CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / A regiÃo AmazÃnica à uma das principais Ãreas endÃmicas da hepatite D no Mundo e a Ãnica relacionada com a presenÃa do genÃtipo 3 do vÃrus delta. O objetivo deste estudo foi analisar os resultados do transplante de fÃgado pela cirrose causada pela hepatite D e correlacionar com os transplantados pela monoinfecÃÃo do vÃrus da hepatite B. Foram avaliados 29 pacientes com hepatite D e 40 pacientes com hepatite B, transplantados de fÃgado no Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio da Universidade Federal do Cearà (HUWC/UFC). O grupo de pacientes com hepatite D foi mais jovem (mÃdia 33.9 vs 52.9 anos, p < 0,001), predominante do sexo masculino e todos oriundos da RegiÃo AmazÃnica Brasileira. NÃo houve diferenÃas nos valores dos critÃrios de gravidade, MELD e Child, entre os grupos. A ocorrÃncia de carcinoma hepatocelular (CHC) foi predominante no grupo de pacientes com hepatite B ( frequÃncia 36.8% vs 17.2%, p = 0,05), assim como maior mortalidade ( frequÃncia 25% vs 3.4%, p = 0,019 ). Pacientes com hepatite D, apresentaram mais acentuada plaquetopenia no prÃ-transplante (mÃdia 66.428,57 vs 102.037,50 ÂL, p = 0,02) e no pÃs-operatÃrio imediato (mÃdia 54.242,86 vs 94.063,89 ÂL, p = 0,04). A recuperaÃÃo da lesÃo hepÃtica, avaliada atravÃs dos valores de AST, ALT e BT, mensurados 3 meses apÃs o transplante, nÃo mostrou diferenÃa entre os grupos. A sobrevida analisada pela curva de Kaplan-Meier, no perÃodo de 4 anos, foi de 95% nos pacientes com hepatite D e 75% nos pacientes com a monoinfecÃÃo pelo vÃrus B. Conclui-se que os pacientes com hepatite D possuem excelentes resultados apÃs o transplante hepÃtico e menor incidÃncia para o desenvolvimento do CHC. / The Amazon region is one of the main endemic areas of hepatitis D in the World and the only related to the presence of genotype 3 of delta virus. The objective of this study was to analyze the results of liver transplantation for cirrhosis caused by hepatitis D and correlate with the transplant by monoinfection of hepatitis B. 29 patients were evaluated with hepatitis D and 40 patients with hepatitis B, they were submitted a liver transplantation in the Walter Cantidio University Hospital of the Federal University of Ceara. The group of patients with hepatitis D were younger (mean 33.9 vs 52.9 years, p < 0,001), predominantly male and all from the Brazilian Amazon region. There were no differences in the values of severity criteria, MELD and Child, between groups. The occurrence of hepatocellular carcinoma (HCC) was predominant in patients with hepatitis B (frequency 36.8% vs. 17.2%, p = 0,05), likewise higher mortality (frequency 25% vs 3.4%, p = 0,019). Patients with hepatitis D showed more pronounced thrombocytopenia in pre-transplant (mean 66.428,57 vs 102.037,50 ÂL, p = 0,02) and in the immediate postoperative period (mean 54.242,86 vs 94.063,89 ÂL, p = 0,04). The recovery of liver injury as measured by the values of AST, ALT, and BT, measured 3 months after transplantation showed no difference between groups. The survival analyzed by Kaplan-Meier survival curves, showed a period of four years, the result of 95% in patients with hepatitis D and 75% in patients with monoinfection of hepatitis B. Patients with hepatitis D have excellent results after liver transplantation and lower incidence of HCC development.

Enveloped viruses acquire their membrane coat from the plasma membrane or intracellular organelles and rely on cellular machinery to facilitate envelopment and egress of virus progeny. This thesis examines egress-related interactions between host cell factors and proteins of two different enveloped viruses: hepatitis D virus (HDV) and herpes simplex virus 1 (HSV-1). HDV is a small RNA virus causing fulminant hepatitis or severely aggravating cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HSV-1 is a large DNA virus infecting epithelial and neuronal cells. Infection with HSV-1 not only triggers the development of recurring sores on oral or genital mucosa, but can also cause severe disease in neonates and immunocompromised patients. The interaction between the large antigen of HDV (HDAg-L) and the N-terminal domain (NTD) of clathrin, a protein crucial for endocytosis and intracellular vesicular trafficking, was examined by structural, biochemical and biophysical techniques. Co-crystal structures of NTD bound to HDAg-L peptides derived from different HDV genotypes revealed that HDV interacts with multiple binding sites on NTD promiscuously, prompting re-evaluation of the binding between cellular peptides and NTD. Surprisingly, co-crystal structures and pull-down capture assays showed that cellular peptides containing clathrin-binding motifs can also bind multiple sites on the surface of NTD simultaneously. In addition, the structures of viral and cellular peptides bound to NTD enabled the molecular characterization of the fourth peptide binding site on NTD, the “Royle box”, and led to the identification of a novel binding mode at the “arrestin box” peptide binding site on NTD. The work in this thesis therefore not only identifies the molecular basis of HDV:clathrin interactions, but also furthers our understanding of basic clathrin biology. Even though many HSV-1 proteins have been implicated in the envelopment and egress of viral particles, only few interactions between HSV-1 and cellular proteins promoting these processes have been described. Therefore, the HSV-1 proteins gE, UL21 and UL56 were selected and characterized bioinformatically and/or biochemically. Cellular proteins interacting with UL56 were identified by yeast two-hybrid screening and quantitative mass spectrometry. Co-immunoprecipitation and pull-down experiments confirmed the Golgi-trafficking protein GOPC, components of the mammalian trafficking protein particle complex, and the ubiquitin ligase NEDD4 as novel binding partners of UL56, thereby suggesting exciting new avenues for the investigation of cellular mechanisms contributing to HSV-1 envelopment and egress.

Hintergrund: Von circa 240-260 Millionen Hepatitis-B-Virus-(HBV)-Infizierten sind schätzungsweise circa 15-20 Millionen Menschen mit dem Hepatitis-D-Virus (HDV) koinfiziert. Das HDV benötigt für seine Replikation zwingend das Oberflächenprotein des HBV (HBsAg) und ist damit als sogenannter Satellitenvirus ohne HBV nicht überlebensfähig. Als mögliche Therapieoptionen steht derzeit das Interferon-alpha (IFNα) zur Verfügung. Zum Therapiemonitoring werden HBV-spezifische Marker (HBsAg, anti-HBs, anit-HBe, anti-HBc-IgM, HBV-DNA), HDV-spezifische Marker (HDV-RNA, anti-HDAg) als auch Marker für die Leberfunktion (ALT, AST, AP, gGT, Bilirubin, Quick) bestimmt. Jedoch fehlen aktuell für die HDV-Infektion noch aussagekräftige Marker, um frühzeitig einen Therapieerfolg bzw. –misserfolg abzuschätzen und darauf reagieren zu können. Fragestellung: In dieser Studie wurden erstmalig aktuelle experimentelle Marker der HBV-Replikation hinsichtlich einer Assoziation mit dem Therapieverlauf bei HBV/HDV-Infektion untersucht: die HBVfl-RNA mittels RT-qPCR und die Komposition des HBsAg (SHBs, MHBs und LHBs) mittels Sandwich-ELISA. Methodik: Es konnten insgesamt 50 Patienten aus Deutschland, Italien und Spanien mit nachgewiesener HBV/HDV-Koinfektion rekrutiert werden. Diese wurden nach der Therapieform, die der Patient erhalten hat, in eine Gruppe unter IFN-Therapie, eine Gruppe unter NA-Therapie und eine therapienaive Kontrollgruppe unterteilt. Desweiteren wurden die Gruppen an Hand des Verlaufes der HDV-RNA in Responder, partielle Responder und Non-Responder eingeteilt. Desweiteren wurden Patienten nach HBsAg-Verlust analysiert, welcher als funktionelle Ausheilung der HBV-Infektion und somit auch der HBV/HDV-Koinfektion angesehen wird. Es erfolgte eine retrospektive Beurteilung der neuen HBV-Serummarker im Vergleich zu etablierten Serummarkern im Verlauf der IFN- bzw. NA-Therapie, wenn möglich bis sechs Monate nach Therapieende. Die therapienaiven Patienten wurden an Hand der zur Verfügung stehenden Proben ebenfalls in ihrem Verlauf beurteilt. Resultate: Die Komposition des HBsAg zeigte in der Gruppe der Responder unter IFN-Therapie nach ausführlicher Betrachtung der Einzelverläufe einen Verlust des MHBs, welcher zum Teil deutlich vor dem Verlust des Gesamt-HBsAg lag. Dies konnte auch bei Respondern unter NA-Therapie beobachtet werden, fehlte jedoch bei den therapienaiven Patienten. Insbesondere bei Patienten, die nicht nur eine Suppression der HDV-RNA sondern auch einen HBsAg-Verlust erreichten, kam es zu einer frühzeitigen Suppression von LHBs und MHBs unter die Nachweisgrenze. In der untersuchten Kohorte stellten sich außerdem die ALT-Spiegel bei den Respondern mit IFN-Therapie mit einem signifikanten Abfall zu mehreren Zeitpunkten im Verlauf dar, der bei den anderen Gruppen fehlte. Die HBVfl-RNA erwies sich nicht als geeignet zum Therapiemonitoring, da sie in fast allen gemessenen Serumproben negativ war. Dies könnte an der Suppression der HBV-Replikation durch das HDV liegen, weshalb auch die HBV-DNA bei Patienten mit einer HBV/HDV-Koinfektion oft nicht nachweisbar ist. Schlussfolgerung: MHBs könnte ein neuer Serummarker für einen HBsAg-Verlust sowie für ein Therapieansprechens auf eine IFN-Therapie bei HBV/HDV-Koinfizierten darstellen und somit zur Personalisierung und zur Steigerung der Effektivität der Therapie bei Patienten mit HBV/HDV-Koinfektion beitragen. Zur Bestätigung dieser Ergebnisse sind daher weiterführende Untersuchungen in größeren Patientenkollektiven notwendig.:I Inhaltsverzeichnis II Abkürzungsverzeichnis III Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis 1. Einführung 1.1. HBV/HDV 1.1.1. Epidemiologie und Genotypen 1.1.2. Aufbau 1.1.3. Replikation 1.1.4. Infektionsverlauf 1.1.5. Etablierte Diagnostik/ Biomarker 1.1.6. Neue potentielle HBV/HDV-Biomarker 1.1.7. Therapie 1.1.8. Prävention 2. Aufgabenstellung 3. Materialien und Methoden 3.1. Materialien 3.1.1. Kits 3.1.2. Chemikalien 3.1.3. Reagenzien zur Bestimmung des Gesamt-HBsAg, LHBs, MHBs 3.1.4. Geräte 3.1.5. Labormaterialien 3.1.6. Primer, Standardplasmid, In-vitro-Transkript und Sonden 3.1.7. Datenanalyse 3.2. Methoden und Datenanalyse 3.2.1. Nukleinsäure-Isolierung 3.2.2. Quantifizierung der HBVfl-RNA mittels RT-qPCR 3.2.3. Quantifizierung des Vox-Referenzplasmids 3.2.4. Datenanalyse RT-qPCR 3.2.5. Prinzip der Quantifizierung der HBsAg-Komposition mittels nicht-kompetetivem Sandwich-ELISA 3.2.6. Durchführung der Quantifizierung der HBsAg-Komposition 3.2.7. Testauswertung 3.2.8. Untersuchte Patientenkohorte 3.2.9. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Untersuchungskohorte zu Studienbeginn 4.2. Evaluierung der untersuchten Biomarker während einer IFN-Therapie 4.2.1. Statistische Auswertung der analysierten Parameter unter IFN-Therapie 4.2.1.1. HDV-RNA als Grundlage der Kohorteneinteilung 4.2.1.2. Analyse der Blutbildparameter im Verlauf der IFN-Therapie 4.2.1.3. Analyse der Leber- und Nierenparameter im Verlauf der IFN-Therapie 4.2.1.4. Analyse der Transaminasen und Cholestaseparameter im Verlauf der IFN-Therapie…………… 4.2.1.5. Analyse der HBV-DNA und der HBVfl-RNA unter IFN-Therapie 4.2.1.6. Analyse des Gesamt-HBsAg, LHBs und MHBs unter IFN-Therapie 4.3. Einzelverlaufdarstellung ausgewählter Patienten unter IFN-Therapie 4.3.1. Exemplarischer Einzelverlauf eines Patienten mit partiellem Therapieansprechen auf IFN im ersten Therapiezyklus 4.3.2. Exemplarischer Einzelverlauf eines Patienten mit Therapieansprechen auf IFN 4.3.3. Exemplarischer Einzelverlauf eines zweiten Patienten mit Therapieansprechen auf IFN……….. 4.3.4. Exemplarischer Einzelverlauf eines dritten Patienten mit Therapieansprechen auf IFN…….. 4.4. Evaluierung der untersuchten Biomarker während einer NA-Therapie 4.4.1. Statistische Auswertung der analysierten Parameter unter NA-Therapie 4.5. Zusammenfassende Darstellung der Patienten mit HBsAg-Verlust unter IFN- bzw. NA-Therapie 4.6. Evaluierung der untersuchten Biomarker im therapienaiven Verlauf 4.6.1. Statistische Auswertung der analysierten Parameter der therapienaiven Patienten 5. Diskussion 5.1. Untersuchungskohorte 5.2. Methoden 5.2.1. RT-qPCR der HBVfl-RNA 5.2.2. Nicht-kompetetiver Sandwich-ELISA des Gesamt-HBsAg, MHBs und LHBs 5.3. Ergebnisse der Biomarkeranalyse 5.3.1. MHBs bzw. LHBs als mögliche neue Serummarker eines Therapieansprechens unter IFN- und NA-Therapie bei HBV/HDV-Koinfizierten 5.3.2. Gesamt-HBsAg als möglicher Marker eines Therapieansprechens unter IFN- und NA-Therapie bei HBV/HDV-Koinfizierten 5.3.3. HBVfl-RNA und HBV-DNA zum Therapiemonitoring bei HBV/HDV-Koinfizierten ungeeignet 5.3.4. ALT bzw. AST als möglicher Prädiktor einer Response auf eine IFN-Therapie bei HBV/HDV-Koinfizierten 5.3.5. Hämoglobin mit fraglicher Relevanz für das Therapiemonitoring bei HBV/HDV-Koinfizierten 5.4. Ergebnisse jenseits der Biomarkeranalyse 5.4.1. Wiederholte IFN-Therapie bei HBV/HDV-Koinfizierten potentiell sinnvoll 6. Zusammenfassung der Arbeit 7. Literaturverzeichnis 8. Anlagen 9. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 10. Lebenslauf 11. Danksagung

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Myuki Alfaia Esashika Crispim.pdf: 2246402 bytes, checksum: d9773c605258310c1244020f1e5cb467 (MD5) Previous issue date: 2007-09-20 / Hepatitis B and D are endemic in the Western Brazilian Amazon region , but few studies have been conducted to investigate the genetic variability of both viruses. The hepatitis B virus (HBV) has a high genetic variability, with eight different genotypes defined (A-H). In present classification hepatitis D virus (HDV) is also supposed to present eight different genotypes (I-VIII). The aim of this study was to describe the genotypes of the virus B and D of the Western Brazilian Amazon region. We selected 190 samples of chronic carriers with HBV and 50 of them presented double infection with HDV. The serum samples of HBV were submitted to the genotyping through Polymerase Chain Reaction (PCR), with type-specific primers . In the reactive samples for HDV RNA by RT-PCR was used the genotyping by Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP). The genotype A of HBV was detected as the most frequent, in 91 participants (56,5%), following by genotype F, in 41 (25,5%), and genotype D, in 29 (18,0%). In the HDV genotyping, we found only the genotype III. This study showed that the genotypes A, D and F of VHB and the genotype III of HDV represented the predominant genotypes in the Western Brazilian Amazon. / As hepatites B e D são endêmicas na Amazônia Ocidental Brasileira, mas poucos estudos têm buscado investigar a variabilidade genética de ambos os vírus. O vírus da Hepatite B (VHB) tem uma alta variabilidade genética, sendo definidos oito genótipos distintos (A-H). O vírus da hepatite D (VHD), na atual classificação, também é sugerido apresentar oito genótipos (I-VIII). O presente estudo teve o objetivo de descrever os genótipos do vírus B e D na Amazônia Ocidental Brasileira. Selecionamos 190 amostras de portadores crônicos do vírus da hepatite B, sendo que, destas, 50 apresentavam infecção dupla com o VHD. As amostras de soro do VHB foram submetidas a genotipagem por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com iniciadores tipo específicos. Em amostras reativas para o VHD RNA por RT-PCR foi realizada a genotipagem por Análise do Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos de Restrição (RFLP). Foi detectado o genótipo A como o mais freqüente em 91 participantes (56,5%), seguido pelo F em 41(25,5%), e o D em 29 (18,0%). Na genotipagem para o VHD encontramos somente o genótipo III. Este estudo mostrou que os genótipos A, D e F do VHB e o genótipo III do VHD, representam os genótipos predominantes na Amazônia Ocidental Brasileira.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00273.pdf: 185690 bytes, checksum: 37d322315cf1719837773ccc6521625a (MD5) / Embora não muito comum, o curso clínico da co-infecção do vírus da hepatite B (VHB) e do vírus da hepatite delta (VHD) geralmente é pior. Um prognóstico ainda pior pode ser esperado em pacientes co-infectados HBV-HDV e com infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Entretanto, existem poucos dados na literatura sobre o tema, especialmente na era HAART. Nesse estudo, um total de 26 pacientes com co-infecção HBV-HDV, 16 HIV-positivos e 10 HIV-negativos, foram retrospectivamente analisados. Parâmetros hepáticos e virológicos de laboratório na última visita (ALT, HBV-DNA e HDVRNA) foram comparados entre os grupos. É importante ressaltar que todos pacientes infectados pelo HIV haviam recebido, sempre no contexto do HAART, medicamentos orais com atividade anti-VHB por um período prolongado de tempo. Contudo, esse foi o caso de somente dois indivíduos HIV-negativos. A proporção de pacientes com fibrose hepática avançada foi comparável nos dois grupos (40% em ambos) assim como, a taxa de mortalidade. Nós fazemos a hipótese de que a terapia anti-VHB por tempo prolongado no contexto do HAART, poderia beneficiar o prognóstico hepático dos pacientes infectados pelos vírus HIV-HBV-HDV. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

La surinfection par HDV/ HBV est la forme la plus grave d'hépatite virale chronique et affecte entre 15-20 millions de patients au niveau mondial. HDV n'est pas susceptible aux traitements anti-HBV et le taux de réponse à l'IFNα est <25%. Malgré une progression plus rapide de la maladie hépatique, la majorité des patients présente une suppression de la réplication du HBV. Les détails des interactions entre HDV, HBV et le système immunitaire inné des cellules infectées restent inconnus. Les objectifs de ces travaux de thèse ont été: i) l'étude de l'infection par HDV et son interaction avec la réponse innée cellulaire; ii) l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-HDV; iii) l'exploration de l'interaction entre HDV et HBV. L'approche expérimentale a été basée sur l'infection de cellules dHepaRG, capables d´entretenir des cycles réplicatifs complets de HBV et HDV et ayant une réponse immunitaire innée physiologique. Nous avons observé que: i) l'infection par HDV est associée à un réplication forte dans un nombre limité de cellules, et à une induction de l'expression des ISGs; ii) le traitement des cellules infectées par HDV avec de l'IFNα ne conduit pas à une induction accrue des ISGs et a une faible activité antivirale. Quelques agonistes de PRR, notamment activant la voie NF-kB, induisent une forte diminution de la réplication de HDV; iii) malgré le faible nombre de cellules infectées, HDV et ses protéines induisent une diminution de la réplication de HBV. Ces travaux ouvrent des perspectives importantes concernant la caractérisation de la pathogénèse de l'hépatite delta et l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques immuno modulatrices / HDV/HBV superinfection is the most aggressive form of chronic viral hepatitis and is estimated to affect 15-20 million patients worldwide. HDV is not susceptible to available direct anti-HBV drugs and sustained response to IFNα therapy occurs in less than 1/4 of patients. Despite the faster progression of liver disease, most HDV/ HBV infected patients present a suppression of HBV replication. The details of the interactions between HDV, HBV and the host cell innate immune response remain largely unexplored and research efforts have been limited by the lack of infection models. The aims of this thesis work were: i) to study HDV infection and the interplay with the host innate immune response; ii) to identify novel therapeutic strategies for the inhibition of HDV; iii) to further explore HDV/ HBV interference. The experimental strategy was based on infection of dHepaRG cells, which are known to be permissive to both HBV and HDV full replicative cycles and to present physiological innate immune responses. We observed that: i) HDV infection is associated with a strong, yet transient replication, a potent induction of the expression of ISGs; ii) IFN-α treatment of HDVinfected cells does not induce a further increase of ISG expression and has a modest antiviral activity. Conversely, some PRR agonists, in particular those inducing the NFkB pathway, induce a strong decline in HDV replication; iii) despite the low number of coinfected cells, HDV as well as its encoded proteins exert a repressive effect on HBV replication. Our work opens an array of perspectives on the pathogenesis of hepatitis delta and the identification of novel immune modulatory therapeutic strategies