida mediana de 18,7 meses) em relação aos pacientes polimórficos (sobrevida mediana não atingida; P=0,089 Teste de log-rank), já os pacientes selvagens para o polimorfismo Gly141Lys tiveram tendência a uma pior sobrevida (sobrevida mediana de 15,8 meses) em relação aos pacientes polimórficos (sobrevida mediana de 25,6 meses; P = 0,16 Teste de logrank). Não observamos correlação entre os outros polimorfismos e sobrevida. Quanto ao GLY126stop, somente um paciente foi identificado como polimórfico. Conclusões: No nosso estudo, a freqüência do polimorfismo Val12Met de 10% está próxima dos 18% descrito na população normal (Kobayashi 2004). Nosso trabalho foi o primeiro a correlacionar estes polimorfismos com resposta ao tratamento em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço e indica que Val12Met e Gly141Lys e o gene ABCG2 como um todo são candidatos a um estudo maior / ATP binding cassette (ABC) transporters form one of the largest transmembrane protein families. These proteins use cellular ATP to drive the transport of various substrates across cell membranes including many exogenous and endogenous compounds, which includes drugs used in cancer treatment. ABCC2 is an ATP binding cassette transporter which accepts a diverse range of substrates, including glutathione, glucuronide, and sulfate conjugates of many metabolites and xenobiotics. ABCG2 is a member of the ATP binding cassette (ABC) transporters whose function is to pump out of the cell a wide variety of endogenous and exogenous compounds. Widely expressed in stem cells, ABCG2 is also recognized as a universal marker of stem cells. For these reasons we had identified the following polymorphisms of ABCC2 gene: -Val417Ile, Ser789Phe and Ala1450Thr- and of ABCG2 gene as well: -Val12Met, Gly126stop códon, Gly141Lys in 88 patients with head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Methodology included PCR - RFLP and direct sequencing. Survival analysis was done using Kaplan-Meier curves and response measured by RECIST criteria. Comparisons were done between polymorphic patients in which at least one polymorphism was present as opposed to the patients without the polymorphism. Correlation with response to treatment was studied for Val12Met, Gly141Lys e Val417Il in 68 patients exclusively treated with concomitant cisplatin and radiotherapy and no correlation was found between these markers and treatment response. Patients without the Val12Met presented a trend towards shorter survival (median survival 18.7 months) as compared to polymorphic patients (median survival not reached, long rank p= 0.089). Although statistical significance was not reached, patients wild type for Gly141Lys polymorphism (median survival 15.8 months) had shorter survival than polymorphic patients (25.6 months, p=0.16). We did not observe any other correlation between other polymorphisms and survival. With respect to Gly126stop, only one patient was identified as polymorphic and survival analysis was not possible. As far as we know this is the first study to try to correlate these polymorphisms with treatment response and survival in HNSCC patients. Although we were unable to draw any definitive conclusions, our results indicate that Val12Met and Gly141Lys deserve to be further studied in the future.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mariangelatorreglosaruiz_tese.pdf: 5118416 bytes, checksum: 568e4181937cd4c3e46fab3bfad62076 (MD5) Previous issue date: 2008-10-08 / Head and neck cancer is responsible for a high death rate. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the most common variation of human genome and can be associated to the molecular basis of cancer. Objectives: To establish the incidence of this disease in the Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery Service of Hospital de Base in São José do Rio Preto; to investigate the frequency of SNPs in the MTR, VEGF, KiSS-1, NINJ1, TAX1BP1 and LAD1 genes in head and neck cancer patients and a control population; to evaluate the association of these polymorphisms with smoking, alcoholism, gender and age and to verify the association between polymorphisms and clinicopathological features of the disease. Subjects and Methods: The epidemiological data of head and neck cancer patients consulted in the Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery Service in the period from 2000 to 2005 were analyzed. Eight hundred and five individuals (254 head and neck cancer patients and 551 controls) were included in the study for molecular investigation. The molecular analyses were performed with genomic DNA utilizing Real Time PCR (VEGF gene), PCR-SSCP (KiSS-1 gene), PCR RFLP (MTR, NINJ1 and TAX1BP1 genes) and automatic sequencing (LAD 1 gene) techniques. Results: An analysis of epidemiological data shows a prevalence of men (86%), smokers (83%) and alcoholics (77.95%). The most common primary tumor site was the oral cavity (35.37%). Statistical differences were found in the MTR A2756G polymorphism distribution (OR = 1.69; CI 95% 1.09-2.62; p = 0.019) by molecular analysis between patients and controls. On analyzing the primary tumor site, an increased frequency of KISS-1 polymorphic alleles was identified in laryngeal cancer (OR = 2.32; 95% CI 1.12 4.82; p = 0.02); an increased frequency of the NINJ1 polymorphism was found in oral cavity cancer (OR = 1.86; 95% CI 1.05-3.30; p = 0.03) and a decreased frequency in laryngeal cancer (OR = 0.40; 95% CI 0.22-0.74; p = 0.003); and an increase of the TAX1BP1 gene polymorphism was seen in oral cavity cancer (OR = 2.25; 95% CI 1.20-4.21; p = 0.01). A decreased frequency of the VEGF gene polymorphism was observed in advanced (T3 and T4) tumors (OR = 0.36; CI 95% 0.14-0.93; p = 0.0345) and a lower frequency of the LAD1 polymorphism in stage III and IV tumors (OR = 0.39 95% CI 0.18-0.83; p = 0.01). Conclusions: Head and neck cancer is more frequent in men, smokers and alcoholics with the most common primary tumor site being the oral cavity. MTR A2756G is associated with head and neck cancer. There is evidence of an association between this polymorphism and smoking, alcoholism, gender and age. There is also evidence of an association between the KiSS-1 gene polymorphism and laryngeal cancer, of NINJ1 and TAX1BP1 polymorphisms in oral cavity tumors, lower frequencies of the VEGF polymorphism in T3 and T4 tumors and the LAD1 polymorphism in stage III and IV tumors. / O câncer de cabeça e pescoço é responsável por uma alta incidência de óbitos. Os polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) constituem a variação mais comum do genoma humano e podem estar associados à base molecular do câncer. Objetivo: Estabelecer a incidência da doença no Serviço Ambulatorial de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital de Base de São José do Rio Preto; investigar a freqüência de SNPs nos genes MTR, VEGF, KiSS-1, NINJ1, TAX1BP1 e LAD1 em pacientes com câncer de cabeça e pescoço e em uma população controle; avaliar a associação dos polimorfismos com os hábitos tabagista e etilista, gênero e idade e verificar a associação entre os polimorfismos e os parâmetros clínicos da doença. Casuística e Método: Foram analisados os dados epidemiológicos de pacientes atendidos no Serviço Ambulatorial de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital de Base de São José do Rio Preto, no período de 2000 a 2005. Para a investigação molecular foram incluídos no estudo 805 indivíduos (254 pacientes com câncer de cabeça e pescoço e 551 controles). A análise molecular foi realizada com DNA genômico, e foram utilizadas as técnicas de PCR em Tempo Real (gene VEGF), PCR-SSCP (gene KiSS-1), PCR-RFLP (genes MTR, NINJ1 e TAX1BP1) e seqüenciamento automático (gene LAD1). Resultados: A análise dos dados epidemiológicos mostrou predominância de pacientes do sexo masculino (86%), hábitos tabagista (83%) e etilista (77,95%). O sítio anatômico primário mais freqüente foi a cavidade oral (35,37 %). Na análise molecular, foram encontradas diferenças estatísticas na distribuição do polimorfismo MTR A2756G (OR = 1,69; IC 95% 1,09-2,62; p = 0,019) entre pacientes e controles. Para o sítio anatômico primário do tumor, foi encontrada uma freqüência aumentada do alelo polimórfico na laringe (OR = 2,32; IC 95% 1,12 4,82; p = 0,02) para o gene KiSS-1; uma freqüência aumentada do polimorfismo para NINJ1 em cavidade oral (OR = 1,86; IC 95% 1,05 -3,30; p = 0,03) e reduzida na laringe (OR = 0,40 IC 95% 0,22-0,74; p =0,003) e um aumento da freqüência do polimorfismo para o gene TAX1BP1 na cavidade oral (OR =2,25; IC 95% 1,20-4,21; p =0,01). Foi observada uma menor freqüência do polimorfismo do gene VEGF em tumores com extensão T3 e T4 (OR = 0,36; IC 95% 0,14 0,93; p = 0,0345) e uma freqüência menor do polimorfismo do gene LAD1 em tumores com estádios III e IV (OR = 0,39 IC 95% 0,18-0,83; p = 0,01). Conclusões: O câncer de cabeça e pescoço é mais freqüente em homens, em indivíduos com hábitos tabagista e etilista e o sítio anatômico primário mais representativo é a cavidade oral. O genótipo MTR A2756G está associado ao câncer de cabeça e pescoço. Não há evidência de associação entre os polimorfismos e os hábitos tabagista, etilista, gênero e idade. Há evidências de associação entre o polimorfismo do gene KiSS-1 e laringe, entre os polimorfismos dos genes NINJ1 e TAX1BP1 e cavidade oral, e uma menor freqüência dos polimorfismos do genes VEGF em tumores com extensão T3 e T4 e LAD1 em tumores com estádios III e IV.