Abstract Cancer treatments have remarkably improved over the past years since targeted therapies and immunotherapy have been introduced to the field of oncology. The benefit of these new therapies is often limited, however, by de novo or acquired therapy resistances, which should be noticed when making clinical decisions. In this current work, we studied the prognostic and predictive values of several immunological markers in metastatic HER2-positive breast cancer treated with trastuzumab, because trastuzumab is still given to patients according to the HER2 status only, without certainty of tumor response. We also determined the role of HER2 and HER3 for cancer stem cells (CSC) in ALK translocated non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines since the CSCs are causing therapy resistance and cancer recurrence. The results demonstrated that a high number of cytotoxic T cells, together with a high number of M1-like macrophages in the center of the tumor (CT), are promising and independent prognostic factors in HER2-positive breast cancer. These markers together also can predict the progression of the disease and the length of trastuzumab discontinuation in tumor response. Expression of HER2 and HER3 increased the stem-like properties of ALK translocated NSCLC cells, which were decreased when the expressions were downregulated. HER2-HER3-dependent CSCs also mediated the ALK therapy resistance. In conclusion, this study suggests that patients with a favorable immunological tumor profile (high number of cytotoxic T cells and M1-like macrophages in the CT) could be treated in a less-intensive manner, that trastuzumab discontinuation could be feasible for these patients, and that targeting of HER2 and HER3 receptors can lead to more effective killing of cancer stem-like cells and should be further studied. / Tiivistelmä Syöpähoidot ovat kehittyneet huomattavasti, kun kohdennetut hoidot ja immunologiset hoidot ovat tulleet perinteisten hoitojen rinnalle. Usein näiden hoitojen hyötyä kuitenkin rajoittaa jo olemassa oleva lääkeresistenssi tai sen kehittyminen, mikä tulisi ottaa huomioon hoitoja suunniteltaessa. Tässä työssä tutkittiin immunologisia merkkiaineita, joilla voitaisiin ennustaa trastutsumabi-hoidon vastetta sekä potilaiden ennustetta levinneessä HER2-positiivisessa rintasyövässä. Tällä hetkellä trastutsumabi-hoitopäätös tehdään pelkän HER2-geenimonistuman mukaan ilman varmuutta siitä, hyötyykö potilas oikeasti hoidosta. Lisäksi tutkimme HER2- ja HER3-reseptorien merkitystä syövän kantasoluille ALK-translokoituneessa ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä (NSCLC), sillä syövän kantasolut ovat yksi merkittävimmistä tekijöistä lääkeresistenssin kehittymisessä ja syövän uusiutumisessa. Työssä havaittiin, että kasvaimen keskellä oleva suuri määrä sytotoksisia T-soluja sekä M1-tyypin makrofageja on yhteydessä potilaiden parempaan ennusteeseen ja että kyseiset merkkiaineet ovat toisistaan riippumattomia. Merkkiaineet pystyivät ennustamaan myös taudin etenemistä sekä trastutsumabi-hoitokeskeytyksen pituutta. HER2- ja HER3-proteiinien tuotto lisäsi ALK-translokoituneiden NSCLC-solujen kantasolumaisia ominaisuuksia, jotka puolestaan vähenivät, kun proteiinien tuotto estettiin. Lisäksi HER2-HER3 -riippuvaiset syövän kantasolut säätelivät lääkeresistenssiä kyseisessä taudissa. Työn tulokset viittaavat siihen, että potilaita, joilla on suotuisa kasvaimen immunoprofiili (suuri määrä sytotoksisia T-soluja ja M1-tyypin makrofageja kasvaimen keskellä) pystyttäisiin hoitamaan keveimmillä hoidoilla ja HER2-hoitokeskeytys voisi olla mahdollinen näillä potilailla. Lisäksi työ korostaa HER2- ja HER3-reseptorien kohdentamista syövän kantasolumaisten solujen tehokkaamman tuhoamisen saavuttamiseksi. / Huomautus/Notice Painetussa virheelliset ISBN -tunnukset: ISBN (print) 978-952-42-2343-8 pitäisi olla 978-952-62-2343-8. ISBN (PDF) 978-952-42-2344-5 pitäisi olla 978-952-62-2344-5. Printed version has incorrect ISBNs: ISBN (print) 978-952-42-2343-8 it should be 978-952-62-2343-8. ISBN (PDF) 978-952-42-2344-5 it should be 978-952-62-2344-5.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί ένα από τα συχνότερα κακοήθη νεοπλάσματα παγκοσμίως, προκαλώντας σημαντική νοσηρότητα και θνητότητα. Η συστηματική διερεύνηση της παθογένειας συντελεί σημαντικά στην πρόληψη, έγκαιρη διάγνωση, θεραπεία και πρόγνωση της νόσου. Στην εποχή της μοριακής ιατρικής, η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών καρκινογένεσης έχει αναδείξει το ρόλο ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μονοπατιών, τα οποία ρυθμίζουν κυτταρικές διαδικασίες, όπως πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση, απόπτωση, αγγειογένεση, διήθηση. Κομβικά συστατικά τέτοιων μοριακών δικτύων αποτελούν οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, όπως ο Human Εpidermal Receptor-1 (ΗΕR-1/EGFR), ο ρόλος του οποίου έχει τεκμηριωθεί στο αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου, επιτείνοντας το ενδιαφέρον στη διευκρίνηση του ρόλου γειτονικών υποδοχέων, όπως του Human Εpidermal Receptor-3 (HER-3). O HER-3 συνιστά μεμβρανικό υποδοχέα που συμμετέχει σε μοριακά μονοπάτια ενδοκυτταρικής σηματοδότησης. Επομένως, ποσοτικές μεταβολές στην έκφρασή του αλλά και ποιοτικές αλλαγές στη δομή του, συντελούν δυνητικά στην κυτταρική εξαλλαγή. Τα δεδομένα από τη μελέτη του HER-3 στο αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου είναι περιορισμένα και ο ρόλος του στην παθογένεια, πρόγνωση και θεραπεία της νόσου παραμένει ασαφής. Αντίστοιχα με τους μεμβρανικούς υποδοχείς, πυρηνικοί υποδοχείς ενέχονται σε διαδικασίες ρύθμισης γονιδιακής έκφρασης. Οι οιστρογονικοί υποδοχείς (ER) α και β διαμεσολαβούν την επίδραση των οιστρογόνων σε κυτταρικό επίπεδο, μεταποιώντας τα επίπεδα των ορμονών σε μεταβολές γονιδιακής έκφρασης. Οι διαφορές στην επίπτωση του καρκίνου του παχέος εντέρου ανάμεσα στα δύο φύλα καθώς και πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα έχουν αναδείξει τη σημασία της έκφρασης αυτών των υποδοχέων στην καρκινογένεση του παχέος έντερου. Παράλληλα, η εξειδίκευση της οιστρογονικής δράσης σε επίπεδο ιστού και κυττάρου εξασφαλίζεται μέσω της δράσης συγκεκριμένων συμπαραγόντων (ενεργοποιητών/καταστολέων). Αυτές οι πρωτεΐνες είναι ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες, οι οποίοι συνδεόμενοι με τους οιστρογονικούς αλλά και άλλους υποδοχείς «εξατομικεύουν» την ορμονική επίδραση στο γονιδίωμα. Ο proline-, glutamic acid-, and leucine-rich protein 1 (PELP1), γνωστός και ως modulator of non-genomic activity of ER (MNAR), ο amplified in breast cancer-1 (AIB1) και ο transcriptional intermediary factor-2 (TIF2) είναι σημαντικοί συμπαράγοντες οιστρογονικών υποδοχέων, με συνέπεια η μελέτη τους να αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της διερεύνησης οιστρογονο-εξαρτώμενων μηχανισμών. Η συνεχής αλληλεπίδραση HER- και ER-εξαρτώμενων μονοπατιών έχει περιγραφεί σε ποικίλλους ιστούς. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση του ρόλου της (υπερ)έκφρασης του μεμβρανικού υποδοχέα HER-3, των οιστρογονικών υποδοχέων (ER) και των συμπαραγόντων PELP1/MNAR, AIB-1 και TIF-2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Υλικά και μέθοδοι Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ιστικά δείγματα, μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εκλεισμένα σε παραφίνη από 140 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου. Η έκφραση των επιπέδων HER-3 mRNA εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) σε 54 αδενοκαρκινώματα και 29 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Η έκφραση των επιπέδων της φωσφορυλιωμένης (pHER-3) και μη φωσφορυλιωμένης HER-3 πρωτείνης εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοιστοχημείας σε 110 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου, 24 αδενώματα και 140 αδενοκαρκινώματα. Η έκφραση των επιπέδων του οιστρογονικού υποδοχέα α και β και του PELP1/ΜΝΑR εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοιστοχημείας σε 113 αδενοκαρκινώματα, 30 αδενώματα και 88 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Αντίστοιχα η έκφραση των επιπέδων του ΑΙΒ1 και TIF-2 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοιστοχημείας σε 110 αδενοκαρκινώματα, 30 αδενώματα και 83 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Αποτελέσματα Η πρωτεΐνη HER-3 εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα επιθηλιακών κυττάρων παχέος εντέρου σε φυσιολογικό βλεννογόνο, αδενώματα και αδενοκαρκινώματα και φαίνεται να μεταβάλλεται τοπογραφικά (από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα) κατά τη διαδικασία της καρκινογένεσης. Ωστόσο, η έκφραση της πρωτεΐνης HER-3 σε αδενοκαρκινώματα δε φαίνεται να συσχετίζεται σημαντικά με τις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου. Η φωσφορυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης HER-3 (pHER-3) εκφράζεται στον πυρήνα και τη μεμβράνη επιθηλιακών και λείων μυικών κυττάρων παχέος εντέρου σε φυσιολογικό βλεννογόνο, αδενώματα και αδενοκαρκινώματα. Η πυρηνική έκφραση pHER-3 δε διαφέρει σημαντικά ανάμεσα σε φυσιολογικό βλεννογόνο, αδενώματα και αδενοκαρκινώματα. Ωστόσο, αυξημένα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης pHER-3 συσχετίζονται σημαντικά με μεγαλύτερο στάδιο της νόσου, χωρίς να συσχετίζονται με τα επίπεδα έκφρασης της μη φωσφορυλιωμένης μορφής. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου ΗER-3 δε φαίνεται να αυξάνουν σημαντικά κατά την καρκινογένεση. Ωστόσο, αυξημένα επίπεδα HER-3 mRNA στα αδενοκαρκινώματα σχετίζονται με μεγαλύτερη ηλικία των ασθενών, εντόπιση του όγκου στο αριστερό κόλον και το ορθό και με λεμφαδενική διήθηση. Επίσης, συχετίστηκαν με αυξημένη πιθανότητα υποτροπής της νόσου και μειωμένο χρονικό διάστημα ως την υποτροπή. Ο ERα εκφράζεται σπάνια στο παχύ έντερο σε αντίθεση με τον ERβ, ο οποίος εκφράζεται συχνά στον πυρήνα επιθηλιακών αλλά και στρωματικών κυττάρων. Η έκφραση της πρωτεΐνης ERβ καθίσταται πιο έντονη κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης σε άνδρες, και στα αδενοκαρκινώματα συσχετίζεται με την πιθανότητα υποτροπής της νόσου. Ο συμπαράγοντας PELP1/MNAR ανιχνεύεται στον πυρήνα επιθηλιακών αλλά και στρωματικών κυττάρων του παχέος εντέρου και η έκφρασή του αυξάνει κατά την καρκινογένεση και στα αδενοκαρκινώματα συσχετίζεται με την έκφραση του ERβ. Ωστόσο, η υπερέκφραση του PELP1/MNAR στα ERβ θετικά αδενοκαρκινώματα συσχετίζεται με μεγαλύτερη συνολική επιβίωση των ασθενών. Ο AIB1 και ο TIF2 ανιχνεύονται στον πυρήνα επιθηλιακών αλλά και στρωματικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Η έκφραση του ΑΙΒ1 αυξάνει κατά την καρκινογένεση και συσχετίζεται με τοπική ανάπτυξη του όγκου. Ωστόσο, στην πολυπαραγοντική ανάλυση ο ΑΙΒ1 αναδεικνύεται ως ανεξάρτητος ευνοϊκός προγνωστικός παράγοντας ως προς τη συνολική επιβίωση. Η έκφραση του ΤΙF2 αυξάνει κατά την καρκινογένεση και στα αδενοκαρκινώματα συσχετίζεται με την έκφραση του AIB1. Ωστόσο, η έκφρασή του στα αδενοκαρκινώματα δε σχετίζεται με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου. Το πρότυπο έκφρασης των συμπαραγόντων AIB1 και TIF2 δε σχετίζεται σημαντικά με εκείνο του ERβ. Συζήτηση-συμπεράσματα-προοπτικές Η παρούσα μελέτη αναδεικνύει τη σημασία της έκφρασης και φωσφορυλίωσης του ΗΕR3 στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου, υποστηρίζοντας τον πιθανό ρόλο τους στην πρόγνωση της νόσου. Τα ευρήματα της μελέτης συμφωνούν με συγκεκριμένα βιβλιογραφικά δεδομένα ως προς τη συχνότητα ανίχνευσης του υποδοχέα στον παχύ έντερο, ενώ είναι η πρώτη η οποία αναδεικνύει τα επίπεδα HER-3 mRNA ως πιθανό προγνωστικό βιοδείκτη. Η διερεύνηση της έκφρασης του οιστρογονικού υποδοχέα β (ERβ1) ανέδειξε αύξηση των επιπέδων του κατά την καρκινογένεση, εύρημα που βρίσκεται σε συμφωνία με μερικά και σε αντιδιαστολή με άλλα βιβλιογραφικά δεδομένα. Η προγνωστική σημασία της έκφρασης των πυρηνικών υποδοχέων εξαρτάται από ποικίλους παράγοντες, όπως τα επίπεδα ειδικών συμπαραγόντων, ομοιοπολικές τροποποιήσεις, την τοπογραφία τους μέσα στο κύτταρο και τα επίπεδα συγκεκριμένων συγκεντρώσεων προσδέτη/ορμόνης. Η αύξηση των επιπέδων των συμπαραγόντων του οιστρογονικού υποδοχέα PELP1/MNAR, ΑΙΒ1 και ΤΙF2 κατά την καρκινογένεση υποδηλώνει πιθανή συμμετοχή τους σε οιστρογονοεξαρτώμενη ογκογόνο σηματοδότηση. Ωστόσο, η απουσία ισχυρής συσχέτισης ανάμεσα στα επίπεδα έκφρασής τους και στα επίπεδα έκφρασης του οιστρογονικού υποδοχέα (ERβ1) υπογραμμίζει την πλειοτροπική τους δράση και τον επιπρόσθετο ρόλο τους σε οιστρογονο-ανεξάρτητη ενδοκυττάρια σηματοδότηση. Περισσότερες μελέτες σε μεγάλο αριθμό ασθενών, κατάλληλα σχεδιασμένες και εκτελεσμένες, με τη χρήση ευαίσθητων και ειδικών πειραματικών τεχνικών καθώς και μεθόδων στατιστικής ανάλυσης απαιτούνται για την επιβεβαίωση των ευρημάτων της παρούσας μελέτης. Στην εποχή της μεταγονιδιωματικής ιατρικής, η αναζήτηση χρήσιμων μοριακών βιοδεικτών δύναται να συντελέσει στη βελτίωση της πρόγνωσης και της ποιότητας ζωής των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. / Colorectal cancer is a major cause of cancer-related morbidity and mortality in the western world and has a significant impact on the health care systems. The deep understanding of molecular mechanisms that underline cellular transformation and tumor progression leads to the identification of key-molecules that are appropriate targets for sophisticated therapy in cancer. One such targeted approach exploits the presence of specific biomarkers that could be considered essential for tumor development. The role of such a biomarker, Human Εpidermal Receptor-1 (ΗΕR-1/EGFR), has been established in the development of colorectal cancer, suggesting the potential involvement of neighboring receptors, such as Human Εpidermal Receptor-3 (HER-3). HER-3 is a membranic receptor implicated in intracellular cell proliferation signaling. Thus, quantitative modifications in its expression and/or qualitative changes in its structure may contribute to cellular malignant transformation. The significance of HER3 expression, localization and phosphorylation remains elusive and data regarding its role in the pathogenesis, diagnosis, prognosis and management of colorectal cancer is limited. Apart from their mebranic counterparts, nuclear receptors are implicated in the regulation of gene transcription. Estrogen receptors (ER) α and β mediate the estrogen actions in the subcellular microenvironment. Differences in the incidence of colorectal cancer in the two genders have underlined the significance of ER expression in colorectal carcinogenesis. The specificity of estrogen activities in various cell types is mediated by the presence of tissue-specific coregulators (coactivators/corepressors). These proteins are specific transcription factors that bind to nuclear receptors, orchestrating their actions on the genome. Frequently, such coregulators are located in the cytoplasm, regulating the non genomic activity of the estrogens. Proline-, glutamic acid-, and leucine-rich protein 1 (PELP1), also known as modulator of non-genomic activity of ER (MNAR), amplified in breast cancer-1 (AIB1) and transcriptional intermediary factor-2 (TIF2) are considered major ER-coregulators. Thus, the investigation of their expression is inherent to the evaluation of estrogen-mediated mechanisms. The dynamic cross-talk between HER- and ER-driven signaling pathways has been described. The aim of this study is the investigation of the role of HER3, ER and coregulators PELP1/MNAR, AIB-1, TIF-2 (over)expression in the pathogenesis and prognosis of colorectal cancer. Material and Methods Sections from formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tissue blocks, derived from 140 patients with colorectal cancer, were used. HER-3 mRNA levels of expression were assessed by quantitative RT-PCR in 54 colorectal adenocarcinomas and 29 normal mucosa specimens. The expression levels of both phosphorylated and unphosphorylated HER-3 protein were assessed by immunohistochemistry in 110 normal mucosa specimens, 24 adenomas and 140 adenocarcinomas. The expression levels of ER α and β, PELP1/ΜΝΑR were assessed by immunohistochemistry in 88 normal mucosa specimens, 30 adenomas and 113 adenocarcinomas. Additionally, the expression levels of ΑΙΒ1 and TIF-2 protein were assessed by immunohistochemistry in 83 normal mucosa specimens, 30 adenomas and 110 adenocarcinomas. Results HER-3 was detected both in the cytoplasm and nucleus, whereas pHER-3 was observed in the nucleus and membrane of cells. A possible switch in HER-3 topography from the nucleus to the cytoplasm during colorectal tumorigenesis is suggested. The expression of pHER-3 did not differ significantly in normal tissue, adenomas and carcinomas, but was related to disease stage. HER-3 mRNA overexpression was significantly associated with decreased time to disease progression. It was also correlated with higher median age, left colon and rectal tumour sites and lymph node involvement. ERα expression was extremely rare in colorectal tissue of our cohort and its expression did not appear to be associated with colorectal carcinogenesis. ERβ and PELP1/MNAR were detected in the nucleus of epithelial, endothelial, inflammatory, smooth muscle cells and myofibroblasts. When intensity of staining was taken into account, the expression of both proteins was significantly increased in epithelial cells of carcinomas compared to normal mucosa. ERβ expression in epithelial cells was correlated with decreased disease progression-free survival. PELP1/MNAR overexpression in epithelial cells was found to be an independent favorable prognostic factor. AIB1 and TIF2 were detected in the nucleus of epithelial, endothelial, inflammatory, smooth muscle cells and myofibroblasts. The expression of both proteins was significantly increased in epithelial cells of carcinomas compared to normal mucosa. In carcinomas, a significant correlation between the levels of expression of AIB1 and TIF2 was noted, but there was no correlation between the expression patterns of these two proteins and ERβ. Although AIB1 overexpression was associated with local tumor invasion, it was also found to correlate independently with prolonged overall survival. TIF2 overxpression did not appear to correlate with clinicopathological parameters. Conclusion/Discussion This study highlights the significance of ΗΕR3 expression and phosphorylation in colorectal carcinogenesis, supporting also its potential prognostic significance. This study supports literature data regarding HER3 expression in colorectal tissue, while is the first to imply a possible prognostic significance of HER-3 mRNA expression levels and to suggest a topographic switch of HER3 protein during colorectal carcinogenesis. ERβ1 protein levels were found to increase during colorectal carcinogenesis, a finding which corresponds only to a small portion of literature data. The prognostic role of nuclear receptors depends on a number of factors, such as coregulator expression levels, chemical modifications, subcellular localization and ligand/hormone levels. The concomitant increase in the expression levels of coregulators PELP1/MNAR, ΑΙΒ1 and ΤΙF2 during colorectal carcinogenesis might imply their potential participation in estrogen-mediated signaling. However, the characteristic absence of strong correlation between their expression pattern and ERβ1 expression pattern underlines their pluripotent role and their possible contribution to estrogen-independent signaling. Further studies with a large number of patients, appropriately designed and conducted using sensitive experimental and statistical methods, are required for the confirmation of our hypothesis generation results. In the post-genomic era, identification of useful molecular biomarkers might contribute to the improvement of the management and prognosis of patients with colorectal cancer.

Recently HER3, member of the epidermal growth factor receptor family (EGFR), has been found to play a crucial role in the development of resistance towards inhibitors that are given to patients with HER1- and HER2-driven cancers. As HER3 is up-regulated or over-activated in several types of human cancers, it is of outmost importance that new innovative drugs target its oncologic activity. The Affibody® Molecule Z08698 inhibits the heregulin induced signalling of HER3 with high affinity (KD~50 pM). As the Affibody® Molecule is small, has high solubility and outstanding folding kinetics, an effective penetration of tumour tissue is suggested together with a rationalized manufacturing process. Further coupling to an albumin binding domain (ABD) expands the plasma half-life of the molecule, hence increasing the molecule's potential of serving as a therapeutic. A process development for production of Z08698-VDGS-ABD094 has been established, where the molecule is efficiently produced in the E. coli host strain BL21(DE3), through a T7 based expression system. Cultivations were performed with a fed-batch fermentation process and the conditions were further optimized in order to obtain highest expression, while avoiding undesirable modifications like gluconoylations. By employing Design of experiments in combination with multivariate data analysis, a production process resulting in ~3.5 g product/ l culture could be verified. Moreover, thermolysis was evaluated as a suitable method for cell disruption, enabling an easy and cost-effective manufacturing process of the ABD fused Affibody® Molecule.

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. D'après la société américaine contre le cancer; en 2015, un quart des décès aux Etats-Unis est du au cancer du poumon avant même les maladies cardiaques. Cette situation nous incite et bien d'autres scientifiques dans le monde à développer des moyens plus efficaces de traitement, le diagnostic et le dépistage de la maladie. Parce que près de 90% des décès par cancer sont dus à des métastases, de nombreuses études se sont concentrées sur le mécanisme de métastases et sur son impact clinique. Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont les cellules s’échappent de tumeurs primaires ou métastatiques pour rejoindre le flux sanguin périphérique, ces cellules sont un élément de transition dans le processus métastatique et portent ainsi des informations cruciales sur ce mécanisme encore mal compris. Les CTCs ont déjà montré leur potentiel comme biomarqueur de pronostic de la progression de la maladie et de l'indicateur de l'efficacité du traitement en fonction l’augmentation ou de la diminution de leur nombre. Leur caractérisation moléculaire peut également donner des informations vis à vis de cibles thérapeutiques possibles et des mécanismes de progression de la maladie ou de la résistance aux médicaments. Leur comptage au cours du traitement combiné avec leur caractérisation moléculaire devrait améliorer la prise en charge des patients dans le cadre de la médecine personnalisée. Cependant CTCs sont extrêmement rares, 1 à 10 cellules / ml de sang parmi les 106 globules blancs et 109 globules rouges, leur capture à partir du sang reste donc un challenge analytique. Dans les dernières décennies, Une grande variété de techniques d'enrichissement et de capture a été mise au point et l'approche microfluidique est l'une des méthodes efficaces, flexibles et à haut débit. Au sein de notre équipe, un dispositif microfluidique (système Ephesia) puissant pour la capture et l'analyse des cellules tumorales circulantes a déjà été mis au point précédemment. Le principe de capture est basé sur l'auto-assemblage de billes magnétiques greffées par des anticorps, grâce aux quelles les cellules sont enrichies via l’interaction Ab- l'antigène de surface EpCAM que l'on trouve communément dans les cellules cancéreuses d'origine épithéliale. Ce système a déjà été validé avec des lignées cellulaires et des échantillons de patients. Cependant, le système n'a pas permis l'isolement / détection des sous-populations de CTCs ou d'effectuer une caractérisation moléculaire très poussée. Par conséquent, mon projet de thèse vise à améliorer encore les capacités du système sur les deux principaux aspects: le ciblage sous-populations de CTC et à l'étude des interactions des protéines à la surface des CTCs dans le Système Ephesia... / Metastasis is the advanced stage of cancer progression and is the cause of 90% of deaths in cancer disease. During metastatic cascade, it is suggested that the successful metastatic initiation depends on the survival of circulating tumor cells (CTCs). CTCs are the cells that shed from the primary or secondary tumor sites into the blood circulation. it is now widely recognized as potential biomarker for companion diagnostics in which high number of CTCs in blood can indicate association with poor survival or high risk of disease progression. Besides, following the number of CTCs during the course of treatment can help to adapt the selected therapy and predict the treatment efficacy. On the other hand molecular characterization can provide patient stratification and identifying the therapeutic targets. However they are extremely rare in the bloodstream, estimated between 1-10 CTC among 6×106 leukocytes, 2×108 platelets and 4×109 erythrocytes per one mL of blood which makes their isolation very challenging. A very attractive way of isolation of CTCs is to integrate microfluidics. Microfluidics offers great advantages such as low volume of reagent consumption and short analysis times with automation as well as isolation and detection analysis can be integrated resulting in highly efficient biomedical devices for diagnostics. As parallel to state of the art, a powerful microfluidic device for circulating tumor cells capture and analysis had already been developed previously in our laboratory. The principle of capture is based on self-assembly of antibody-coated (EpCAM) magnetic beads in which the cells are enriched by EpCAM surface antigen which is found commonly in epithelial origin cancer cells. This system was already validated with cell lines and patients samples. However, the system did not allow isolation/detection of subpopulations of CTCs or performing high content molecular characterization. Therefore, my PhD project aimed at further improving the capabilities of the system on the main two aspects: targeting subpopulations of CTC and studying of protein interactions of CTCs in Ephesia System...

Le cancer colorectal (CCR) est la troisième maladie maligne la plus fréquente et la deuxième cause de décès par cancer. La famille des récepteurs tyrosine kinases transmembranaires ErbB a été identifiée comme l'un des principaux moteurs du développement et de la progression du CCR et l'un de ses membres les plus connus, le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR / ERBB1 / Her1), considéré comme l'une des cibles les plus importantes en traitement CRC. Deux autres membres de la famille ErbB, les récepteurs Her2 et Her3, apparaissent également comme de nouvelles cibles importantes pour le CRC en raison de la mutation somatique, de l’amplification génique ou de la résistance aux traitements anti-EGFR. La protéine transmembranaire, Fas (TNFRSF6 / CD95), est un membre de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TNFRSF). Il peut transmettre des signaux multiples qui mènent à des destins de cellules complètement différents. Selon les contextes cellulaires, Fas initie la mort cellulaire par apoptose, essentielle pour arrêter les réponses immunitaires chroniques et prévenir l'auto-immunité et le cancer, ou pour stimuler la survie, la prolifération et la motilité des cellules, ce qui favorise l'auto-immunité, la croissance cancéreuse et les métastases. Avec des preuves de plus en plus nombreuses de la signalisation pro-survie médiée par Fas, les activités de promotion du cancer chez les patients atteints de cancer sont maintenant reconnues comme étant significatives et cliniquement pertinentes. Bien que cette polyvalence de signalisation ait été particulièrement bien démontrée dans le cancer du côlon, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les voies de survie sont encore largement inconnus. Dans ce contexte, l'objectif principal de mon doctorat Le projet visait à étudier l’importance du crosstalks entre les membres de la famille Fas et ErbB et, plus particulièrement, à déterminer si la signalisation Fas pouvait influencer la signalisation de l’EGFR favorisant le cancer.Plus précisément, je décris comment l’état de phosphorylation de la tyrosine Fas influence fortement la signalisation de la voie EGFR dans les cellules colorectales. Mes données démontrent que Fas dans son état prosurvival, phosphorylé à Y291 (pY291-Fas), interagit en effet avec EGFR et que cette interaction intensifie significativement la signalisation de l'EGFR dans les cellules cancéreuses colorectales anti-EGFR via la voie Yes-1 / STAT3. Le pY291-Fas s'accumule dans le noyau lors du traitement par EGF et favorise la localisation nucléaire du phospho-EGFR et du phospho-STAT3, l'expression de la cycline D1, l'activation des voies Akt et MAPK médiées par STAT3 et enfin la prolifération et la migration cellulaires. De plus, je découvre également le rôle potentiel que Her3 pourrait jouer avec Fas dans la libération des cellules cancéreuses colorectales de l'inhibition anti-EGFR.Tous ensemble mon doctorat des études permet de mieux comprendre le rôle des voies de survie de Fas dans la signalisation ErBb dans le CRC. Fait important, en démontrant un lien entre l'émergence d'une résistance aux traitements anti-ErbB et le signal de Fas pro-survie, mon travail justifie le développement d'une thérapie ciblée Fas / phospho-Fas comme nouvelle option thérapeutique pour surmonter les anti-EGFR, chez les patients présentant une résistance anti-EGFR secondaire. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common malignant disease and the second most frequent cause of cancer-related death. The ErbB family of transmembrane receptor tyrosine kinases has been identified as a major driver of the development and progression of CRC and one its best-known member, the epidermal growth factor receptor (EGFR /ERBB1/Her1), considered one of the most important targets in CRC treatment. Two others members of the ErbB family, the receptors Her2 and Her3, also emerge as important new targets for CRC due to the somatic mutation, gene amplification or resistance to the anti-EGFR therapies. The transmembrane protein, Fas (TNFRSF6/CD95), is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF). It can transmit multiple signals that lead to completely different cell fates. Depending on cellular contexts, Fas either initiates cell death by apoptosis, which is essential for shutting down chronic immune responses and preventing autoimmunity and cancer, or stimulates cell survival, proliferation, and motility, which can promote autoimmunity, cancer growth, and metastasis. With increasing evidence of Fas-mediated pro-survival signaling, the cancer-promoting activities of Fas are now recognized as significant and clinically relevant. While this signaling versatility has been particularly well demonstrated in colon cancer, the molecular mechanisms underlying the survivals pathways are still largely unknown. In this context, the main aim of my Ph.D. project was to study the importance of the crosstalks between Fas and the ErbB family members and more specifically to determine whether the Fas signaling could influence the cancer-promoting signaling of EGFR.More precisely, I describe how the Fas tyrosine phosphorylation status strongly influences the signaling of the EGFR pathway in colorectal cells. My data demonstrate that Fas in its prosurvival state, phosphorylated at Y291 (pY291-Fas), indeed interacts with EGFR and that this interaction significantly intensifies EGFR signaling in anti-EGFR-resistant colorectal cancer cells via the Yes-1/STAT3-mediated pathway. The pY291-Fas accumulates in the nucleus upon EGF treatment and promotes the nuclear localization of phospho-EGFR and phospho-STAT3, the expression of cyclin D1, the activation of STAT3-mediated Akt and MAPK pathways, and finally the cell proliferation and migration. Additionally, I also uncover the potential role that Her3, may play along with Fas, in the colorectal cancer cell escape from anti-EGFR inhibition. All together my Ph.D. studies provide a better understanding of the role of the Fas survival pathways in the ErBb signaling in CRC. Importantly, by demonstrating a connection between the emergence of resistance to anti-ErbB therapies and the Fas pro-survival signal, my work provides a rationale for the development of Fas/phospho-Fas targeted therapy as a new therapeutic option for overcoming anti-EGFR, in patients with secondary anti-EGFR resistance.