Neste trabalho foram estudados diversos métodos cromatográficos para a purificação de fatores recombinantes de coagulação VII (FVIIr) e VIII (FVIIIr) derivados de linhagens celulares humanas SK-Hep. O FVIIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia A, enquanto o FVIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia B e também a Hemofilia A. Produzir estes fatores em linhagens celulares humanas faz com os padrões de glicosilação, sulfatação e enovelamento destas proteínas sejam extremamente parecidos com os fatores endógenos produzidos no organismo humano. A purificação do FVIIIr através de técnicas de cromatografia multimodais usando a resina CaptoMMC, afinidade usando a resina FVIIISelect e troca iônica (SP-Sepharose) permitiu obter um produto bastante homogêneo e com perfil de banda (por SDS-PAGE) bem definido que demonstrou a presença esperada das cadeias leve e pesada (o Westen-Blott indicou que os anticorpos comerciais reconheceram a cadeia pesada da molécula estudada). As técnicas permitiram uma alta reprodutibilidade do processo onde sequencias de purificação indicaram o mesmo comportamento de perfis cromatográficos e o processo eliminou 99.5% ± 0,5% de proteínas inespecíficas, recuperando até 64% de FVIIIr. O FVIIr foi purificado com apenas uma única técnica cromatográfica usando a resina FVIISelect que isolou a proteína de interesse eliminando cerca de 99% de impurezas, recuperando praticamente todo o produto. O eluido da cromatografia de afinidade foi dialisado em membranas de 5 kDa o que resultou no processo de auto ativação da molécula de FVIIr, resultando em um aumento de sinal de até 5x em relação a quantidade inicial. O gel de SDS-PAGE e o Westen-Blott comprovaram o processo de auto-ativação no qual uma migração de banda de 50 kDa para 30kDa foi observada e os anticorpos comerciais contra FVII foram capazes de detecta-la. O método de purificação também foi bastante reproduzível e o perfil de banda muito semelhante se comparado ao produto comercial existente no mercado. Sendo assim, foi possível obter plataformas de purificação para as proteínas FVIIr e FVIIIr. / In this work, several chromatographic methods were studied for the purification of recombinant clotting factors VII (FVIIr) and VIII (FVIIIr) derived from human SK-Hep cell lines. The FVIIIr is used for the treatment of Hemophilia A, while the FVIIr is used for the treatment of Hemophilia B and Hemophilia A. Producing these factors in human cell lines results in glycosylation, sulphation and folding patterns similar to the endogenous factors produced in the human organism. Purification of FVIIIr by multimodal chromatography techniques using CaptoMMC resin, affinity using FVIIISelect resin and ion exchange (SP-Sepharose) yielded a fairly homogeneous and well-defined band profile (by SDS-PAGE) which demonstrated the expected presence of the light and heavy chains, Westen-Blott indicated that commercial antibodies recognized the heavy chain of the studied molecule. The techniques allowed a high reproducibility of the process where purification sequences indicated the same behavior of chromatographic profiles and the process eliminated 99.5% ± 0.5% nonspecific proteins and recovering up to 64% FVIIIr. FVIIr was purified with only a single chromatographic technique using the FVIISelect resin which isolated the protein by removing about 99% impurities and recovering virtually the entire product. The affinity chromatography eluate was dialyzed on 5 kDa membranes which resulted in the autoactivation process of the FVIIr molecule resulting in a signal increase of up to 5 fold over the initial amount. The SDS-PAGE gel and Westen-Blott demonstrated the auto-activation process where a migration of 50 kDa to 30 kDa band was observed and the commercial antibodies against FVII were able to detect the band. The purification method was also quite reproducible and the band profile very similar compared to the commercial products. Thus, it was possible to obtain purification platforms for the FVIIr and FVIIIr proteins.

As hemartroses, a despeito dos avanços terapêuticos ocorridos na hemofilia, continuam sendo os eventos clínicos mais freqüentes. As hemartroses de repetição, sobretudo nos tornozelos, podem estar associadas à instabilidade articular. Sabe-se que a instabilidade articular pode contribuir para aumentar a frequência dessas complicações e prescrevem-se órteses que limitam muito os pacientes. Diante desse quadro buscamos um instrumento para qualificar os desvios nos tornozelos instáveis durante a marcha, dinamicamente e em tempo real. Essa avaliação permitiu a prescrição de palmilhas de fácil confecção, de calçados com contrafortes posteriores e, nos casos muito instáveis, a associação de órteses funcionais, dinâmicas, para tornozelos. A intervenção realizada nos pacientes constou do exame pela podobarometria dinâmica computadorizada, antes e depois da prescrição das órteses. O uso das órteses prescritas conforme as observações podobarométricas permitiu liberdade na marcha, assegurando estabilidade articular. O número de hemartroses nos tornozelos e o consumo de fatores da coagulação em cada hemorragia, nos 43 hemofílicos avaliados, foi verificado nos prontuários médicos dos pacientes, em suas instituições de origem, nos seis meses pré-intervenção e nos seis meses pós-intervenção. Nos 43 hemofílicos avaliados, a média de ocorrência de hemartroses, que era de 4,81, foi reduzida para 2,53 hemartroses por paciente, após a intervenção. A média do consumo de fatores da coagulação reduziu de 9647,7 IU para 4407,0 IU, com p<0,001 . Com base na análise dos resultados concluímos que a podobarometria dinâmica computadorizada é um meio diagnóstico útil na prescrição de estabilizadores para os tornozelos dos hemofílicos, contribuindo significantemente para a redução da incidência de hemartroses. / The haemarthrosis, despite the improvement of therapeutic resources occurred in haemophilia, have been the most frequent haemophiliac\'s clinical event. The repetitive haemarthrosis, speccialy those occurred in ankle joints, could be associated to ankle instabilities. It is known that the joint instability can contribute to increase the frequency of those complications and are prescribed orthosis which severely limit the patients. Face to these facts, we have searched for an instrument able to qualify the deviations in the unstable ankles during the gait, dynamically and in real time. Such evaluation would allow the prescription of insoles, of shoes with posterior counters and, in very unstable cases, the association of dynamic supports. The intervention performed in the patients was constituted of the computerised dynamic pedobarography examination, before and after the prescription of the orthosis. The use of the prescribed orthosis according to the pedobarographic observations allowed joint stability with gait liberty. The number of haemarthrosis in the ankles and the consumption of coagulation factors in each bleeding of the 43 haemophilic evaluated was verified in the patients\' medical records, in their original institutions, in the six months that preceded evaluation and therapeutic intervention in haemophilic patients and during the six months after it. In the 43 evaluated haemophilic patients, the average occurrence of haemarthrosis went from 4,81 episodes before intervention to 2,53 episodes after the intervention. The average coagulation factors consumption went from 9.647,7 IU to 4.407,0 IU. The p value is smaller than 0,001. Based on the analysis of the results, we are able to conclude that the computerised dynamic pedobarography is a useful diagnosis method with a significant contribution to the reduction of incidence of ankle haemarthrosis.

As hemartroses, a despeito dos avanços terapêuticos ocorridos na hemofilia, continuam sendo os eventos clínicos mais freqüentes. As hemartroses de repetição, sobretudo nos tornozelos, podem estar associadas à instabilidade articular. Sabe-se que a instabilidade articular pode contribuir para aumentar a frequência dessas complicações e prescrevem-se órteses que limitam muito os pacientes. Diante desse quadro buscamos um instrumento para qualificar os desvios nos tornozelos instáveis durante a marcha, dinamicamente e em tempo real. Essa avaliação permitiu a prescrição de palmilhas de fácil confecção, de calçados com contrafortes posteriores e, nos casos muito instáveis, a associação de órteses funcionais, dinâmicas, para tornozelos. A intervenção realizada nos pacientes constou do exame pela podobarometria dinâmica computadorizada, antes e depois da prescrição das órteses. O uso das órteses prescritas conforme as observações podobarométricas permitiu liberdade na marcha, assegurando estabilidade articular. O número de hemartroses nos tornozelos e o consumo de fatores da coagulação em cada hemorragia, nos 43 hemofílicos avaliados, foi verificado nos prontuários médicos dos pacientes, em suas instituições de origem, nos seis meses pré-intervenção e nos seis meses pós-intervenção. Nos 43 hemofílicos avaliados, a média de ocorrência de hemartroses, que era de 4,81, foi reduzida para 2,53 hemartroses por paciente, após a intervenção. A média do consumo de fatores da coagulação reduziu de 9647,7 IU para 4407,0 IU, com p<0,001 . Com base na análise dos resultados concluímos que a podobarometria dinâmica computadorizada é um meio diagnóstico útil na prescrição de estabilizadores para os tornozelos dos hemofílicos, contribuindo significantemente para a redução da incidência de hemartroses. / The haemarthrosis, despite the improvement of therapeutic resources occurred in haemophilia, have been the most frequent haemophiliac\'s clinical event. The repetitive haemarthrosis, speccialy those occurred in ankle joints, could be associated to ankle instabilities. It is known that the joint instability can contribute to increase the frequency of those complications and are prescribed orthosis which severely limit the patients. Face to these facts, we have searched for an instrument able to qualify the deviations in the unstable ankles during the gait, dynamically and in real time. Such evaluation would allow the prescription of insoles, of shoes with posterior counters and, in very unstable cases, the association of dynamic supports. The intervention performed in the patients was constituted of the computerised dynamic pedobarography examination, before and after the prescription of the orthosis. The use of the prescribed orthosis according to the pedobarographic observations allowed joint stability with gait liberty. The number of haemarthrosis in the ankles and the consumption of coagulation factors in each bleeding of the 43 haemophilic evaluated was verified in the patients\' medical records, in their original institutions, in the six months that preceded evaluation and therapeutic intervention in haemophilic patients and during the six months after it. In the 43 evaluated haemophilic patients, the average occurrence of haemarthrosis went from 4,81 episodes before intervention to 2,53 episodes after the intervention. The average coagulation factors consumption went from 9.647,7 IU to 4.407,0 IU. The p value is smaller than 0,001. Based on the analysis of the results, we are able to conclude that the computerised dynamic pedobarography is a useful diagnosis method with a significant contribution to the reduction of incidence of ankle haemarthrosis.

Linhagens celulares humanas tem despertado interesse como plataformas de produção de proteínas terapêuticas recombinantes por sua capacidade de realizar modificações pós-traducionais complexas e de modo similar à humana, sem gerar epítopos imunogênicos como ocorre com proteínas produzidas em células de mamíferos. Para a produção de uma proteína com correta qualidade terapêutica, as agências regulatórias recomendam processos livres de componentes animais de modo a evitar contaminação com vírus e príons. Deste modo, esse trabalho visa a produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante (FVIIr) utilizada no tratamento de hemofílicos com inibidores em células humanas adaptadas para meios de cultura livres de soro fetal bovino. As linhagens humanas SK-Hep-1, HKB-11 e Huh-7 foram adaptadas para suspensão e meios livres de soro fetal bovino (SFB). Essas células adaptadas foram transfectadas de forma transiente com o vetor lentiviral p1054-GFP e o reagente polietilenimina. No entanto, a baixa eficiência de transfecção nas células SK-Hep-1 e Huh-7 mostraram que essas linhagens são difíceis de transfectar por esse método, e mesmo a transfecção da célula HKB-11 só foi possível após a variação de alguns parâmetros, resultando em uma transfecção de 49,5% de células HKB-11 GFP-positivas. Desta forma, a expressão estável foi avaliada e as células adaptadas foram transduzidas com um ciclo de lentivírus (MOI = 1) contendo o vetor p1054-FVII. Foram observadas porcentagens de células GFP-positivas acima de 35% nas três linhagens celulares humanas modificadas. As células transduzidas foram submetidas a dois processos de sorting por citometria de fluxo, no qual a população obtida apresentava mais de 90% de células GFP-positivas. As três células foram avaliadas com relação à expressão de FVIIr após a adição de vitamina K no cultivo, no entanto, não foi possível detectar níveis de FVIIr no sobrenadante de 48 horas do cultivo dessas células pelo teste ELISA. As células foram transduzidas com um segundo ciclo de lentivírus (MOI = 2). A quantificação por ELISA do sobrenadante de 48 horas de cultivo das três células detectou 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL e 78,46 ng/mL de FVII total, respectivamente, nos cultivos das células HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C e Huh-7-F7-2C. A expressão relativa de RNA mensageiro por RT-PCR também foi observada nos três cultivos. Paralelamente, foi analisado o proteoma das três células adaptadas e não-adaptadas em triplicata sendo identificadas de forma abundante proteínas do citoesqueleto, do metabolismo celular, da síntese, enovelamento e degradação de proteínas, relacionadas à apoptose, ao ciclo celular e ao crescimento, proteínas contra estresse oxidativo e osmótico, com ação antioxidante, entre outras. / Human cell lines have attracted great interest as a plarform for recombinant therapeutic proteins production, due their ability to perform complex posttranslational modification in a similar manner to human proteins. These proteins do not carry immunogenic epitopes as occurs with proteins produced in mammalian cells. These therapeutic proteins should be produced in a animal-free process avoiding virus and prion contamination, as recommended by regulatory agencies for quality control. Thus, this work aims the production of recombinant blood coagulation factor VII (rFVII) used in the treatment of hemophiliacs with inhibitors in human cell lines adapted to serum-free suspension cultures. Human cell lines SK-Hep-1, HKB-11 and Huh-7 were adapted to suspension and serum-free media. These adapted cells were transiently transfected with p1054-GFP lentiviral vector and the polyethyleneimine reagent. However, low transfection efficiency in SK-Hep-1 and Huh-7 cells showed that these cells are difficult to transfect by this method, and even transfection of HKB-11 cell was only possible after varying some parameters, resulting in a 49,5% HKB-11 GFP-positive cells. Stable transfection was assessed and adapted cells were transduced with lentivirus particles containing p1054-FVII vector in one cycle (MOI=1). Percentages of GFP-positive cells above 35% were observed in three modified human cell lines. Transduced cells were sorted by FACS and more than 90% of GFP-positive cells were obtained. The expression of rFVII were evaluated by ELISA test after vitamin K supplementation, however, it was not possible to detect FVII levels in the 48 hour culture supernatant. Cells were transduced again with a second lentivirus cycle (MOI = 2). ELISA quantification of the 48 hour culture supernatant detected 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL and 78,46 ng/mL total FVII, respectively, in the cultures of HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C and Huh-7-F7-2C cells. Relative expression of mRNA by RT-PCR was also observed in the three cultures assessed. In parallel, a proteomic analysis of adapted and non-adapted cells was performed in triplicate. Proteins related to cellular metabolism, cytoskeletal structure, apoptosis, cell cycle and cell growth, against oxidative and osmotic stress, antioxidant action were found.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.