Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós Graduação em Patologia Molecular, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-28T13:58:54Z No. of bitstreams: 1 2010_IzabelCristinaRodriguesSilva.pdf: 2079351 bytes, checksum: 6440cd8bd00b2f9ab6e391d2898211ba (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2011-05-25T11:52:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_IzabelCristinaRodriguesSilva.pdf: 2079351 bytes, checksum: 6440cd8bd00b2f9ab6e391d2898211ba (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-25T11:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_IzabelCristinaRodriguesSilva.pdf: 2079351 bytes, checksum: 6440cd8bd00b2f9ab6e391d2898211ba (MD5) / O Z-DNA é uma estrutura energeticamente desfavorável do DNA que pode ser formada sob certas condições fisiológicas e é conhecida por estar envolvida em uma série de atividades biológicas como a regulação da transcrição. O presente estudo teve como objetivo identificar regiões genômicas em conformação de Z-DNA no genoma humano. Para a pesquisa destas regiões na conformação Z no núcleo da célula, um vetor que contêm informação genética para a expressão de um fragmento de anticorpo que reconhece Z-DNA (pMACIA scFvZ22NLS) foi transfectado em linhagens celulares humanas MCF-7 e A549, anteriormente a imunoprecipitação de cromatina com uso de agente fixador (XChIP) e clonagem. Outra estratégia substituiu a transfecção por um anticorpo monoclonal anti-Z-DNA, em uma estratégia ChIP sem o uso de fixadores (NChIP). Poucas sequências foram recuperadas destes experimentos e foram analisadas conforme seu conteúdo. Análise de dados por ferramentas de bioinformática mostraram três regiões no cromossomo 1 e uma no cromossomo 12 que contêm sequências potenciais formadoras de Z-DNA e foram confirmadas pelos programas Z-Catcher e Z-Hunt. Dentre elas, uma no cromossomo 1 contêm região repetitivas identificadas pelo programa Repeat Masker do tipo SINE/Alu , e tem similaridade com o segundo intron do gene TMCC2 (transmembrane and coiled-coil domain family 2), que codifica a proteína cerebral n.11. A quantificação, por meio da PCR quantitativa em tempo Real, dos fragmentos recuperados pela estratégia de ChIP, revelou que independente do tipo celular, na mesma região, a recuperação foi estatisticamente igual, porém a estratégia ChIP livre de formaldeído recuperou uma maior quantidade de cada sequência formadora de Z. Estes dados sugerem a presença de sequências potenciais formadoras de Z-DNA que podem ser investigadas como potenciais elementos regulatórios. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Left handed Z-DNA is an energetically unfavorable DNA structure that could be formed under certain physiological conditions and is involved in a number of cellular actives, such as transcription regulation. The present study focuses on identifying the distributions of Z-DNA regions in the human genome. To search for Z-DNA regions in the cell nucleus, a vector that codes for an antibody fragment that recognize Z-DNA (pMACIA scFvZ22NLS) was transfected into human cancers MCF7 and A549 cell lines, prior to a chromatin immunoprecipitation with fixeR agent (XChIP) and cloning approach. Another strategy used a monoclonal antibody against Z-DNA in a ChIP without fixer agents (NChIP). Few sequences were recovered from these experiments and they were analyzed for their nucleotide sequences. Bioinformatics analysis pointed three regions at chromosome 1 and one at chromosome 12 that presented potential Z- regions and these results were corroborated by the Z-Hunt and Z-Catcher softwares. Among them, one located at human chromosome 1, identified by the Repeat Masker software for harboring SINE/Alu repetitive elements, has similarity with the second intronic region of the TMCC2 (transmembrane and coiled-coil domain family 2) gene, which encondes for the cerebral protein n. 11. The quantification, through Real time quantitative PCR, of the fragments recovered by ChIP strategy, revealed that independently of cell type the Z-DNA conformation was present in the same region of the genome. The recovery of these segments was statistically similar in both strategies used; nevertheless the one free from formaldehyde ChIP recovered quantitatively most sequences. These data suggest the presence of physiologically relevant Z-DNA forming sequences in the human genome which may potentially play a role as regulatory elements. Hence, further investigations to determine its function are required.

A epigenética aborda o controle da expressão gênica através de diversos fatores que agem sob a cromatina, os melhor estudados são a metilação do DNA e a acetilação em histonas, relacionadas à repressão e ativação gênica, respectivamente. Em mamíferos, existem dois fenômenos epigenéticos interessantes: a inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas, que garante o equilíbrio transcricional gênico entre os sexos, e o imprinting genômico, caracterizado pela expressão monoalélica dependente da origem parental. No presente estudo, propusemos verificar a manutenção do controle epigenético em células humanas normais e transformadas em condições semelhantes de hipometilação do DNA e hiperacetilação em histonas (após uso das drogas 5-aza-2-\'deoxicitidina (5-aza-dC) e ácido valproico, respectivamente), através do monitoramento da expressão alelo-específica pelo uso de polimorfismos de única base presentes em regiões codificadoras. Em células normais houve manutenção da ICX e do imprinting genômico, enquanto que em células transformadas hipometiladas foram observadas indução de XIST, e perda de imprinting dos genes IGF2, H19 e PEG10. Observamos que ambas as drogas podem diminuir a expressão de DNMT1, e 5-aza-dC altera o equilíbrio entre acetilação e desacetilação da histona H4. Ainda, a ordem de adição dos reagentes ocasionou diferenças no nível de acetilação da histona H4 e na expressão gênica de XIST e PEG10. Nossos dados sugerem que: células humanas normais apresentam maior estabilidade do controle epigenético comparadas às células humanas transformadas, genes submetidos à ICX e \"imprintados\" não apresentam diferenças na rigidez do controle de expressão, e a cascata de reação seguida após perturbação de marcas epigenéticas pode ser alterada dependendo da modificação inicial. / Epigenetics refers to mechanisms related to gene activity through conformational modifications in DNA without changes in the nucleotide sequence. Key players in the epigenetic control are DNA methylation and histone acetylation, which are related to gene activation and repression, respectively. Two striking epigenetic phenomena in mammalians are X chromosome inactivation (XCI) and genomic imprinting. XCI triggers the transcriptional silencing of all but one X chromosome in each female cell, while genomic imprinting is a process that leads to mono-allelic gene expression based on parental origin. In the present study, we intended to verify the maintenance of epigenetic control in normal and transformed human cells under the same conditions of epigenetic disturbance. For this purpose, 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-aza-dC) and valproic acid (VPA) were used to cause DNA hypomethylation and histone hyperacetylation, respectively. By monitoring allelic-specific expression using single nucleotide polymorphisms present in coding regions, we were able to check the effects of the modifications in the expression pattern of imprinted or subjected to XCI genes. While in female normal cells XCI and genomic imprinting were not affected by VPA or 5-aza-dC treatments, transformed male cells showed XIST activation and loss of imprinting of PEG10, IGF2 and H19 genes in the hypomethylation scenario. In addition, both drugs can decrease the expression of DNMT1, and 5-aza-dC alters the balance between acetylation and deacethylation of histone H4. Furthermore, we could see different degrees of histone H4 acetylation levels and of XIST and PEG10 expression, depending on which of the drugs was added first. Our data suggest that the epigenetic control in normal human cells is more stable when compared to transformed human cells. In addition, both XCI and genomic imprinting are epigenetic features equally hard to disturb. Finally, depending on the initial epigenetic modification (global demethylation or acethylation), it will induce different epigenetic control networks, with consequence to the final status of gene expression.

Objetivo general Ampliar el conocimiento de la cascada de señalización de TGF-β en células humanas mediante el estudio de TβRII y sus variantes de splicing, que permita contribuir al conocimiento básico de dicha cascada así como al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y de diagnóstico de enfermedades en las cuales la señalización de TGF-β se encuentra desregulada. Objetivos específicos - Caracterizar una nueva variante de splicing de TβRII en células humanas. - Evaluar los niveles de ARNm de las distintas variantes de splicing de TβRII en células humanas tumorales y no tumorales, que permita detectar patrones diferenciales entre ellas o patrones específicos de tipo celular. - Evaluar si los niveles de los ARNm de las variantes de splicing de TβRII en distintas poblaciones leucocitarias de pacientes con AR pueden ser utilizados como biomarcadores de diagnóstico y/o de determinación de la actividad y/o de pronóstico de la enfermedad.

A epigenética aborda o controle da expressão gênica através de diversos fatores que agem sob a cromatina, os melhor estudados são a metilação do DNA e a acetilação em histonas, relacionadas à repressão e ativação gênica, respectivamente. Em mamíferos, existem dois fenômenos epigenéticos interessantes: a inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas, que garante o equilíbrio transcricional gênico entre os sexos, e o imprinting genômico, caracterizado pela expressão monoalélica dependente da origem parental. No presente estudo, propusemos verificar a manutenção do controle epigenético em células humanas normais e transformadas em condições semelhantes de hipometilação do DNA e hiperacetilação em histonas (após uso das drogas 5-aza-2-\'deoxicitidina (5-aza-dC) e ácido valproico, respectivamente), através do monitoramento da expressão alelo-específica pelo uso de polimorfismos de única base presentes em regiões codificadoras. Em células normais houve manutenção da ICX e do imprinting genômico, enquanto que em células transformadas hipometiladas foram observadas indução de XIST, e perda de imprinting dos genes IGF2, H19 e PEG10. Observamos que ambas as drogas podem diminuir a expressão de DNMT1, e 5-aza-dC altera o equilíbrio entre acetilação e desacetilação da histona H4. Ainda, a ordem de adição dos reagentes ocasionou diferenças no nível de acetilação da histona H4 e na expressão gênica de XIST e PEG10. Nossos dados sugerem que: células humanas normais apresentam maior estabilidade do controle epigenético comparadas às células humanas transformadas, genes submetidos à ICX e \"imprintados\" não apresentam diferenças na rigidez do controle de expressão, e a cascata de reação seguida após perturbação de marcas epigenéticas pode ser alterada dependendo da modificação inicial. / Epigenetics refers to mechanisms related to gene activity through conformational modifications in DNA without changes in the nucleotide sequence. Key players in the epigenetic control are DNA methylation and histone acetylation, which are related to gene activation and repression, respectively. Two striking epigenetic phenomena in mammalians are X chromosome inactivation (XCI) and genomic imprinting. XCI triggers the transcriptional silencing of all but one X chromosome in each female cell, while genomic imprinting is a process that leads to mono-allelic gene expression based on parental origin. In the present study, we intended to verify the maintenance of epigenetic control in normal and transformed human cells under the same conditions of epigenetic disturbance. For this purpose, 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-aza-dC) and valproic acid (VPA) were used to cause DNA hypomethylation and histone hyperacetylation, respectively. By monitoring allelic-specific expression using single nucleotide polymorphisms present in coding regions, we were able to check the effects of the modifications in the expression pattern of imprinted or subjected to XCI genes. While in female normal cells XCI and genomic imprinting were not affected by VPA or 5-aza-dC treatments, transformed male cells showed XIST activation and loss of imprinting of PEG10, IGF2 and H19 genes in the hypomethylation scenario. In addition, both drugs can decrease the expression of DNMT1, and 5-aza-dC alters the balance between acetylation and deacethylation of histone H4. Furthermore, we could see different degrees of histone H4 acetylation levels and of XIST and PEG10 expression, depending on which of the drugs was added first. Our data suggest that the epigenetic control in normal human cells is more stable when compared to transformed human cells. In addition, both XCI and genomic imprinting are epigenetic features equally hard to disturb. Finally, depending on the initial epigenetic modification (global demethylation or acethylation), it will induce different epigenetic control networks, with consequence to the final status of gene expression.

Este trabalho desenvolve uma metodologia para a automação da análise morfológica de imagens de cromossomos humanos irradiados no reator nuclear IEA-R1 (localizado no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, IPEN, em São Paulo, Brasil) e, portanto, sujeitos a aberrações morfológicas. Esta metodologia se propõe a auxiliar na identificação, caracterização e classificação de cromossomos pelo profissional citogeneticista. O desenvolvimento da metodologia inclui a elaboração de um aplicativo baseado em técnicas de inteligência artificial utilizando Lógica Fuzzy e técnicas de processamento de imagens. O aplicativo desenvolvido foi denominado de CHRIMAN e é composto de módulos que contêm etapas metodológicas que suprem aspectos importantes para a obtenção de uma análise automatizada. A primeira etapa é a padronização dos procedimentos de aquisição das imagens digitais bidimensionais de metáfases através do acoplamento de uma câmera fotográfica digital comercial comum à ocular do microscópio utilizado na análise metafásica convencional. A segunda etapa é relativa ao tratamento das imagens obtidas através da aplicação de filtros digitais, armazenamento e organização das informações tanto do conteúdo da imagem em si, como das características extraídas e selecionadas, para posterior utilização nos algoritmos de reconhecimento de padrões. A terceira etapa consiste na utilização do banco de imagens digitalizadas e informações extraídas e armazenadas para a identificação dos cromossomos, sua caracterização, contagem e posterior classificação. O acerto no reconhecimento das imagens cromossômicas é de 93,9%. Esta classificação é baseada nos padrões encontrados classicamente em Buckton [1973], e possibilita o auxílio ao geneticista no procedimento de análise dos cromossomos com diminuição do tempo de análise e criando condições para a inclusão deste método num sistema mais amplo de avaliação de danos causados às células pela exposição à radiação ionizante. / This work has implemented a methodology for automation of images analysis of chromosomes of human cells irradiated at IEA-R1 nuclear reactor (located at IPEN, São Paulo, Brazil), and therefore subject to morphological aberrations. This methodology intends to be a tool for helping cytogeneticists on identification, characterization and classification of chromosomal metaphasic analysis. The methodology development has included the creation of a software application based on artificial intelligence techniques using Fuzzy Logic combined with image processing techniques. The developed application was named CHRIMAN and is composed of modules that contain the methodological steps which are important requirements in order to achieve an automated analysis. The first step is the standardization of the bi-dimensional digital image acquisition procedure through coupling a simple digital camera to the ocular of the conventional metaphasic analysis microscope. Second step is related to the image treatment achieved through digital filters application; storing and organization of information obtained both from image content itself, and from selected extracted features, for further use on pattern recognition algorithms. The third step consists on characterizing, counting and classification of stored digital images and extracted features information. The accuracy in the recognition of chromosome images is 93.9%. This classification is based on classical standards obtained at Buckton [1973], and enables support to geneticist on chromosomic analysis procedure, decreasing analysis time, and creating conditions to include this method on a broader evaluation system on human cell damage due to ionizing radiation exposure.

Este trabalho desenvolve uma metodologia para a automação da análise morfológica de imagens de cromossomos humanos irradiados no reator nuclear IEA-R1 (localizado no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, IPEN, em São Paulo, Brasil) e, portanto, sujeitos a aberrações morfológicas. Esta metodologia se propõe a auxiliar na identificação, caracterização e classificação de cromossomos pelo profissional citogeneticista. O desenvolvimento da metodologia inclui a elaboração de um aplicativo baseado em técnicas de inteligência artificial utilizando Lógica Fuzzy e técnicas de processamento de imagens. O aplicativo desenvolvido foi denominado de CHRIMAN e é composto de módulos que contêm etapas metodológicas que suprem aspectos importantes para a obtenção de uma análise automatizada. A primeira etapa é a padronização dos procedimentos de aquisição das imagens digitais bidimensionais de metáfases através do acoplamento de uma câmera fotográfica digital comercial comum à ocular do microscópio utilizado na análise metafásica convencional. A segunda etapa é relativa ao tratamento das imagens obtidas através da aplicação de filtros digitais, armazenamento e organização das informações tanto do conteúdo da imagem em si, como das características extraídas e selecionadas, para posterior utilização nos algoritmos de reconhecimento de padrões. A terceira etapa consiste na utilização do banco de imagens digitalizadas e informações extraídas e armazenadas para a identificação dos cromossomos, sua caracterização, contagem e posterior classificação. O acerto no reconhecimento das imagens cromossômicas é de 93,9%. Esta classificação é baseada nos padrões encontrados classicamente em Buckton [1973], e possibilita o auxílio ao geneticista no procedimento de análise dos cromossomos com diminuição do tempo de análise e criando condições para a inclusão deste método num sistema mais amplo de avaliação de danos causados às células pela exposição à radiação ionizante. / This work has implemented a methodology for automation of images analysis of chromosomes of human cells irradiated at IEA-R1 nuclear reactor (located at IPEN, São Paulo, Brazil), and therefore subject to morphological aberrations. This methodology intends to be a tool for helping cytogeneticists on identification, characterization and classification of chromosomal metaphasic analysis. The methodology development has included the creation of a software application based on artificial intelligence techniques using Fuzzy Logic combined with image processing techniques. The developed application was named CHRIMAN and is composed of modules that contain the methodological steps which are important requirements in order to achieve an automated analysis. The first step is the standardization of the bi-dimensional digital image acquisition procedure through coupling a simple digital camera to the ocular of the conventional metaphasic analysis microscope. Second step is related to the image treatment achieved through digital filters application; storing and organization of information obtained both from image content itself, and from selected extracted features, for further use on pattern recognition algorithms. The third step consists on characterizing, counting and classification of stored digital images and extracted features information. The accuracy in the recognition of chromosome images is 93.9%. This classification is based on classical standards obtained at Buckton [1973], and enables support to geneticist on chromosomic analysis procedure, decreasing analysis time, and creating conditions to include this method on a broader evaluation system on human cell damage due to ionizing radiation exposure.

ALENCAR, Luciana Magalhães Rebêlo. Estudo da viscoelasticidade de células de câncer renal por microscopia de força atômica. 2010. 155 f. Tese (Doutorado em Física) - Programa de Pós-Graduação em Física, Departamento de Física, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. / Submitted by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2015-05-22T18:40:21Z No. of bitstreams: 1 2010_tese_lmralencar.pdf: 15264548 bytes, checksum: e3df53eb49036e78f623d089ab7e0995 (MD5) / Approved for entry into archive by Edvander Pires(edvanderpires@gmail.com) on 2015-05-22T18:42:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_tese_lmralencar.pdf: 15264548 bytes, checksum: e3df53eb49036e78f623d089ab7e0995 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T18:42:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_tese_lmralencar.pdf: 15264548 bytes, checksum: e3df53eb49036e78f623d089ab7e0995 (MD5) Previous issue date: 2010 / The mechanical properties of living cells have a crucial role in the accomplishment of their physiological functions. However, our knowledge on this subject is still limited. Is not fully understood how a cell responds structurally and mechanically to an external pressure or as the elasticity of cells is altered in diseased organisms compared to healthy ones. Recently, the biomechanics of cancer cells, in particular the elasticity or stiffness, has been identified as an important factor that is related to function, adhesion, motility, invasion and transformation of the neoplastic cells. Studies in vivo show that cancerous transformations introduce significant changes in the structure and behavior of cells. These differences can cause changes in mechanical properties, often leading to greater cell deformability. Quantifying the change of elasticity using mechanical tests in conjunction with a microscopic examination, can become a powerful method for the diagnosis of cancer, and open new routes for treatments. In this context, Atomic Force Microscopy (AFM) is presented as an ideal tool for cell research due to its high resolution capability for surface nano-manipulation, ability to work in fluids and for being a noninvasive and nondestructive technique. This study investigates the mechanical response of cancer cells (lines A-498 and ACHN), compared to normal cells (RC-124). Using an AFM and its components as a morphological tool of high resolution characterization and characterization of the cells mechanical properties using the AFM probe as a nano-indenter, and from the strength data obtained by the microscope, and appropriate theoretical models to interpret these data to obtain qualitative and quantitative values of the elastic response these cells. / As propriedades mecânicas de células vivas possuem um papel crucial no bom desempenho de suas funções fisiológicas. Porém, nosso conhecimento nesse assunto ainda é limitado. Não é totalmente compreendido como uma célula responde, estrutural e mecanicamente, a uma tensão externa ou como a elasticidade das células altera-se em organismos doentes em comparação a organismos sadios. Recentemente, a biomecânica de células do câncer (em particular, a elasticidade ou rigidez) tem sido apontada como um fator importante que está relacionado à função, adesão, motilidade, transformação e invasão da célula neoplásica. Estudos in vivo mostram que transformações cancerosas introduzem alterações significativas na estrutura e comportamento celular. Essas diferenças também podem causar alterações nas propriedades mecânicas, geralmente levando a uma maior deformabilidade da célula. A quantificação da alteração de elasticidade, utilizando ensaios mecânicos em conjunto com um exame microscópico, pode tornar-se um poderoso diagnóstico do câncer e abrir caminhos para novos tratamentos. Neste contexto, a Microscopia de Força Atômica (AFM) se apresenta como uma ferramenta ideal para a investigação de células por sua alta resolução, capacidade de nano-manipulação de superfícies, possibilidade de trabalhar em meios líquidos e por ser uma técnica não destrutiva. Neste trabalho, propõe-se a investigação da resposta mecânica de células cancerígenas (linhagens A-498 e ACHN), comparando-se com células normais (RC-124), utilizando-se um Microscópio de Força Atômica e seus componentes como ferramentas de caracterização morfológica de alta resolução e caracterização das propriedades mecânicas dessas células. Utilizando a sonda de AFM como nano-indentador e a partir dos dados de força obtidos pelo microscópio, analisados por meio de modelos teóricos adequados, temos por objetivo obter valores qualitativos e quantitativos da resposta elástica dessas células.

Orientador: João Ernesto de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zafred_RafaelRosolenTeixeira_M.pdf: 2402931 bytes, checksum: 1695b8ad500015e973737d3b719cde53 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Astronium fraxinifolium Schott., conhecido popularmente como "Gonçalo Alves", é uma espécie vegetal característica de regiões tropicais e tem sua distribuição no Cerrado Brasileiro, possui o caule e as folhas ricos em substâncias tânicas. Relatados populares indicam a utilização de A. fraxinifolium no tratamento de diarreias, disenterias, anti-séptico, anti-microbiano, antihemorrágico, cicatrizante, anti-inflamatório e antiulcerogênico. Devido o uso popular e a insuficiência de dados na literatura, este trabalho teve por objetivo avaliar as potenciais atividades farmacológicas desta espécie em modelos experimentais in vitro (atividade antiproliferativa em cultura de células) e in vivo (toxicidade aguda, modelos de nocicepção, inflamação e tumor sólido murino) O material vegetal (cascas do caule e folhas) obtido das coletas foram secos e triturados, o pó obtido foi utilizado para obtenção dos extratos por maceração mecânica e sistema Soxhlet. Estes foram avaliados conforme seu rendimento e demonstraram a presença de taninos hidrolisáveis, como compostos majoritários, e flavonoides. No teste realizado em cultura de células tumorais e não tumorais de diferentes origens os extratos apresentaram, em sua maioria, uma ação citostática na maior concentração testada (250µg/mL). Por outro lado, nos testes relacionados com atividade antinociceptiva extrato bruto das folhas demonstrou atividade nas doses de 100 e 200mg/Kg no modelo da formalina em ambas as fases. Nos modelos inflamatórios (úlcera induzida por indometacina, edema de pata induzido por carragenina e edema de orelha induzido por óleo de cróton) as doses de 100 e 200mg/Kg, no modelo de edema de pata induzido por carragenina, e as doses de 150 e 300mg/Kg, no modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton, demonstraram atividade anti-inflamatória. Considerando que aproximadamente 25% dos tumores estão relacionados com inflamações crônicas, o extrato das folhas de A. fraxinifolium foi avaliado no modelo experimental do tumor sólido de Ehrlich no flanco, demonstrando inibição do crescimento tumoral na dose de 100mg/Kg. Sendo assim, os resultados experimentais sugerem que a espécie A. fraxinifolium possui atividade antiinflamatória dos componentes do extrato bruto, corroborando com sua utilização popular. Além de promover inibição do crescimento tumoral indicando que os componentes do extrato podem atuar em outros processos além do inflamatório. Porém, outros estudos necessitam ser realizados para identificar a classe de compostos que promoveram as atividades farmacológicas da espécie / Abstract: Astronium fraxinifolium Schott., popularly known as "Gonçalo Alves", is a species characteristic of tropical regions with their distribution in the Brazilian Cerrado, has stems and leaves rich in tannic substances. Reported the use of folk medicinal indicate A. fraxinifolium in the treatment of diarrhea, dysentery, antiseptic, anti-microbial, antihaemorrhagic, wound healing, anti-inflammatory and antiulcerogenic. Due to popular use and insufficient data in the literature, this study aimed to evaluate potential pharmacological activities of this species in vitro experimental models (antiproliferative activity in cell culture) and in vivo (acute toxicity models of nociception, inflammation and tumor solid murine) The plant material (stems and leaves) samples were obtained from dried and crushed, the powder obtained was used to obtain the extracts, mechanical maceration and soxhlet system. These were evaluated according to their yield and showed the presence of hydrolyzable tannins, as main compounds, and flavonoids. Testing conducted on cultured tumor and non-tumor cells of different origins, the extracts showed mostly a cytostatic action at the highest concentration tested (250?g/mL). Moreover, in tests related antinociceptive crude extract of the leaves showed activity at doses of 100 and 200mg/Kg in the formalin model in both phases. In inflammatory models (indomethacin-induced ulcer, paw edema induced by carrageenan and ear edema induced by croton oil) doses of 100 and 200mg/Kg in paw edema induced by carrageenan model, and the doses of 150 and 300mg/kg, in the ear edema induced by croton oil model, demonstrated anti-inflammatory activity. Considering that approximately 25% of tumors are associated with chronic inflammation, the extract of A. fraxinifolium was assessed in the experimental model of Ehrlich solid tumor in the flank, demonstrating inhibition of tumor growth at a dose of 100mg/kg. Thus, experimental results suggest that the species A. fraxinifolium has anti-inflammatory component of the crude extract activity, confirming its popular use. In addition to promoting tumor growth inhibition indicating that extract components can act in addition to other inflammatory processes. However, other studies should be performed to identify the class of compounds that promoted the pharmacological activity of the species / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestre em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Linhagens celulares humanas tem despertado interesse como plataformas de produção de proteínas terapêuticas recombinantes por sua capacidade de realizar modificações pós-traducionais complexas e de modo similar à humana, sem gerar epítopos imunogênicos como ocorre com proteínas produzidas em células de mamíferos. Para a produção de uma proteína com correta qualidade terapêutica, as agências regulatórias recomendam processos livres de componentes animais de modo a evitar contaminação com vírus e príons. Deste modo, esse trabalho visa a produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante (FVIIr) utilizada no tratamento de hemofílicos com inibidores em células humanas adaptadas para meios de cultura livres de soro fetal bovino. As linhagens humanas SK-Hep-1, HKB-11 e Huh-7 foram adaptadas para suspensão e meios livres de soro fetal bovino (SFB). Essas células adaptadas foram transfectadas de forma transiente com o vetor lentiviral p1054-GFP e o reagente polietilenimina. No entanto, a baixa eficiência de transfecção nas células SK-Hep-1 e Huh-7 mostraram que essas linhagens são difíceis de transfectar por esse método, e mesmo a transfecção da célula HKB-11 só foi possível após a variação de alguns parâmetros, resultando em uma transfecção de 49,5% de células HKB-11 GFP-positivas. Desta forma, a expressão estável foi avaliada e as células adaptadas foram transduzidas com um ciclo de lentivírus (MOI = 1) contendo o vetor p1054-FVII. Foram observadas porcentagens de células GFP-positivas acima de 35% nas três linhagens celulares humanas modificadas. As células transduzidas foram submetidas a dois processos de sorting por citometria de fluxo, no qual a população obtida apresentava mais de 90% de células GFP-positivas. As três células foram avaliadas com relação à expressão de FVIIr após a adição de vitamina K no cultivo, no entanto, não foi possível detectar níveis de FVIIr no sobrenadante de 48 horas do cultivo dessas células pelo teste ELISA. As células foram transduzidas com um segundo ciclo de lentivírus (MOI = 2). A quantificação por ELISA do sobrenadante de 48 horas de cultivo das três células detectou 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL e 78,46 ng/mL de FVII total, respectivamente, nos cultivos das células HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C e Huh-7-F7-2C. A expressão relativa de RNA mensageiro por RT-PCR também foi observada nos três cultivos. Paralelamente, foi analisado o proteoma das três células adaptadas e não-adaptadas em triplicata sendo identificadas de forma abundante proteínas do citoesqueleto, do metabolismo celular, da síntese, enovelamento e degradação de proteínas, relacionadas à apoptose, ao ciclo celular e ao crescimento, proteínas contra estresse oxidativo e osmótico, com ação antioxidante, entre outras. / Human cell lines have attracted great interest as a plarform for recombinant therapeutic proteins production, due their ability to perform complex posttranslational modification in a similar manner to human proteins. These proteins do not carry immunogenic epitopes as occurs with proteins produced in mammalian cells. These therapeutic proteins should be produced in a animal-free process avoiding virus and prion contamination, as recommended by regulatory agencies for quality control. Thus, this work aims the production of recombinant blood coagulation factor VII (rFVII) used in the treatment of hemophiliacs with inhibitors in human cell lines adapted to serum-free suspension cultures. Human cell lines SK-Hep-1, HKB-11 and Huh-7 were adapted to suspension and serum-free media. These adapted cells were transiently transfected with p1054-GFP lentiviral vector and the polyethyleneimine reagent. However, low transfection efficiency in SK-Hep-1 and Huh-7 cells showed that these cells are difficult to transfect by this method, and even transfection of HKB-11 cell was only possible after varying some parameters, resulting in a 49,5% HKB-11 GFP-positive cells. Stable transfection was assessed and adapted cells were transduced with lentivirus particles containing p1054-FVII vector in one cycle (MOI=1). Percentages of GFP-positive cells above 35% were observed in three modified human cell lines. Transduced cells were sorted by FACS and more than 90% of GFP-positive cells were obtained. The expression of rFVII were evaluated by ELISA test after vitamin K supplementation, however, it was not possible to detect FVII levels in the 48 hour culture supernatant. Cells were transduced again with a second lentivirus cycle (MOI = 2). ELISA quantification of the 48 hour culture supernatant detected 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL and 78,46 ng/mL total FVII, respectively, in the cultures of HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C and Huh-7-F7-2C cells. Relative expression of mRNA by RT-PCR was also observed in the three cultures assessed. In parallel, a proteomic analysis of adapted and non-adapted cells was performed in triplicate. Proteins related to cellular metabolism, cytoskeletal structure, apoptosis, cell cycle and cell growth, against oxidative and osmotic stress, antioxidant action were found.

Chitosan is a biocompatible and biodegradable mucoadhesive polymer with unique advantages, such as the distinct trait of opening the junctions to allow paracellular transport of antigen and good tolerability. However, the poor solubility of chitosan in neutral or alkalinized media has restricted its applications in the pharmaceutical field. Chitosan can be easily carboxymethylated to improve its solubility in aqueous media, while its biodegradability and biocompatibility are preserved. Apart from this, carboxymethyl chitosan (CMCS) can be easily processed into nanoparticles which highlight its suitability and extensive usage for preparing different drug delivery formulations. The present study deals with the development and characterization of a delivery system based on CMCS nanoparticles using ovalbumin as model protein. We demonstrated that ovalbumin loaded nanoparticles were successfully synthetized using calcium chloride as a cross-linker by ionic gelation. The nanoparticles exhibited an average size of approximately 169 nm and presented a pseudo-spherical shape. The nanoparticles size increased according to the addition of CaCl2 due to the strong electrostatic attraction. During storage the nanoparticles size increased was attributed to swelling and aggregation. The loading efficiency of ovalbumin was found to be 17%. Confocal microscopy clearly showed the association between ovalbumin and CMCS chains into nanoparticles. Therefore, we suggest these nanoparticles can be considered as an attractive and promising carrier candidate for proteins and antigens. The major challenge that limits the use of such carriers is their instability in an aqueous medium. Thus, the next step of this work was to determine the robustness of several formulations using distinct freeze-drying protocols. This study demonstrated that mannitol in concentration of 10% (w/v) is well suited to preserve ovalbumin loaded CMCS nanocapsules from aggregation during lyophilization and subsequent reconstitution. Importantly, the results showed that an annealing step has a huge impact on porosity of freeze-dried cake by nearly complete crystallization of mannitol, once the crystalline matrix prevents the partial collapse and the formation of larger pores observed without annealing. Therefore, the usual observation that annealing increases the pore size due to growth of ice crystal size does not always apply, at least when crystallization of solute is involved. Since all characterizations and stability studies had been performed, the main purpose of this study was to develop a stable antigen delivery system for oral immunization using CMCS and inactivated rabies virus (RV) as the antigen. RV loaded nanoparticles was found to enhance both systemic (IgG) and local (IgA) immune responses against RV after oral delivery in mice. The effective doses 50% were 50-times higher than the negative controls, indicating that the immune response started only after the third boosting dose. Furthermore, enough neutralizing antibodies was produced to be protected against the harmful effects of the rabies virus. It is therefore concluded, that the CMCS nanoparticles formulated in this study, are suitable for oral vaccine delivery, and can be suggested as a promising delivery system for a diverse range of antigens as well as a gene/protein delivery system, especially for those positively charged. Since several approaches show that effective intervention in airway allergic inflammation can be achieved with allergen-activated interleukin-10-secreting cells, the final part of this work was dedicated to assessing whether IL-10 loaded chitosan nanoparticles (IL10-CSNPs) could be used as a possible inhalable therapeutic tool for preventing exacerbations in asthmatic patients. As positive controls, we also assess whether interleukin 17A and interleukin 9 have the ability to stimulate human airway smooth muscle (HASM) cell contractility using magnetic twisting cytometry (MTC). Significant decreased baseline cell stiffness was observed in HASM cells pre-treated with IL-10, but not with IL10-CSNPs, whereas treatment with IL-17A significantly enhanced baseline cell stiffening. Our findings reveal a previously unknown mechanism underlying immunotherapy for prevention and treatment of asthma. / A quitosana é um polímero mucoadesivo biocompatível e biodegradável, com vantagens únicas, tais como a característica distinta de abrir as junções que permitim o transporte paracelular de antígenos e boa tolerabilidade. No entanto, sua baixa solubilidade em meios neutros ou alcalinizados tem restringido suas aplicações no campo farmacêutico. A quitosana pode ser facilmente carboximetilada para melhorar de sua solubilidade em meios aquosos, enquanto sua biodegradabilidade e biocompatibilidade são preservadas. Além disso, a carboximetilquitosana (CMCS) pode ser facilmente processada na forma de nanopartículas, o que destaca sua adequabilidade para uso extensivo no preparo de sistemas de delivery de medicamentos. O presente estudo trata do desenvolvimento e caracterização de um sistema de delivery baseado em nanopartículas de CMCS utilizando ovalbumina como proteína modelo. Nós demonstramos que as nanopartículas carregadas com ovalbumina foram sintetizadas com sucesso utilizando cloreto de cálcio como agente de reticulação por gelificação iônica. As nanopartículas exibiram um tamanho médio de aproximadamente 169 nm e apresentaram uma forma pseudo-esférica. O tamanho das nanopartículas aumentou de acordo com a adição de CaCl2 devido à forte atração eletrostática. Durante o armazenamento, o tamanho aumentado das nanopartículas foi atribuído a incorporação de água e agregação. A eficiência de encapsulamento da ovalbumina foi de aproximadamente 17%. A microscopia confocal mostrou claramente a associação entre ovalbumina e a cadeias de CMCS nas nanopartículas. Sugerimos, portanto, que tal sistema pode ser considerado como candidato atraente e promissor para o carreamento de proteínas e antígenos. O principal desafio que limita o uso desses carreadores consiste na instabilidade em meio aquoso. Assim, o próximo passo deste trabalho foi determinar a robustez de várias formulações utilizandose diferentes protocolos de liofilização. Este estudo demonstrou que o manitol em uma concentração de 10% (p/v) é adequado para preservar da agregação as nanocápsulas de CMCS carregadas com ovalbumina durante a liofilização e subsequente reconstituição. Mais importante, os resultados mostraram que uma etapa de annealing tem um enorme impacto sobre a porosidade da amostra liofilizada devido a quase completa cristalização do manitol, uma vez que a matriz cristalina evita o colapso parcial e a formação de poros maiores observados na ausência do annealing. Portanto, a observação comum de que o annealing aumenta o tamanho doporos devido ao crescimento dos cristais de gelo nem sempre se aplica, pelo menos quando a cristalização de um soluto está envolvida. Uma vez que todas as caracterizações e estudos de estabilidade foram realizados, o principal objetivo deste estudo foi desenvolver um sistema estável de delivery de antígeno para imunização oral utilizando CMCS e vírus rábico inativado (RV) como antígeno. Verificou-se que as nanopartículas carregadas com RV aumentam as respostas imune sistêmica (IgG) e local (IgA) contra o RV após administração oral em camundongos. As doses efetivas 50% foram 50 vezes maiores que os controles negativos, indicando que a resposta imune foi iniciada apenas após a terceira dose da vacina. Além disso, foram produzidos anticorpos neutralizantes suficientes para proteção contra os efeitos nocivos do vírus rábico. Conclui-se, portanto, que as nanopartículas de CMCS formuladas neste estudo, são adequadas para o delivery oral de vacinas, e podem ser sugeridas como um sistema promissor de delivery para uma gama diversa de antígenos, bem como para o delivery de genes/proteínas, especialmente para aqueles carregados positivamente. Uma vez que diversas abordagens mostram que uma intervenção efetiva em casos de inflamação alérgica de vias aéreas pode ser conseguida por meio de células secretoras de interleucina 10 (IL-10) mediante ativação por alergenos, a parte final deste trabalho esteve dedicada a avaliação de nanopartículas de quitosana carregadas com IL-10 (IL10-CSNPs) como possível ferramenta terapêutica inalável para prevenção de exacerbações em pacientes asmáticos. Como controles positivos, avaliou-se adicionalmente se as interleucinas 17A (IL-17A) e 9 (IL-9) possuem a capacidade de estimular a contratilidade de células humanas de músculo liso de vias aéreas humanas (HASM) por meio de citometria de torção magnética (MTC). Uma diminuição significativa da rigidez celular basal foi observada em células HASM pré-tratadas com IL-10, mas não com IL10-CSNPs, enquanto que o tratamento com IL-17A aumentou significativamente a magnitude rigidez celular basal. Nossos resultados revelam um mecanismo previamente desconhecido subjacente à imunoterapia para prevenção e tratamento da asma.