Made available in DSpace on 2015-10-10T02:04:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475655-Texto+Completo-0.pdf: 1136903 bytes, checksum: 1a2ad879662fb2a0203c2418ab7dc36f (MD5) Previous issue date: 2015 / Liver fibrosis is a complex disease that is caused by inappropriate tissue repair due to the deposition of connective tissue. When a chronic lesion affects the liver, regenerative response fails and hepatocytes are replaced with abundant extracellular matrix (ECM). The imbalance between production and degradation of ECM will result in the accumulation of proteins that change normal liver architecture, and thus its functionality. The main source of ECM is the activated hepatic stellate cell (HSC). In order, to clarify possible therapeutic approaches to the disease, the this work aimed to evaluate the possible antifibrotic action of Pluchea sagitallis (Lam. ) Cabrera on an activated HSC immortalized lineage (GRX). Our results demonstrated that the P. sagittalis aqueous extract at 0. 039 and 0. 078 mg/mL concentrations was able to reduce cell growth and proliferation. Regarding to oxidative stress evaluation, there was no statistically significant difference between the treated group and the control. Staining with OilRed-O (ORO) showed a statistically significant increase in intracellular lipid content after 5 days of treatment, exerting in vitro effect on the GRX phenotypic change of activated towards the quiescent state. These results were confirmed by colorimetric quantification of lipid content. Regarding the TGF-β1 and collagen production, there were no statistically significant differences observed between the groups. In conclusion, the P. sagittalis aqueous extract reduces the growth and proliferation of GRX cells and induces the reversal of activated towards a quiescent phenotype. There was no decrease in cell proliferation either by necrosis or by apoptosis via activation of the senescence. Thus, our data suggest that the extract showed an antifibrotic effect, possibly by activating phenotype reversal. / A fibrose hepática apresenta uma patogênese complexa causada por reparo tecidual inadequado devido à deposição de tecido conectivo. Quando um dano crônico acomete o fígado, a resposta regenerativa falha e os hepatócitos são substituídos por matriz extracelular (ECM) excedente. Assim, o desequilíbrio entre a degradação e a produção de ECM acarretará no acúmulo dessas proteínas que alteram a arquitetura normal do fígado e, consequentemente, sua funcionalidade. A principal fonte de ECM é a célula estrelada hepática (HSC) ativada. Sendo assim, na tentativa de elucidar possíveis abordagens terapêuticas para a doença, o objetivo desse trabalho foi avaliar a possível ação antifibrótica do extrato aquoso de Pluchea sagitallis (Lam. ) Cabrera sobre uma linhagem imortalizada de HSC ativadas (GRX). Nossos resultados demonstraram que as concentrações de 0,039 e 0,078 mg/mL do extrato aquoso de P. sagitallis foram capazes de diminuir o crescimento e a proliferação celular. Quanto à avaliação do estresse oxidativo, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre o grupo tratado e controle. A coloração com oil red (ORO) mostrou aumento significativo do conteúdo lipídico intracelular após 5 dias de tratamento, indicando efeito in vitro sobre a mudança fenotípica em linhagem GRX, do estado ativado para o estado quiescente. Esses resultados foram confirmados pela quantificação colorimétrica de lipídios. Em relação à produção de TGF-β1 e colágeno total, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. Concluindo, o extrato aquoso da P. sagittalis diminuiu o crescimento e a proliferação das células GRX e induziu a reversão do fenótipo ativado para quiescente.A diminuição na proliferação celular não ocorreu nem por necrose nem por ativação da apoptose e senescência. Sendo assim, nossos resultados sugerem que o extrato apresenta um efeito antifibrótico, possivelmente pela via que ativa a reversão do fenótipo.

Introdução e objetivos: Tem sido demonstrado que um moderado desacoplamento mitocondrial em células hepáticas pode reverter a hipertrigliceridemia, a doença de fígado gorduroso e a resistência à insulina. A dissipação da energia conservada no espaço intermembranas mitocontrial, como ocorre no desacoplamento, aumenta o uso de substratos energéticos e também podem reduzir a geração mitocondrial de espécies reativas de O2 (EROs). Duas estratégias de desacoplamento mitocondrial foram estudadas neste trabalho: a primeira consistiu em reduzir a velocidade da via de síntese de triacilgliceróis por meio da triacsin C (inibidor da Acil CoA Sintetase - ACS), e dessa forma aumentar os ácidos graxos livres (AGL) como substratos das proteínas desacopladoras; a segunda foi verificar se clusianona (composto natural das raízes de Clusia congestiflora), análogo estrutural do desacoplador químico nemorosoma, é capaz de promover o desacoplamento químico. Resutados e discussão: A triacsin C, em concentrações até 1 ?M, não apresentou efeito tóxico em mitocôndrias isoladas de fígado e nem em hepatócitos primários. Nesses últimos, aumentou o consumo de oxigênio nos estados de respiração basal e de máxima velocidade respiratória. Além disso, foi verificado um aumento da expressão do fator de transcrição PGC1- alfa e de ?-hidroxiacil CoA desidrogenase (HAD), uma enzima da beta-oxidação de ácidos graxos. A clusianona aumentou o consumo de O2 no estado de repouso, diminuiu o potencial de membrana, reduziu a produção de EROs e preveniu o inchamento mitocondrial induzido por Ca2+ de forma dose dependente, porém menos potente que a nemorosona. Conclusões: Nossos resultados indicam que a triacsin C acelerou o metabolismo mitocondrial, a oxidação de ácidos graxos e a biogênese mitocondrial; a clusianona foi caracterizada como um desacoplador eficaz da fosforilação oxidativa mitocondrial, provavelmente envolvendo um mecanismo protonofórico devido as suas propriedades químicas. Dessa forma, ambas as estratégias estudadas se mostram com potencial terapêutico no tratamento de doenças como esteatose hepática, hipertrigliceridemia e obesidade. / Introduction and Objectives: It has been shown that a mild mitochondrial uncoupling in livers can reverse hypertriglyceridemia, fatty liver disease and insulin resistance. The dissipation of energy stored in mitochondrial intermembrane space as heat, as in uncoupling, increases the use of energy substrates and may also reduce the mitochondrial generation of reactive O2 species (ROS). Two strategies to induce mitochondrial uncoupling were studied in this work: the first consisted of slowing down the route of triacylglycerols synthesis by triacsin C (acyl CoA synthetase inhibitor), and thus increasing the free fatty acids (FFA) as substrates for uncoupling proteins; the second was to determine whether clusianone (natural compound from the roots of Clusia congestiflora), a structural analogue of chemical uncoupler nemorosoma, is capable of promoting the chemical uncoupling. Results and discussion: The triacsin C, in concentrations up to 1 ?M, showed no toxic effect on liver mitochondria and primary hepatocytes. In hepatocytes triacsin C increased oxygen consumption in the states of basal respiration and maximum respiratory rate. In addition, there was an increase in the expression of the transcription factor PGC1 - ? and ? - hydroxyacyl CoA dehydrogenase (ADH), an enzyme of ?- oxidation of fatty acids. The clusianone increased O2 consumption in resting state, decreased membrane potential, reduced the production of ROS and prevented the mitochondrial swelling induced by Ca2+ in a dose dependent manner, but less potent than nemorosone. Conclusions: Our results indicate that triacsin C accelerated mitochondrial metabolism, fatty acid oxidation and mitochondrial biogenesis; the clusianone was characterized as an effective uncoupler of mitochondrial oxidative phosphorylation, probably involving a protonoforic mechanism due to its chemical properties. Therefore, both strategies have therapeutic potential in the treatment of diseases such as liver steatosis, hypertriglyceridemia and obesity.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000447380-Texto+Completo-0.pdf: 675913 bytes, checksum: bfb87e6d734478e3c7bb6275c3132761 (MD5) Previous issue date: 2013 / Liver fibrosis is the wound healing response to repeated injury of the liver. It is characterized by disruption of the liver architecture associated with increased expression of extracellular matrix components. Hepatic stellate cells (HSC) play a key role in liver fibrogenesis. In normal liver, HSC are quiescent and its main function is to store vitamin A. During liver injury, these cells undergo activation, become myofibroblasts and acquire fibrogenic properties. Activation of PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) and inhibition of fibrogenic molecules are potential strategies to block HSC activation and differentiation. Aware that the process of hepatic fibrosis involves inflammatory mediators, various anti-inflammatory substances have been studied in an attempt to revert fibrosis. The purpose of this study was to investigate the in vitro effects of fructose-1,6-bisphospahte (FBP) on HSC phenotype. The results demonstrated that FBP induced quiescent phenotype in HSC via PPARγ activation. Significant decrease in type I collagen mRNA expression was observed in the first 24h of treatment. These events preceded the reduction of TGF-β1 (transforming growth factor-beta) and total collagen secretion. Thus, FBP promoted downregulation of HSC activation by its antifibrotic and anti-inflammatory actions. These findings demonstrate that FBP may have potential as a novel therapeutic agent for the treatment of liver fibrosis. / A fibrose hepática é a resposta cicatricial do fígado a lesões continuadas, caracterizada pelo rompimento da arquitetura hepática associada ao aumento da expressão dos componentes da matriz extracelular. As células estreladas hepáticas (HSC) desempenham um papel fundamental no processo de fibrogênese. No fígado normal, as HSC encontram-se em sua forma quiescente de depósito de vitamina A. Durante a lesão hepática, essas células passam por uma ativação fenotípica, tornam-se miofibroblastos e adquirem propriedades fibrogênicas. O processo de fibrose hepática envolve vários mediadores inflamatórios e, portanto, substâncias anti-inflamatórias tem sido empregadas na tentativa de reverter a fibrose e bloquear a ativação e diferenciação das HSC. A ativação de PPARγ (receptor ativado por proliferador de peroxissomo Gama) e a inibição de moléculas fibrogênicas são possíveis estratégias para estes fins.O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos in vitro da frutose-1,6-bisfosfato (FBP) sobre o fenótipo das HSC. Os resultados demonstraram que a FBP é capaz de induzir o fenótipo quiescente das HSC via ativação de PPARγ. Foi observado nas primeiras 24h de tratamento uma diminuição significativa da expressão de mRNA de colágeno tipo I. Posteriormente, houve uma redução do colágeno total e de TGF-β1 (fator de transformação do crescimento beta). Assim, a FBP diminui o estado de ativação das HSC por suas ações antifibróticas e anti-inflamatórias. Estas descobertas demonstram que a FBP pode ser um potencial novo agente terapêutico para o tratamento de fibrose hepática.

Introdução e objetivos: Tem sido demonstrado que um moderado desacoplamento mitocondrial em células hepáticas pode reverter a hipertrigliceridemia, a doença de fígado gorduroso e a resistência à insulina. A dissipação da energia conservada no espaço intermembranas mitocontrial, como ocorre no desacoplamento, aumenta o uso de substratos energéticos e também podem reduzir a geração mitocondrial de espécies reativas de O2 (EROs). Duas estratégias de desacoplamento mitocondrial foram estudadas neste trabalho: a primeira consistiu em reduzir a velocidade da via de síntese de triacilgliceróis por meio da triacsin C (inibidor da Acil CoA Sintetase - ACS), e dessa forma aumentar os ácidos graxos livres (AGL) como substratos das proteínas desacopladoras; a segunda foi verificar se clusianona (composto natural das raízes de Clusia congestiflora), análogo estrutural do desacoplador químico nemorosoma, é capaz de promover o desacoplamento químico. Resutados e discussão: A triacsin C, em concentrações até 1 ?M, não apresentou efeito tóxico em mitocôndrias isoladas de fígado e nem em hepatócitos primários. Nesses últimos, aumentou o consumo de oxigênio nos estados de respiração basal e de máxima velocidade respiratória. Além disso, foi verificado um aumento da expressão do fator de transcrição PGC1- alfa e de ?-hidroxiacil CoA desidrogenase (HAD), uma enzima da beta-oxidação de ácidos graxos. A clusianona aumentou o consumo de O2 no estado de repouso, diminuiu o potencial de membrana, reduziu a produção de EROs e preveniu o inchamento mitocondrial induzido por Ca2+ de forma dose dependente, porém menos potente que a nemorosona. Conclusões: Nossos resultados indicam que a triacsin C acelerou o metabolismo mitocondrial, a oxidação de ácidos graxos e a biogênese mitocondrial; a clusianona foi caracterizada como um desacoplador eficaz da fosforilação oxidativa mitocondrial, provavelmente envolvendo um mecanismo protonofórico devido as suas propriedades químicas. Dessa forma, ambas as estratégias estudadas se mostram com potencial terapêutico no tratamento de doenças como esteatose hepática, hipertrigliceridemia e obesidade. / Introduction and Objectives: It has been shown that a mild mitochondrial uncoupling in livers can reverse hypertriglyceridemia, fatty liver disease and insulin resistance. The dissipation of energy stored in mitochondrial intermembrane space as heat, as in uncoupling, increases the use of energy substrates and may also reduce the mitochondrial generation of reactive O2 species (ROS). Two strategies to induce mitochondrial uncoupling were studied in this work: the first consisted of slowing down the route of triacylglycerols synthesis by triacsin C (acyl CoA synthetase inhibitor), and thus increasing the free fatty acids (FFA) as substrates for uncoupling proteins; the second was to determine whether clusianone (natural compound from the roots of Clusia congestiflora), a structural analogue of chemical uncoupler nemorosoma, is capable of promoting the chemical uncoupling. Results and discussion: The triacsin C, in concentrations up to 1 ?M, showed no toxic effect on liver mitochondria and primary hepatocytes. In hepatocytes triacsin C increased oxygen consumption in the states of basal respiration and maximum respiratory rate. In addition, there was an increase in the expression of the transcription factor PGC1 - ? and ? - hydroxyacyl CoA dehydrogenase (ADH), an enzyme of ?- oxidation of fatty acids. The clusianone increased O2 consumption in resting state, decreased membrane potential, reduced the production of ROS and prevented the mitochondrial swelling induced by Ca2+ in a dose dependent manner, but less potent than nemorosone. Conclusions: Our results indicate that triacsin C accelerated mitochondrial metabolism, fatty acid oxidation and mitochondrial biogenesis; the clusianone was characterized as an effective uncoupler of mitochondrial oxidative phosphorylation, probably involving a protonoforic mechanism due to its chemical properties. Therefore, both strategies have therapeutic potential in the treatment of diseases such as liver steatosis, hypertriglyceridemia and obesity.

Made available in DSpace on 2014-01-28T01:01:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000453321-Texto+Completo-0.pdf: 2208938 bytes, checksum: 36179d9e8ff3571a84f104fd9b7bd8ef (MD5) Previous issue date: 2013 / Fibrosis is a chronic liver disease that is a major cause of human mortality and is characterized by the accumulation of extracellular matrix in response to chronic liver injury. Important causes of chronic liver injury are: viral hepatitis, metabolic diseases, autoimmune diseases and exposure to chemicals, such as alcohol or drugs. The GRX cells are a representative line of hepatic stellate cells (HSC), which is associated with development of fibrosis, in the last stage is the cirrhosis. In healthy liver, these cells exhibit a phenotype or quiescent lipocyte characterized by its hability to store lipid droplets. Gallic acid is involved in several biological processes such as cell growth inhibition and apoptosis also has a variety of pharmacological actions, including antioxidant activity, anti-inflammatory, antimicrobial and antitumor. The aim of this study was to investigate the in vitro effects of gallic acid on the phenotype of HSC. The results showed that gallic acid is able to reduce cell proliferation, induce quiescent phenotype in HSCs by increasing lipid droplets, probably by activating peroxisome proliferator-activated receptor gama, decrease of transforming growth factor 1 signaling and decreased expression of collagen type I. These results demonstrate that the gallic acid may be a novel therapeutic agent for treating hepatic fibrosis. / A fibrose é uma doença crônica do fígado que representa uma das maiores causas de mortalidade humana e é caracterizada pelo acúmulo de matriz extracelular em resposta à lesão hepática crônica. Importantes causas de lesões hepáticas crônicas são: hepatites virais, doenças metabólicas, doenças autoimunes e exposição a substâncias químicas, como álcool ou drogas. As células GRX são uma linhagem representativa das células estreladas hepáticas (HSC), que está associada ao desenvolvimento da fibrose que, em último estágio, é a cirrose. No fígado saudável, estas células apresentam um fenótipo quiescente ou lipocítico, caracterizado pela sua capacidade de armazenar gotículas lipídicas. O ácido gálico está envolvido em vários processos biológicos, tais como a inibição do crescimento celular e apoptose, além de possuir uma variedade de ações farmacológicas, incluindo as atividades antioxidantes, anti-inflamatórias, antimicrobiana e antitumoral. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos in vitro do ácido gálico sobre o fenótipo das HSC. Os resultados obtidos mostraram que o ácido gálico é capaz reduzir a proliferação celular, induzir o fenótipo quiescente nas HSCs pelo aumento de gotículas lipídicas, provavelmente pela ativação do receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama, bloqueio da sinalização de fator de transformação do crescimento beta 1 e diminuição da expressão do colágeno tipo I. Estes resultados demonstram que o ácido gálico pode ser um novo agente terapêutico para o tratamento de fibrose hepática.

Made available in DSpace on 2014-09-19T02:01:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000461390-Texto+Completo-0.pdf: 2830978 bytes, checksum: c3b746f15a8c1946dc08a31f60e01821 (MD5) Previous issue date: 2014 / Hereditary hemochromatosis (HH) is a genetic disease where iron balance is deregulated and this metal accumulates in the liver, causing toxic effects and fibrosis. Fibrosis is an exacerbated wound-healing response with extracellular matrix (ECM) deposition. Hepatic stellate cells (HSC), when activated, are the main responsible for ECM production. Fructose-1,6-bisphosphate (FBP) is a sugar and possess innumerous beneficial effects, like enhance cell antioxidant potential, protects liver from damage and reverts the phenotype of activated HSC. Because of this, we aimed to test the effects of FBP in immortalized HSC line (GRX) exposed to free iron (Fe) tempting to simulate what occurs in patients with HH. Fe (1mg/L) treatment for 8 days increased cell growth, whereas Fe + FBP (1mg/L + 0. 6mM) decreased cell proliferation to levels below of control. LDH activity, apoptosis rate and cell cycle were not altered in any group. Oil Red-O (ORO) staining showed a decrease in lipid content when GRX cells were Fe-treated (1mg/L) for 8 days.In Fe + FBP (1mg/L + 0. 6mM), GRX cells showed increased lipid content and characteristics of quiescent HSC. PPAR-? expression was diminished on Fe group and same as control on Fe + FBP group. On the contrary, Fe treatment rose Col-1 expression and Fe + FBP reversed it to control levels. TGF-ß1 was unaltered in Fe group. However, on Fe + FBP group, TGF-ß1 levelswas far bellow of control and Fe-treated group, showing an antifibrotic activity. FBP didn’t present antioxidant activity by DPPH assay. Ferrozine assay showed a decreased absorbance after 120 min in all FBP-tested doses, demonstrating that FBP is an iron chelator. These data demonstrate that FBP reverse the phenotype of GRX cells even when in Fepresence and that this could be caused by regulation of PPAR-? and COL-1. In conclusion, FBP diminished the growth rate and reversed the phenotype of GRX cell, showing a possible antifibrotic effect. / Hemocromatose hereditária (HH) é uma doença genética onde o balanço do ferro está desregulado e esse metal se acumula no fígado, causando efeitos tóxicos e, principalmente, fibrose. Fibrose é uma resposta de cicatrização exacerbada com depósito de matriz extracelular (ECM). Células estreladas hepáticas (HSC) quando ativadas são as maiores responsáveis pela produção de ECM. Frutose-1,6-bisfosfato (FBP) é um açúcar e possui inúmeros efeitos benéficos, como melhorar o potencial antioxidante da célula, proteger o fígado de lesão e reverter o fenótipo de HSC ativadas. Por causa disso, nosso objetivo foi testar os efeitos da FBP em uma linhagem imortalizada de HSC (GRX) expostas a ferro livre (Fe), na tentativa de simular o que ocorre em pacientes com HH. O tratamento com Fe (1mg/L) por 8 dias aumentou a proliferação celular enquanto o tratamento com Fe + FBP (1mg/L + 0. 6mM) a diminuiu para níveis menores que os do controle. A atividade da LDH, taxa de apoptose e ciclo celular não foi alterada em nenhum grupo.A coloração com OilRed-O (ORO) mostrou uma diminuição na quantidade de lipídio intracelular quando as células foram tratadas com Fe por 8 dias. No grupo Fe + FBP, houve um aumento do conteúdo lipídico e as células apresentaram características morfológicas de células quiescentes. A expressão de PPAR-? foi diminuída no grupo Fe e igual ao controle no grupo Fe + FBP. Ao contrário, o Fe aumentou os níveis de expressão de Colágeno tipo I (Col-1) e o tratamento concomitante com FBP reverteu esse efeito, ficando igual ao controle. A produção de TGF-ß1 se manteve inalterada no grupo Fe e foi menor que o controle no tratamento com Fe + FBP, mostrando uma atividade antifibrótica da FBP. O teste de DPPH mostrou que a FBP não possui atividade antioxidante em nenhuma dose testada. O teste de Ferrozine mostrou uma diminuição da absorbância depois de 120 minutos de incubação de FBP + Fe em todas as doses testadas, mostrando que a FBP é um quelante de ferro. Esses dados demonstram que FBP reverte o fenótipo das células GRX mesmo quando em presença do Fe e que isso pode ser causado pela regulação da expressão do PPAR-? e COL-1. Em conclusão, a FBP diminuiu o crescimentoe reverteu o fenótipo de células GRX, mostrando um possível efeito antifibrótico.

Avaliaram-se os efeitos da administração do extrato seco de maracujá (Passiflora incarnata), veiculado na dieta, sobre a morfologia dos hepatócitos de juvenis de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus). Peixes isolados (86,50 &plusmn; 10,17 g) receberam durante 28 dias ração comercial extrusada (32% PB - 2% biomassa) contendo o extrato diluído em alginato de sódio nas doses 0 (controle), 50, 100 e 200 mg/Kg, (n = 6 peixes/tratamento), registrando-se diariamente o consumo. No início e ao final do experimento cada indivíduo foi exposto (30 minutos) à reflexão da própria imagem em espelho (presença virtual de um coespecífico - estresse social), sendo a seguir anestesiado (2-fenoxietanol 0,5 mL/L) para realização de biometria e coleta de sangue (veia caudal) para determinação dos níveis plasmáticos de glicose e cortisol. Após 28 dias todos os animais foram sacrificados para remoção do fígado e obtenção de fragmentos utilizados na contagem de células e avaliação da morfometria do citoplasma dos hepatócitos (H/E), observando-se também as reservas de glicogênio hepático (PAS). Visando a comparação dos efeitos do estresse social natural com aquele empregado no experimento, seis peixes provenientes de um grupo de 30 indivíduos foram também sacrificados e utilizados como referência (valores basais) para avaliação dos parâmetros histológicos. Os dados foram submetidos a ANOVA, utilizando-se o proc mixed SAS 8.0 (p<0,05) para os parâmetros consumo de alimento, ganho em peso e bioquímica sangüínea (cortisol e glicose) e GLM SAS 8.0 (p<0,01) para a contagem de células e morfometria dos hepatócitos. Verificou-se que os pesos e os comprimentos iniciais não diferiram, que o consumo de alimento não foi alterado pela adição do extrato e que todos os peixes, independentemente do tratamento, cresceram significativamente. Os níveis de cortisol e de glicose também não diferiram inicialmente entre os grupos e não foram alterados pela presença do agente ou pela adição do extrato. Porém, observou-se um aumento significativo da glicose e redução dos níveis de cortisol em todos os peixes. A adição do extrato nas diferentes doses provocou aumento crescente e significativo da área citoplasmática e redução do número de células em todos os animais, com destaque para a dose 100 mg/Kg. O mesmo não ocorreu nos peixes do grupo controle, cujas áreas citoplasmáticas foram significativamente menores, em decorrência de um menor acúmulo de glicogênio hepático. Embora os efeitos do agente estressor empregado não tenham sido detectados pela análise dos parâmetros bioquímicos sangüíneos, verificou-se que este procedimento provocou alterações metabólicas que contribuíram para a depleção dos estoques de glicogênio no fígado. Este efeito parece ter sido revertido nos peixes que receberam a dieta contendo o extrato de maracujá que, por meio de mecanismos não elucidados neste trabalho, contribuiu para a manutenção ou aumento dos estoques de glicogênio hepático. Concluiu-se que o extrato de maracujá veiculado na dieta, na dose de 100 mg/Kg, protege juvenis de tilápia da depleção dos estoques de glicogênio hepático causada pelo estresse social. / Effects of Passion fruit (Passiflora incarnata) dry extract administration on hepatocyte morphometry of juveniles Nile tilapias (Oreochromis niloticus) were investigated. Male isolated fish (86,50 &plusmn; 10,17 g) were daily fed (28 days) with extruded commercial ration (32% crude protein - 2% biomass) containing the extract diluted in sodium alginate in graded doses 0 (control), 50, 100 and 200 mg/Kg (n= 6 animals/treatment), registering daily consumption. At the start and after 28 days of experiment each fish was displayed to the reflection of own mirror image (30 minutes) in order to simulate the virtual presence of a coespecific (social stress). Then the animals were anesthetized (2-fenoxietanol) for biometric measures and blood collection (caudal vein) for determination of the plasmatic levels of glucose and cortisol. After 28 days the animals were sacrificed for removal of liver fragments samples used to histological examination (cytoplasmic area and number of cells - HE stained; hepatic glycogen supplies - PAS stained). Aiming the comparison of the natural social stress with that utilized in this experiment, six fish from a group of 30 individuals were also sacrificed and used as reference (basal values) for the histological parameters evaluation. Food consumption, weight gain and sanguine biochemist parameters (cortisol and glucose) were submitted to ANOVA, SAS 8.0 proc mixed (p<0,05) and data of cells counting and hepatocyte morfometry to the same test, using SAS 8.0 GLM (p<0,01). The initial weights and lengths were similar, the food consumption was not modified by the addition of the extract and all the fish grew significantly during the experiment. Initial levels of cortisol and glucose were also similar between groups and did not modify by the stressor agent or treatments with the extract. However, a significant increase of glucose and reduction of cortisol levels were observed for all the fish. The addition of different extract doses provoked significant and noticeable increase of the cytoplasmic area and reduction of the cells number, mainly for 100 mg/Kg dose. In the control group cytoplasmatic area was significantly minor due to lesser hepatic glycogen accumulation. The stressor agent did not affect sanguine biochemists parameters but seems to lead metabolic alterations that had collaborated with the depletion of liver glycogen supplies. This effect seems to have been reverted in the fish that received the diet contend Passion fruit extract that, by means of a mechanism not elucidated in this experiment, contributed for the maintenance or increase of hepatic glycogen supplies. It was conclude that Passion fruit extract diet inclusion at 100 mg/Kg dose protects the tilapia against the hepatic glycogen depletion caused by social stress.

A utilização de fatores hepatotróficos (FH) tem trazido importantes avanços no tratamento de algumas doenças hepáticas. A avaliação dos efeitos dessas substâncias pode ser feita com o uso de modelos in vivo, como a regeneração hepática após a hepatectomia parcial ou in vitro, como a cultura de hepatócitos, células estreladas ou outros tipos celulares do fígado. O modelo de cultura demonstra ser útil por possibilitar a análise individualizada de determinadas substâncias ou soluções diretamente nas células-alvo, facilitando o delineamento de seu mecanismo de ação. Dessa forma, o presente trabalho estudou in vitro os efeitos da administração de fatores hepatotróficos (FH) em hepatócitos isolados de fígados de ratos, avaliando seu metabolismo e proliferação celular. Trinta ratos Wistar fêmeas foram utilizados, o fígado retirado e, por digestão enzimática in situ, suas células foram dissociadas e os hepatócitos separados em gradiente de Percoll 45%; cultivados em meio DMEM/F12, tratadas com diferentes concentrações dos FH (1X, 5X e 10X) e analisadas em intervalos de 24, 48 e 72 horas. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pelo método colorimétrico MTT, a toxicidade pelo iodeto de propídeo, o potencial elétrico da membrana mitocondrial pela Rodamina 123 e a expressão da citoqueratina 8, 18 e desmina como marcadores do citoesqueleto. O metabolismo hepático foi avaliado pela depuração do verde de indocianina (VIC), pela quantificação de colágeno tipo I e pela formação de radicais lipídicos poliinsaturados peroxidados. A técnica utilizada para a obtenção de hepatócitos mostrou-se eficaz com viabilidade superior a 90%, sem apresentar toxicidade, com manutenção do potencial mitocondrial e com marcação positiva para citoqueratinas 8, 18 e desmina. A adição dos FH aumentou a proliferação dos hepatócitos nos três períodos analisados em relação ao grupo controle. Os FH não demonstraram toxicidade em cultura primária de hepatócitos em nenhuma das concentrações avaliadas ao longo de todos os períodos experimentais. A adição dos FH na concentração de 10X evitou a formação de radicais livres, protegendo os hepatócitos da lipoperoxidação. Por outro lado, a avaliação funcional das culturas primárias pelo teste VIC mostrou-se eficaz na determinação do metabolismo dos hepatócitos, como a manutenção dos níveis das transaminases e amilase. Os hepatócitos mantidos em cultura primária após a adição dos FH em todos os períodos analisados aumentaram a produção de colágeno, e também foram capazes de modificar a distribuição da população de células nas fases quiescentes, aumentando sua capacidade de síntese. A adição dos FH nas concentrações estudadas nas culturas de hepatócitos mostrou-se eficaz na manutenção dessas células, mantendo-se funcionalmente ativos, com a expressão dos marcadores de seu metabolismo e diferenciação. / The use of hepatrotophic hic factors (HF) has provided important advances in the treatment of several hepatic disorders. The evaluation of this treatment may be carried out by in vivo models, as experiments on hepatic regeneration after partial hepatectomy; or in vitro models as culture of hepatocytes, stellate cells or any other hepatic cell. This last model allows an individual analysis of the studied substances on their target cells, providing the possibility of further investigation on the mechanisms involved. Therefore, the present study evaluated the in vitro effects of the hepatotrophic factors administration on the metabolism and proliferation of cultured hepatocytes from normal rat liver. Liver from 30 Wistar rats were used, and after in situ enzimatic dissociation, hepatocytes were collected and separated by 45% Percoll density gradient, cultivated in DMEN/F12 media supplemented with different HF concentrations (1×, 5× and 10×) and finally analyzed at 24, 48 and 72hs intervals. Cell viability and proliferation were assessed by MTT colorimetric assay, cell toxicity by propidium iodide, mitochondrial membrane electrical potential by 123 rodamine test and cytokeratin 8, 18 and desmin as cytoskeleton markers. Hepatic metabolism was evaluated by infusion of indocianine green (ICG), by type I collagen quantification and by peroxided polyunsaturated lipid radicals production. The techniques used in order to collect hepatocytes proved to be efficient, with a viability higher than 90%, no toxicity, and the maintenance of the mitochondrial membrane potential and positive labeling for cytokeratins (CK) 8, 18 and desmin. The HF addition increased the proliferation of hepatocytes in the three periods analyzed, when compared to the control group. The HF did not show any toxicity in primary hepatocytes culture regardless of the concentration evaluated along the experimental periods. The HF addition impaired the production of free radicals, protecting the hepatocytes from the lipid peroxidation. On the other hand, the functional evaluation of primary hepatocytes cultures using the ICG test proved to be efficient in the determination of the hepatocytes metabolism, as the maintenance of the transaminase and amylase levels. The hepatocytes kept in primary culture after HF addition in all the analyzed periods increased the collagen production and were also able to shift the distribution of quiescent cells population of, thus increasing their synthesis capacity. The HF addition in the studied concentrations in hepatocytes cultures proved to be efficient in the maintenance of these cells, that remain functionally active and expressing their metabolism and differentiation characteristic markers.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422850-Texto+Completo-0.pdf: 2953890 bytes, checksum: a9a608f4e09d0de94b994f35e62d2827 (MD5) Previous issue date: 2010 / Introduction: There is growing evidence that stem cell transplantation may be an effective therapy to treat liver disease. With systemic delivery of stem cells, a significant proportion of cells are retained in the lung and spleen. Therefore, ultrasound-guided percutaneous portal vein puncture has been tested as an alternative method in rat models. The objective of the present study was to evaluate the feasibility of percutaneous portal vein puncture and the efficacy of intraportal transplantation of bone marrow mononuclear cells in a rat model of cirrhosis. Method: To carry out the experiment, 24 female Wistar rats with cirrhosis induced by bile duct ligation were used. Fourteen days after ligation, the animals were randomized and then shaved and sedated for the procedure with Doppler ultrasound to facilitate identification of the portal vein. The mononuclear fraction obtained from the bone marrow of male rat donors was infused with a 30-gauge needle through direct abdominal puncture using a transhepatic route running along the liver hilum. On the 28th experimental day, the rats were euthanized. Liver repopulation with stem cells was evaluated through immunohistochemical detection of y chromosomecontaining cells. The number of cells was determined using flow cytometry. Results: The results obtained with ultrasound-guided delivery of stem cells directly into the portal vein show that of 24 animals studied, seven (29. 2%) died in the first 24 h. Significant liver repopulation with donor stem cells was observed in 77. 8% of the rats studied, with an efficacy of 31. 5%. Conclusion: The performance of percutaneous portal vein puncture was simple and enabled visualization of the material inside the portal system during the procedure, although approximately one third of the animals died during the observation period. The delivery of mononuclear stem cells directly to the portal vein of rats with cirrhosis enabled the implantation, fusion and/or phagocytosis of donor cells in the liver of recipients, suggesting therapeutic potential to treat cirrhosis in humans. / Introdução: Evidências crescentes têm demonstrado que o transplante de células-tronco pode tornar-se uma terapia eficaz em hepatopatias. A injeção sistêmica de células-tronco tem demonstrado que um percentual significativo dessas células fica retido no pulmão e no baço. Assim, a punção percutânea da veia porta orientada por ultrassonografia com Doppler colorido, em ratos, para administração de células-tronco apresenta-se como uma alternativa. O objetivo deste estudo foi avaliar a exequibilidade da técnica de punção percutânea da veia porta e a eficácia do transplante intraportal de células mononucleares de medula óssea em ratos com cirrose induzida. Metodologia: Para a execução do experimento, foram selecionados 24 ratos fêmeas da raça Wistar com cirrose induzida através da ligadura do ducto biliar. Quatorze dias após a ligadura, os animais foram preparados com tricotomia abdominal, sedação e orientação do procedimento por ecografia abdominal com Doppler colorido para facilitar a localização da veia porta. A fração mononuclear obtida da medula óssea de ratos machos doadores foi infundida utilizando uma agulha de gauge 30, com punção direta pela parede abdominal por via transhepática até a veia porta, junto do hilo do fígado. No 28º dia do experimento, os ratos foram sacrificados e avaliou-se o repovoamento hepático de células-tronco através da análise imunohistoquímica das células portadoras do cromossoma Y e a quantidade de células através da citometria de fluxo. Resultados: Os resultados obtidos através da infusão de células-tronco diretamente na veia porta, orientada por ultrassonografia com Doppler colorido, evidenciaram que, dos 24 ratos estudados, sete animais (29,2%) morreram nas primeiras 24 horas. Houve um significativo repovoamento hepático com células da medula óssea do doador em 77,8% dos ratos estudados e uma eficácia de 31,5%. Conclusão: A técnica de punção percutânea da veia porta mostrou-se de fácil execução e com visualização do material no interior do sistema portal durante o procedimento, embora aproximadamente 1/3 dos animais tenham morrido no período relacionado ao procedimento. A infusão da fração mononuclear da medula óssea diretamente na veia porta de ratos cirróticos permitiu a nidação, fusão e/ou fagocitose das células do animal doador no fígado do receptor, sugerindo potencial terapêutico no tratamento da cirrose humana.

A utilização de fatores hepatotróficos (FH) tem trazido importantes avanços no tratamento de algumas doenças hepáticas. A avaliação dos efeitos dessas substâncias pode ser feita com o uso de modelos in vivo, como a regeneração hepática após a hepatectomia parcial ou in vitro, como a cultura de hepatócitos, células estreladas ou outros tipos celulares do fígado. O modelo de cultura demonstra ser útil por possibilitar a análise individualizada de determinadas substâncias ou soluções diretamente nas células-alvo, facilitando o delineamento de seu mecanismo de ação. Dessa forma, o presente trabalho estudou in vitro os efeitos da administração de fatores hepatotróficos (FH) em hepatócitos isolados de fígados de ratos, avaliando seu metabolismo e proliferação celular. Trinta ratos Wistar fêmeas foram utilizados, o fígado retirado e, por digestão enzimática in situ, suas células foram dissociadas e os hepatócitos separados em gradiente de Percoll 45%; cultivados em meio DMEM/F12, tratadas com diferentes concentrações dos FH (1X, 5X e 10X) e analisadas em intervalos de 24, 48 e 72 horas. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pelo método colorimétrico MTT, a toxicidade pelo iodeto de propídeo, o potencial elétrico da membrana mitocondrial pela Rodamina 123 e a expressão da citoqueratina 8, 18 e desmina como marcadores do citoesqueleto. O metabolismo hepático foi avaliado pela depuração do verde de indocianina (VIC), pela quantificação de colágeno tipo I e pela formação de radicais lipídicos poliinsaturados peroxidados. A técnica utilizada para a obtenção de hepatócitos mostrou-se eficaz com viabilidade superior a 90%, sem apresentar toxicidade, com manutenção do potencial mitocondrial e com marcação positiva para citoqueratinas 8, 18 e desmina. A adição dos FH aumentou a proliferação dos hepatócitos nos três períodos analisados em relação ao grupo controle. Os FH não demonstraram toxicidade em cultura primária de hepatócitos em nenhuma das concentrações avaliadas ao longo de todos os períodos experimentais. A adição dos FH na concentração de 10X evitou a formação de radicais livres, protegendo os hepatócitos da lipoperoxidação. Por outro lado, a avaliação funcional das culturas primárias pelo teste VIC mostrou-se eficaz na determinação do metabolismo dos hepatócitos, como a manutenção dos níveis das transaminases e amilase. Os hepatócitos mantidos em cultura primária após a adição dos FH em todos os períodos analisados aumentaram a produção de colágeno, e também foram capazes de modificar a distribuição da população de células nas fases quiescentes, aumentando sua capacidade de síntese. A adição dos FH nas concentrações estudadas nas culturas de hepatócitos mostrou-se eficaz na manutenção dessas células, mantendo-se funcionalmente ativos, com a expressão dos marcadores de seu metabolismo e diferenciação. / The use of hepatrotophic hic factors (HF) has provided important advances in the treatment of several hepatic disorders. The evaluation of this treatment may be carried out by in vivo models, as experiments on hepatic regeneration after partial hepatectomy; or in vitro models as culture of hepatocytes, stellate cells or any other hepatic cell. This last model allows an individual analysis of the studied substances on their target cells, providing the possibility of further investigation on the mechanisms involved. Therefore, the present study evaluated the in vitro effects of the hepatotrophic factors administration on the metabolism and proliferation of cultured hepatocytes from normal rat liver. Liver from 30 Wistar rats were used, and after in situ enzimatic dissociation, hepatocytes were collected and separated by 45% Percoll density gradient, cultivated in DMEN/F12 media supplemented with different HF concentrations (1×, 5× and 10×) and finally analyzed at 24, 48 and 72hs intervals. Cell viability and proliferation were assessed by MTT colorimetric assay, cell toxicity by propidium iodide, mitochondrial membrane electrical potential by 123 rodamine test and cytokeratin 8, 18 and desmin as cytoskeleton markers. Hepatic metabolism was evaluated by infusion of indocianine green (ICG), by type I collagen quantification and by peroxided polyunsaturated lipid radicals production. The techniques used in order to collect hepatocytes proved to be efficient, with a viability higher than 90%, no toxicity, and the maintenance of the mitochondrial membrane potential and positive labeling for cytokeratins (CK) 8, 18 and desmin. The HF addition increased the proliferation of hepatocytes in the three periods analyzed, when compared to the control group. The HF did not show any toxicity in primary hepatocytes culture regardless of the concentration evaluated along the experimental periods. The HF addition impaired the production of free radicals, protecting the hepatocytes from the lipid peroxidation. On the other hand, the functional evaluation of primary hepatocytes cultures using the ICG test proved to be efficient in the determination of the hepatocytes metabolism, as the maintenance of the transaminase and amylase levels. The hepatocytes kept in primary culture after HF addition in all the analyzed periods increased the collagen production and were also able to shift the distribution of quiescent cells population of, thus increasing their synthesis capacity. The HF addition in the studied concentrations in hepatocytes cultures proved to be efficient in the maintenance of these cells, that remain functionally active and expressing their metabolism and differentiation characteristic markers.