Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-04-08T13:43:12Z No. of bitstreams: 1 2009_ReginaMariaSantosdeAmorim.pdf: 3705074 bytes, checksum: d87a34cdba79d4f142548d2e2086dd26 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-19T06:47:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_ReginaMariaSantosdeAmorim.pdf: 3705074 bytes, checksum: d87a34cdba79d4f142548d2e2086dd26 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-19T06:47:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_ReginaMariaSantosdeAmorim.pdf: 3705074 bytes, checksum: d87a34cdba79d4f142548d2e2086dd26 (MD5) Previous issue date: 2009 / A infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) ocorre com freqüência elevada em pacientes com insuficiência renal crônica (IRC) em hemodiálise. O objetivo deste estudo foi caracterizar a variabilidade genética do HCV circulante em pacientes em hemodiálise no Brasil Central. Na primeira etapa deste estudo, os genótipos e subtipos do HCV foram identificados em pacientes em hemodiálise no Distrito Federal. Para tal as regiões 5’ UTR e NS5B do genoma viral foram amplificadas e sequenciadas. Cinqüenta e uma amostras de soro foram RNA HCV positivas para 5’ UTR e, destas, 42 (82,3%) para NS5B. Pelo seqüenciamento da região 5’ UTR, os genótipos 1 e 3 foram encontrados, sendo o subtipo 1a o mais prevalente (82,3%), seguido dos subtipos 1b (5,9%), 1a/1b (2,0%) e 3a (9,8%). O subtipo 1a também foi o mais freqüente (90,5%) para a região NS5B, seguido do subtipo 3a (9,5%). A concordância da genotipagem para as duas regiões foi de 100% para os genótipos, e de 92,5% para os subtipos. Na segunda etapa deste trabalho, foi comparada a variabilidade genética da região hipervariável (HVR1) do HCV em um grupo de pacientes em hemodiálise anti-HCV negativos, RNA HCV positivos (grupo IRC) e em um grupo de pacientes com hepatite C crônica anti-HCV e RNA HCV positivos, sem tratamento (controle). Para isso, 10 amostras de cada grupo foram amplificadas para a região HVR1, clonadas e seqüenciadas. O grupo controle apresentou uma maior freqüência de sítios variáveis em HVR1 (83,9% x 59,3%, p<0,05), bem como uma maior diversidade entre as amostras e entre as quasispecies (intra-paciente), comparadas ao grupo IRC. Além disso, foi verificada uma maior variabilidade dos aminoácidos nas posições 1(384), 3(386), 8(391), 11(394), 14(397), 15(398), 17(400), 22(405) e 27(410) no grupo controle, em relação ao grupo IRC, que mostrou maior variabilidade somente na posição 5(388) (p<0,05). Por outro lado, não houve diferença estatisticamente significante entre a razão das taxa de substituições não sinônimas e sinônimas dos grupos IRC e controle, sugerindo uma pressão seletiva similar pelo sistema imune sobre as populações virais nestes grupos. O perfil hidropático dos aminoácidos de HVR1 do HCV nos dois grupos analisados revelou-se similar, e as variações nas cargas foram limitadas a sítios específicos. Concluindo, estes dados mostram uma menor variabilidade genética na HVR1 do HCV em pacientes em hemodiálise anti- HCV negativos e RNA positivos (grupo IRC), quando comparados aos indivíduos do grupo controle, que pode estar associada à imunossupressão. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Hepatitis C virus (HCV) infection occurs with high frequency in chronic renal failure (IRC) patients on hemodialysis. The aim of this study was to characterize the genetic variability of circulating HCV in hemodialysis patients in Central Brazil. In the first part of this study, HCV genotypes and subtypes were determined in hemodialysis patients in the Federal District. For this, 5' UTR and NS5B regions of viral genome were amplified and sequenced. Fifty-one serum samples were HCV RNA positive for 5 'UTR, and of these, 42 (82,3%) for NS5B. By the sequencing of the 5’ UTR region, genotype 1 and 3 were found, being subtype 1a the most prevalent (82,3%), followed by subtypes 1b (5,9%), 1a/1b (2,0%) and 3a (9,8%). The subtype 1a was also the most frequent (90,5%) for the NS5B region, followed by subtype 3a (9,5%). The concordance of genotyping for the two regions was of 100% for the genotypes, and of 92,5% for the subtypes. In the second part of this study, the genetic variability within hypervariable region 1 (HVR1) of the HCV was compared in a group of hemodialysis patients who were anti-HCV negative and HCV RNA positive (group IRC) and a group of untreated patients with HCV chronic infection who were anti-HCV and HCV RNA positive (control). For this, 10 samples from each group were amplified for the HVR1 region, cloned and sequenced. The control group had a higher frequency of variable sites in HVR1 (83,9% x 59,3%, p<0,05) as well as a greater diversity within (intra - patient) and among the samples, compared to the IRC group. Moreover, it was observed a greater variability of amino acids in positions 1 (384), 3 (386), 8 (391), 11 (394), 14 (397), 15 (398), 17 (400), 22 (405) and 27 (410) in the control group, than in the IRC group, which showed a greater variability only in position 5 (388) (p <0,05). On the other hand, there was no statistically significant difference between the ratio of the rates of non-synonymous and synonymous substitutions of the IRC and control groups, suggesting a similar selective pressure by the immune system on viral populations in the groups. The hydropathic profile of the amino acids in the HVR1 of HCV in the two analyzed groups revealed to be similar, and variations in charges were limited to specific sites. In conclusion, these data show a lower genetic variability within the hypervariable region 1 (HVR1) of HCV in the hemodialysis patients who were anti-HCV negative and HCV RNA positive (group IRC), when compared with individuals in the control group, which may be associated to their immunosuppression.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-30Bitstream added on 2015-04-09T12:47:20Z : No. of bitstreams: 1 000808994_20150530.pdf: 370146 bytes, checksum: b57ece1272febc6027177478678bf29b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:28Z: 000808994_20150530.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:00Z : No. of bitstreams: 1 000808994.pdf: 1388656 bytes, checksum: ff666b142c12af73f1f96183ae305879 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora novos medicamentos de ação direta anti-HCV tenham sido recentemente aprovados no mercado, com exceção do genótipo 1, a terapia mais utilizada ainda é baseada em Interferon (IFN) e Ribavirina. Desta forma, o genótipo 3 é o que apresenta mais baixa taxa de sucesso no tratamento, no atual cenário. Um dos fatores determinantes do insucesso deste tratamento no paciente é a variabilidade viral. O HCV apresenta alta taxa de mutação durante a replicação, implicando na produção de variantes intra-hospedeiro, denominadas quasispecies. A região hipervariável 1 (HVR1) da proteína do envelope é uma região de alta variabilidade do genoma viral. A detecção das quasispecies minoritárias pode ser realizada de forma confiável e eficiente por pirossequenciamento de alta cobertura (UPDS), técnica capaz de detectar variantes presentes em frequência <1% na população. Com base neste contexto, foram determinados quasispecies da HVR1-HCV de 14 pacientes infectados com o genótipo 3 do vírus, utilizando a técnica de UPDS. No total, 64.400 sequencias da HVR1 foram obtidas de amostras pré-tratamento. Destas, 27.398 sequências de alta qualidade foram filtradas e corrigidas. Valores de distância genética e entropia de Shannon não foram correlacionados a resposta ao tratamento. Estas sequências foram posteriormente submetidas a construção de redes median-joining e análise Bayesiana de estrutura populacional (BAPS). A análise identificou amostras com diferentes estruturas, desde altamente conservadas (apenas uma população de quasispecies) até altamente estratificadas (6 subpopulações). Este resultado foi condizente com a estrutura das redes median-joining. Várias mutações ao longo da HVR1 do mesmo paciente e algumas repetiram em pacientes do mesmo grupo de resposta. Quanto a avaliação de análise das sequências de aminoácidos, embora haja grande variação quanto a sequência e propriedades físico-químicas, pode-se ... / Hepatitis C is a major public health problem. New HCV antiviral drugs were released on market on 2010; however, excluding for genotype 1, the most used therapy used currently is still based on Interferon (IFN) and Ribavirin. Nowadays, genotype 3 is the one with the highest rate of treatment failure. Viral genome variability is one of the factors that lead in therapy failure. HCV presents a high mutability during replication course, implicating in arising of intra-host variants called quasispecies. The hypervariable region 1 (HVR1) from envelope protein presents as quasispecies and may be related to IFN therapy resistance. Resistant quasispecies may not represent majority of variants population in the host, therefore, in these cases traditional sequencing techniques are unable to detect. For detection of minority quasispecies, ultra-deep pyrosequencing (UPDS) is a reliable and efficient tool, being able to detect even variants with frequency <1% in the population. Regarding this issue, we determined HVR1 quasispecies from 14 patients infected with HCV genotype 3 using the UPDS approach. In total, 64,400 HVR1 sequences were obtained from pre-therapy sample. From these sequences, 27,398 ones with high quality were filtered. Genetic distance and Shannon entropy values were not related to therapy outcome. These sequences were analyzed using median-joining networks and Bayesian population structural analysis. These analysis identified samples with different structures, from high conserved (one sub-population) to high stratified ones (6 sub-populations). Networks analysis also confirmed this result. Mutations exclusive for a type of response of therapy were identified along HVR1. Amino acid sequences indicated that this region presents conserved structure, even if sequence and physical and chemicals properties seem flexible. Especially in turns and coils positions, this conservation seems notable. Potential epitopes positions are concentrated ...

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Yury Khudyakov / Banca: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Mello Membro / Banca: Camila Malta Romano / Banca: Paola Jocelan Scarin Provazzi Trabulsi / Banca: Cintia Bittar / Resumo: Embora novos medicamentos de ação direta anti-HCV tenham sido recentemente aprovados no mercado, com exceção do genótipo 1, a terapia mais utilizada ainda é baseada em Interferon (IFN) e Ribavirina. Desta forma, o genótipo 3 é o que apresenta mais baixa taxa de sucesso no tratamento, no atual cenário. Um dos fatores determinantes do insucesso deste tratamento no paciente é a variabilidade viral. O HCV apresenta alta taxa de mutação durante a replicação, implicando na produção de variantes intra-hospedeiro, denominadas quasispecies. A região hipervariável 1 (HVR1) da proteína do envelope é uma região de alta variabilidade do genoma viral. A detecção das quasispecies minoritárias pode ser realizada de forma confiável e eficiente por pirossequenciamento de alta cobertura (UPDS), técnica capaz de detectar variantes presentes em frequência <1% na população. Com base neste contexto, foram determinados quasispecies da HVR1-HCV de 14 pacientes infectados com o genótipo 3 do vírus, utilizando a técnica de UPDS. No total, 64.400 sequencias da HVR1 foram obtidas de amostras pré-tratamento. Destas, 27.398 sequências de alta qualidade foram filtradas e corrigidas. Valores de distância genética e entropia de Shannon não foram correlacionados a resposta ao tratamento. Estas sequências foram posteriormente submetidas a construção de redes median-joining e análise Bayesiana de estrutura populacional (BAPS). A análise identificou amostras com diferentes estruturas, desde altamente conservadas (apenas uma população de quasispecies) até altamente estratificadas (6 subpopulações). Este resultado foi condizente com a estrutura das redes median-joining. Várias mutações ao longo da HVR1 do mesmo paciente e algumas repetiram em pacientes do mesmo grupo de resposta. Quanto a avaliação de análise das sequências de aminoácidos, embora haja grande variação quanto a sequência e propriedades físico-químicas, pode-se ... / Abstract: Hepatitis C is a major public health problem. New HCV antiviral drugs were released on market on 2010; however, excluding for genotype 1, the most used therapy used currently is still based on Interferon (IFN) and Ribavirin. Nowadays, genotype 3 is the one with the highest rate of treatment failure. Viral genome variability is one of the factors that lead in therapy failure. HCV presents a high mutability during replication course, implicating in arising of intra-host variants called quasispecies. The hypervariable region 1 (HVR1) from envelope protein presents as quasispecies and may be related to IFN therapy resistance. Resistant quasispecies may not represent majority of variants population in the host, therefore, in these cases traditional sequencing techniques are unable to detect. For detection of minority quasispecies, ultra-deep pyrosequencing (UPDS) is a reliable and efficient tool, being able to detect even variants with frequency <1% in the population. Regarding this issue, we determined HVR1 quasispecies from 14 patients infected with HCV genotype 3 using the UPDS approach. In total, 64,400 HVR1 sequences were obtained from pre-therapy sample. From these sequences, 27,398 ones with high quality were filtered. Genetic distance and Shannon entropy values were not related to therapy outcome. These sequences were analyzed using median-joining networks and Bayesian population structural analysis. These analysis identified samples with different structures, from high conserved (one sub-population) to high stratified ones (6 sub-populations). Networks analysis also confirmed this result. Mutations exclusive for a type of response of therapy were identified along HVR1. Amino acid sequences indicated that this region presents conserved structure, even if sequence and physical and chemicals properties seem flexible. Especially in turns and coils positions, this conservation seems notable. Potential epitopes positions are concentrated ... / Doutor

Orientador: Paula Rahal / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Nelson José Freitas da Silveira / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: José Osmar Gaspar / Resumo: A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / Abstract: The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-15Bitstream added on 2014-06-13T21:03:48Z : No. of bitstreams: 1 provazzi_pjs_dr_sjrp.pdf: 1081709 bytes, checksum: 9a35b9ad50fc4eed266a481d830f02de (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A proteína NS3 apresenta dois domínios e é bifuncional. Apresenta três funções enzimáticas que são; 1) atividade de protease; 2) NTPase e 3) helicase. A função protease relaciona-se a tradução da proteína precursora e as funções NTPase e helicase tem grande participação na replicação do material genético viral. Trata-se de uma molécula essencial para o processamento da poliproteína precursora e também para a replicação viral e portanto, um dos principais alvos para o desenvolvimento de drogas antivirais. No domínio Protease foram evidenciadas substituições na tríade catalítica e na região de ligação ao íon zinco nos pacientes avaliados. Estas substituições, quando somadas podem explicar a resposta ao tratamento. Também foram visualizadas alterações na porção Helicase da NS3. As substituições ocorreram nos sítios de ligação ao ATP e ao RNA. Outros resíduos da Helicase relevantes para o desenvolvimento de inibidores, como R2133 e F258 e F264 não apresentaram substituições, evidenciando tratarem-se de aminoácidos conservados nessa região. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem informações sobre o perfil genético do vírus HCV do genótipo 3 especificamente da região codificadora da proteína NS3, permitindo o conhecimento do genoma viral e a identificação de regiões para ligação de possíveis inibidores. Este projeto certifica que a modelagem é uma ferramenta útil para a biologia estrutural e funcional, e que os modelos obtidos aqui contribuem para o desenho de novas drogas anti-virais específicas para o genótipo 3 do vírus HCV / The NS3 protein has two domains and is bifuntional. It presents three functions: 1) protease activity, 2) NTPase and 3) helicase. The protease function is related to the translation of the poliprotein precursor and functions NTPase and helicase has great participation in the replication of the viral genetic material. So. The NS3 is considered the major target for the development of antiviral drugs. In the Protease portion substitutions were evidenced in catalytic triad and the zinc ion binding sites, in the patients evaluated. These substitutions, when added up can explain the response to treatment. Also were observed changes in Helicase portion of NS3. The substitutions took place on ATP and RNA binding sites. Other residues of Helicase relevant to the development of inhibitors, as R2133 and F258 and F264, showed no substitutions, highlighting the great conservation of amino acids in this region. The results obtained in this work provide information on the genetic profile of the HCV virus genotype 3, specifically the region of NS3 protein, allowing the knowledge of the viral genome and the identification of regions for possible connection of inhibitors. This project certifies that the modeling is a useful tool for structural biology and functional, and that the models obtained here contribute to the design of new anti-viral drugs specific to the genotype 3 of HCV virus