Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:22Z : No. of bitstreams: 1 Publico-236.pdf: 371313 bytes, checksum: 8940009edfa9433af73ec0e4cfae5e98 (MD5) / Objetivo: Avaliar aos aspectos clínicos e epidemiológicos da infecção pelo herpesvírus humano-6 (HHV-6) após transplante renal, avaliação da sua relação com a replicação do citomegalovírus (CMV), assim como a utilização da reação em cadeia por polimerase (PCR) “nested” e da PCR em tempo real como método diagnóstico de infecção ativa. Métodos: Trata-se de um estudo descritivo prospectivo, realizado no Hospital São Paulo e no Hospital do Rim e Hipertensão (afiliado a Universidade Federal de São Paulo), com acompanhamento de 30 receptores de transplante renal consecutivos. Foram coletadas sorologias para HHV- 6 dos doadores vivos e receptores pré-transplante e os pacientes foram monitorizados semanalmente nos primeiros dois meses e quinzenalmente por mais dois meses pós-transplante com realização de PCR “nested” e PCR em tempo real para HHV-6 em amostras de plasma e “buffy coat” (BC) e antigenemia para CMV. Resultados: A soroprevalência para HHV-6 nos doadores vivos foi 100% IgG positivo IgM negativo e nos receptores foi de 96,6% IgG positivo e 13,3% IgM positivo. A detecção de DNA viral em amostras de BC através da PCR foi mais frequente em relação às amostras de plasma: nos doadores vivos pré-transplante, respectivamente, 88,2% e 22,2% e nos receptores pós-transplante, respectivamente 96,6% e 70%, o que provavelmente está associada à detecção de DNA latente intracelular nas amostras de BC. Considerando infecção ativa como a detecção de DNA viral em amostras de plasma, a incidência de infecção foi de 70% quando utilizada PCR “nested”, entretanto foi observado que a maioria dos episódios de replicação viral foi pontual e que apenas 26% dos pacientes apresentaram replicação sustentada. Quando utilizado o ensaio de PCR em tempo real foi observado menor sensibilidade (36,6%) em relação a PCR “nested”, o que pode ser explicado pelo menor limite de detecção apresentado pelo ensaio em tempo real utilizado neste estudo. Na análise univariada a carga viral do HHV-6 > 10.000 cópias mL/plasma no receptor pré-transplante foi fator de risco associado à reativação viral (p= 0,046) e também foi fator preditivo de replicação viral sustentada (p=0,034), assim como sorologia IgM positiva no receptor pré-transplante foi fator preditivo para replicação viral sustentada (p= 0,005). A média de tempo para detecção de DNA viral no plasma pós-transplante foi de 31 dias e 80% dos episódios de infecção xviii foram assintomáticos. A infecção pelo CMV foi mais frequente (52,3%) no grupo de pacientes que apresentou reativação do HHV-6 em comparação com o grupo que não apresentou (33%) e doença pelo CMV sintomática também foi mais frequente nos pacientes co-infectados (36%) em relação aos pacientes que apresentaram somente infecção pelo CMV (0%). Conclusões: A infecção pelo HHV-6 no transplante renal é comum e apresenta caráter benigno, as reativações no póstransplante são precoces e estão relacionadas com pouca repercussão clínica. O diagnóstico laboratorial desta infecção deve ser realizado em amostras de plasma consecutivas e não em amostras isoladas. / Objectives: To evaluate the clinical and epidemiologic aspects of human herpesvirus-6 infection (HHV-6) after renal transplantation, its relation with the replication of citomegalovirus (CMV), as well as the use of nested polimerase chain reaction (PCR) and real time PCR as diagnostic methods of active infection. Methods: A prospective descriptive study was conducted at São Paulo Hospital and Hospital do Rim e Hipertensão (affiliated to the Federal University of São Paulo), with accompaniment of 30 consecutive recipients of renal transplant. HHV-6 serology of the living donors and recipients were collected just before transplantation and the patients were monitored every week in the first two months and every other week for two more months posttransplant, with nested (qualitative) and real time (quantitative) PCR for HHV-6 in plasma and “buffy coat” (BC) samples and with antigenemia for CMV. Results: HHV-6 seroprevalence in the living donors was 100% IgG positive and IgM negative and in the recipients was 96,6% IgG positive and 13.3% IgM positive. The viral DNA detention in samples of BC through the PCR was more frequent in relation to the plasma samples: in the living donors just before transplantation, respectively 88.2% and 22.2% and in the recipients post-transplant, respectively 96.6% and 70%, which is probably associated to the intracellular detention of latent DNA in the BC samples. Considering active infection as the viral DNA detention in plasma samples, the incidence of HHV-6 infection was 70% when nested PCR was used. However, it was observed that most of the viral replication episodes were isolated and that only 26% of the patients presented susteined replication. When the real time PCR assay was used lower sensitivity was observed (36.6%) in relation to nested PCR, which can be explained by the smallest limit of detention presented by the real time PCR assay used in this study. In the univariada analysis, viral load of HHV-6 > 10.000 copies mL/plasma in the recipients just before transplantation was a risk factor associated with viral reactivation (p= 0,046) and was also a predictor of sustained viral replication (p=0,034), as well as positive IgM serology in the recipients pre-transplant was a predictive factor for sustained viral replication (p=0,005). The average time for viral DNA detention in plasma posttransplant was 31 days and 80% of the infection episodes were assymptomatic. CMV infection was more frequent (52.3%) in the group of patients that presented reactivation of the HHV-6 in comparison with the group that did not present (33%) and symptomatic CMV infection was also more frequent in the co-infected patients (36%) in relation to thepatients who had only presented CMV infection (0%). Conclusions: HHV-6 infection in the renal transplant is common and benign, the reactivations post-transplant are precocious and related to little clinical repercussion. The laboratorial diagnosis of this infection must be carried out in consecutive plasma samples and not in isolated samples. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Infecções pelos herpesvírus bovinos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) têm sido sistematicamente detectadas em rebanhos bovinos brasileiros. Entretanto, por causa da alta similaridade antigênica entre estes dois vírus e a falta de testes sorológicos específicos, a prevalência de cada um deles é atualmente desconhecida. Com o objetivo de detectar e diferenciar infecções latentes causadas por BoHV-1 e/ou BoHV-5, gânglios trigêmeos de 200 bovinos foram coletados e analisados para a presença de DNA viral. As amostras foram coletadas em um frigorífico localizado no município de Capão do Leão, Rio Grande do Sul. Uma PCR semi quantitativa foi desenvolvida, otimizada e utilizada para detectar o DNA viral em gânglios. Para diferenciar entre infecções por BoHV-1 e BoHV-5, duas nested PCR tipo-específicas foram desenvolvidas e utilizadas. Além disto, as amostras de soros obtidas foram submetidas a testes de neutralização viral (VN) para detecção de anticorpos. O DNA de BoHV-1 e/ou BoHV-5 foi detectado em 87% dos animais. Os resultados das nested PCRs revelaram que 82,8% dos animais positivos estavam latentemente infectados com BoHV-1 e 93,1%, com BoHV-5. Além disto, foi detectada uma alta proporção de animais co-infectados com os dois vírus (75,9 %). Por outro lado, os resultados das VN mostraram que somente 49,5% dos animais apresentaram anticorpos anti-virais. Este é o primeiro estudo que utiliza testes moleculares para detectar infecções latentes por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em gânglios de um grande número de animais e mostra uma alta proporção de co-infecções por estes dois vírus em bovinos. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) infections have been consistently detected in Brazilian bovine herds. However, mainly because of their high antigenic similarity and the lack of specific serologic tests for both viruses, the prevalence of each of these viruses is currently unknown. Aiming the detection and differentiation of latent infections caused by BoHV-1 and/or BoHV-5, we collected trigeminal ganglia of 200 bovines and analyzed them for the presence of viral DNA. The samples were collected in an abattoir located in Capão do Leão, Rio Grande do Sul. A semi quantitative PCR was developed, optimized and used to detect the viral DNA in ganglia. To differentiate between BoHV-1 and BoHV-5 infections, two type-specific nested PCR were developed and performed. In addition, for the detection of anti-viral antibodies, serum samples were submitted to the virus neutralizing test (VNT). DNA of BoHV-1 and/or BoHV-5 was detected in 87% of the animals. The results of the nested PCRs reveled that 82.8% of the bovines were latently infected with BoHV-1 and 93.1%, with BoHV-5. Moreover, we detected a high proportion of co-infected animals (75.9 %). On the other hand, the results of the VNT indicated that only 49.5% of the animals had anti-viral antibodies. This is the first study that applies molecular tests to detect latent infection by either BoHV-1 and/or BoHV-5 in ganglia of a high number of animals and shows such a high proportion of coinfections of these two viruses in bovines.

A presente tese aborda os principais aspectos da biologia do vírus Epstein-Barr (EBV), suas relações com doenças, seu potencial uso como ferramenta para a biologia celular e a reprodutibilidade desta célula para o auxílio no diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM) através da medida de atividades de hidrolases lisossômicas. Os objetivos deste trabalho foram investigar as alterações celulares e morfológicas nos linfócitos B infectados com EBV, afim de confirmar a transformação celular nos 12 dias de cultura, para certificação do protocolo empregado; determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180, 365 e 730 dias de criopreservação em nitrogênio líquido, das enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a- glicosidase e a-iduronidase em Linhagens Celulares Linfoblastóides (LCL) transformados com EBV de indivíduos normais e determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180 dias de criopreservação das enzimas β-glicosidase, a-galactosidase e a- iduronidase em LCLs transformados com EBV de pacientes com doenças de Gaucher e Fabry e Mucopolissacaridose tipo I. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo EBV através das 3 ferramentas utilizadas: imunohistoquímica, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia confocal. Foram observados, através destes instrumentos, o aparecimento de clusters celulares, vacúolos citoplasmáticos, binucleação e aumento no conteúdo de organelas, o que é esperado em células infectadas por EBV. Foi observado também que as células cultivadas por 12 dias com EBV apresentavam a atividade da β-glicosidase e da a-iduronidase diferente significativamente daquela de linfócitos não infectados. Após 6 meses, 1 e 2 anos de criopreservação das células transformadas com EBV, em nitrogênio líquido, as enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a-glicosidase e a-iduronidase mantiveram suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. O mesmo ocorreu quando utilizamos amostras de pacientes com doença de Gaucher, Fabry e Mucopolissacaridose tipo I após 6 meses de criopreservação. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo vírus Epstein Barr e que uma vez congeladas até pelo menos 1 ano em nitrogênio líquido, todas as enzimas analisadas mantém suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. / The present study addresses the main aspects of the biology of the Epstein-Barr virus (EBV) and its relationships with diseases, its potentials as a tool in cell biology, and the reproducibility of EBV-infected cells to assist in the diagnosis of Inborn errors of metabolism (IEM) using a measure of the activities of lysosomal hydrolases. The objectives of this study were (i) to investigate the cellular and morphological changes in B-lymphocytes infected with EBV to confirm cell transformation within the 12-day culturing period in order to verify the applicability of the method; (ii) to determine the activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-iduronidase, α-galactosidase and α- glucosidase in lymphoblastoid cell lines at the moment of collection (12-day culturing) and immediately after 180, 365 and 730 days in lymphoblastoid cell lines (LCLs) transformed with EBV of normal individuals frozen in liquid nitrogen and (iii) to determine the activities of the enzymes β-glucosidase, α- galactosidase and α-iduronidase at the moment of collection (12 days of culturing) and immediately after 180 days in LCLs transformed by the EBV of patients with Gaucher and Fabry diseases and with muccopolysaccharidosis type I frozen in liquid nitrogen. The results showed that the protocol was efficient to transform B-lymphocytes by EBV using three tools: immunohistochemistry, transmission electron microscopy and confocal microscopy. The technique afforded to observe the emergence of clusters, cytoplasm vacuoles, binucleatoon and increased organelle contents, which are expected in EBV-infected cells. Also, it was observed that cells cultured with EBV for 12 days presented β-glucosidase and α-iduronidase significantly different from that of non-infected lymphocytes. Activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-galactosidase. α-glucosidase and α- iduronidase measured after 180, 635 and 730 days in cryopreservation of EBVtransformed cells in liquid nitrogen were similar to that of samples after 12-day culturing of cells. The same was observed when we used samples from patients with Gaucher, Fabry and muccopolysaccharidosis type I after a 6-month cryopreservation period. This study shows that the protocol was efficient in transforming B-lymphocytes by EBV and that the activities of all enzymes frozen for at least one year in liquid nitrogen remained similar to that of samples collected after 12-day culturing.

A capacidade dos vírus em inibir a resposta imune inata é uma condição que os permite manterem-se na natureza. O vírus parainfluenza 5 (PIV5), por exemplo, expressa a proteína V, a qual é descrita como uma inibidora da sinalização de interferon (IFN), assim antagonizando seu efeito antiviral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do bloqueio do receptor de IFN-I no crescimento de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) in vitro e elucidar as relações entre a replicação viral e a resposta de IFN-I pela célula infectada. Para isso, foi modificada uma linhagem celular de bovinos (CRIB) que expressa de forma permanente a proteína V do PIV5. Esta linhagem celular foi denominada CRIB/V. Foram, então, realizados ensaios de penetração, tamanhos de placas virais e curvas de crescimento usando as amostras de BoHV-1 e BoHV-5 em células CRIB e CRIB/V. A análise com BoHV-1 não mostrou diferenças significativas nas cinéticas de penetração e crescimento. Entretanto os tamanhos de placa foram maiores em CRIB/V do que em CRIB. Para o BoHV-5, a penetração foi um pouco mais rápida em CRIB/V. Mesmo que os títulos finais não tenham sido diferentes nas duas células, o BoHV-5 alcançou títulos mais altos em CRIB/V do que em CRIB em períodos iniciais da curva de crescimento em CRIB/V em comparação a CRIB. Além disso, a média do tamanho de placa para BoHV-5 foi maior em CRIB/V do que nas células CRIB. Diferentemente das observações com BoHV-1, nossos resultados sugerem que o bloqueio do receptor de IFN-I pela proteína V facilitou a penetração, liberação e disseminação célula-célula do BoHV-5 nas células bovinas, suprimindo uma resposta antiviral, pelo menos, durante os estágios iniciais da infecção. / The ability of viruses to inhibit innate immune responses dictates a possibility to maintain in nature. For instance, Parainfluenza virus 5 (PIV5) expresses the V protein, which is described to inhibit type I interferon (IFN-I) signaling , then, antagonizing its antiviral effects. The aim of this work was to study the effect of blocking the IFN-I receptor signaling by this V protein on the growth properties of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) in vitro. A plasmid expressing the V protein of PIV5 was transfected into CRIB cells. We performed penetration kinetics, measured viral plaque sizes and determined one step growth curves using BoHV-1 and BoHV-5 strains in both CRIB and CRIB/V cells. The analysis on BoHV-1 showed no significant difference in penetration and growth kinetics. However the BoHV-5 viral plaques were bigger in CRIB/V than CRIB. The penetration of BoHV-5 in CRIB/V cells was slightly faster than in CRIB cells. Even though the final titers did not differ in both cells, BoHV-5 reached higher titers in CRIB/V than in CRIB at earlier time points of its growth. Moreover, the mean plaque size caused by BoHV-5 in CRIB/V cells was spectacularly bigger in CRIB/V than in CRIB cells. Unlike the observations with BoHV-1, our results suggest that blocking the signaling via the IFN-I receptor by the V protein facilitated penetration, release and cell-to-cell spread of BoHV-5 in bovine cells, counteracting an antiviral response, at least, during the early stages of infection.

Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são importantes patógenos que podem afetar os tratos respiratório e genital e o sistema nervoso central de bovinos. Visando iniciar um estudo sobre a distribuição destes vírus em sêmen de bovinos no Brasil, foi realizada a detecção de BoHV-1 e 5 em amostras de sêmen através de duas reações em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCRs) espécie-específicas. Foram testadas 53 amostras de sêmen fresco e 23 amostras de sêmen em palheta coletados de touros de dois estados brasileiros. DNA de BoHV-5 foi detectado em todas as amostras e 34 dessas também foram positivas para BoHV-1. Em cinco amostras de sêmen fresco e em 13 amostras de sêmen em palheta foi possível isolar BoHV-1 e/ou BoHV-5 infeccioso. Demonstramos, assim, que ambos os tipos virais foram detectados em amostras de sêmen de bovinos brasileiros, destacando a importância de se monitorar a presença desses agentes em sêmen de touros, para reduzir o risco de transmissão dessas viroses. Além disso, com o objetivo de contribuir com o controle destas infecções no território brasileiro, nesse estudo também se propôs a construção de um vírus recombinante com deleção do gene UL49.5, que codifica uma proteína de evasão imune, a partir de uma amostra de BoHV-5 gE-, gI- e US9-. Para isso, foi construído um cassete de deleção contendo o gene UL49.5 mutado que foi co-transfectado com DNA viral em células eucarióticas de bovinos. Até o momento não foi possível isolar vírus recombinantes, entretanto, vários parâmetros de transfecção foram aqui otimizados, o que facilitará a futura obtenção deste recombinante. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are important pathogens of the respiratory and genital tract of cattle and may also affect the central nervous system. Aiming begin the study of the distribution of these viruses in semen of Brazilian bulls, it was performed here the detection of BoHV-1 and 5 in semen samples by two species-specific nested polymerase chain reactions (nPCRs). Fifty three fresh semen samples and 23 frozen semen samples from two Brazilian states were tested. DNA of BoHV-5 was detected in all samples and 34 of these were positive for BoHV-1 as well. In addition, in 5 fresh semen samples and 13 frozen semen samples infectious BoHV-1 and /or BoHV-5 was isolated. Thus, we demonstrated that both viruses are detected in Brazilian semen samples, highlighting the importance of search for these agents in bull semen to reduce the risk of transmitting these viruses. Moreover, in order to contribute with control of these infections in Brazilian territory, this study also aims to make a recombinant virus with a deletion in the UL49.5 gene, which codes for an immune evasion protein, in a BoHV-5 gE-, gI- and US9- sample. To achieve this, a deletion cassette with a mutated UL49.5 gene was built and co-transfected with viral DNA in eukaryotic bovine cells. Hitherto no recombinant virus was isolated; however, many transfection parameters were optimized, favoring the achievement of the recombinant.

Sabe-se que um dos principais problemas odontológicos na clínica de felinos é a gengivite crônica e intratável. Tal afecção pode ser iniciada e/ou exacerbada por agentes virais, como o vírus da imunodeficiência dos felinos (FIV), o Herpesvírus tipo 1 e o Calicivírus. Os gatos da raça Maine Coon apresentam grande predisposição ao desenvolvimento de gengivite-estomatite juvenil e intratável. A depleção de linfócitos T CD4+ e T CD8+ pode exercer papel determinante na iniciação e manutenção das doenças inflamatórias da gengiva. O escopo do presente estudo foi verificar se os animais da raça Maine Coon são mais predispostos à calicivirose, bem como avaliar quantitativamente a resposta imunológica celular, mediada por linfócitos TCD4+ e TCD8+, visando a correlacionar à influência do número de linfócitos na presença e curso da gengivite nesta determinada raça, utilizando-se como controle gatos de outras raças com e sem gengivite. Os valores absolutos médios de linfócitos totais em Maine Coons com gengivite crônica mostraram-se inferiores aos de gatos da raça Maine Coon sem doença oral e de gatos de outras raças com gengivite crônica (p<0,05); os valores médios de linfócitos TCD4+ em Maine Coons com gengivite crônica mostraram-se inferiores quando comparados aos valores de animais da mesma raça, sem doença oral instalada (p<0,05); animais da raça Maine Coon possuem menor relação CD4+:CD8+ quando comparados a animais de outras raças com gengivite crônica e também quando comparados a Maine Coons sem doença oral (p<0,05). O calicivírus está altamente relacionado à ocorrência da gengivite, independentemente da raça estudada, não havendo maior prevalência na raça Maine Coon. O efeito do calicivírus não foi significativo nas alterações de nenhuma das variáveis celulares estudadas. Tais fatos apontam para uma possível predisposição racial ao quadroinflamatório gengival, com alteração de alguns componentes celulares relacionados à imunidade celular. Isto tem como fator importante alertar o clínico frente ao uso de glicocorticóides no tratamento da gengivite crônica nesta raça, visando a evitar maior comprometimento da imunidade celular destes animais. / Chronic untreatable feline gingivitis is widely recognized as one of the major oral diseases seen in feline patients. It can be either triggered or exacerbated by virus such as feline immunodeficiency virus, feline herpesvirus type 1 and calicivirus. One may therefore propose that lymphocytes T CD4+ and T CD8+ depletion can play an important role in initiating and maintaining the inflammatory gingival disease. Maine Coon cats are highly predisposed to juvenile untreatable gingivitis. The purpose of this study was to evaluate whether Maine Coon cats are more predisposed to calicivirus infection and to verify, quantitatively, their immunological cellular response mediated by lymphocytes T CD4+ and TCD8+. The main idea was to investigate the influence imposed by lymphocyte counts in gingivitis development and progression within this breed; for this, we selected non-Maine Coon cats (with and without gingivitis) to serve as controls. Mean absolute values of total lymphocytes in Maine Coon cats presented with gingivitis were inferior than the same values taken for both Maine Coon cats free of oral disease and non-Maine Coon cats with chronic gingivitis (p<0,05); lymphocytes TCD4+ average values in Maine Coon cats with chronic gingivitis were also lower than the ones taken from cats of the same breed but without oral disease (p<0,05). Maine Coon cats have lower CD4+:CD8+ ratio when compared to non-Maine Coon cats with chronic gingivitis as well as with Maine Coon cats without oral disease (p<0,05). The calicivirus is highly involved with the occurrence of gingivitis, no matter the breed being evaluated. The action virus imposes in changing cellular immunology was not significant, at least considering the cellular variables studied. All these lead us to point out a possible breed predisposition to the gingival inflammation, with modification of some cellular components related with cellular immunity. Furthermore, concerning practical terms, these results serve as a relevant alert to the clinicians regarding the use of glucocorticoids for treating chronic gingivitis in this breed, in order to prevent further impairment of cellular immunity of these animals.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-18Bitstream added on 2014-06-13T19:14:32Z : No. of bitstreams: 1 borges_la_me_jabo.pdf: 248872 bytes, checksum: bb6dce02b71fa4434990be14d38d0fe8 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), agente etiológico da rinotraqueite infecciosa bovina (IBR)/Vulvovaginite Pustular Bovina (IPV), tem grande importância como agente causador de problemas reprodutivos em vacas por determinar baixas taxas de concepção ou parição, acarretando consideráveis perdas econômicas para o produtor. Assim, o presente estudo conduzido em rebanhos de três fazendas (A, B e C) onde se processa a transferência de embriões (TE) no município de Prata no Estado de Minas Gerais teve como objetivo verificar as condições sorológicas de 209 animais antes do processamento biotécnico, determinar a resposta imune de esquema vacinal pré-definido e analisar a relação entre títulos médios geométricos (TMG) de anticorpos antes e depois da vacinação com os parâmetros reprodutivos de fêmeas receptoras de embriões vacinadas contra o BoHV-1. O título dos anticorpos para BoHV-1 foi determinado por meio do teste de virusneutralização (VN), conforme protocolo definido pelo Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e o quadro reprodutivo foi caracterizado por meio do exame de ultrassonografia transretal. Com isso, verificou-se que as prevalências de 39,7% (27/68) na fazenda A, 27,5% (11/40) na fazenda B e 36,6% (37/101) na fazenda C não foram estatisticamente diferentes; essa situação epidemiológica definiu o aumento de títulos de anticorpos para o BoHV-1 em 72,7% (152/209) dos animais pela vacinação com dose única; o maior sucesso de prenhez (75%) na 1ª TE foi observada nos animais que eram positivos e atingiram títulos acima de 256 após a vacinação; mesmo assim, no contexto estatístico, os índices gerais de gestação não tiveram influência significativa em decorrência da vacinação com dose única / The bovine herpesvirus type 1 (BoVH-1), which causes infectious bovine rhinotracheitis (IBR) / infectious pustular vulvovaginitis (IPV), has major importance as an agent that causes reproductive problems by determining low conception or calving rates causing significant economical losses for the producer. The present study, was carried out in the cattle of three farms (A, B and C), where the embryos transfer is processed (ET), at Prata municipality in Minas Gerais State, aiming to verify the serological conditions of 209 animals before biotechnical processing, to determine immune response to a pre defined vaccination schedule and to analyze the relationship between geometric mean titers (TMG) of antibodies before and after vaccination with the reproductive parameters in embryo recipient heifers vaccinated against BoHV-1. The antibodies titers of BoHV-1 were determined by the virusneutralization test (VN), according to the protocol established by the World Organization for Animal Health (OIE) and the reproductive performance was characterized by transrectal ultrasonography examination. Thus, it was verified that the prevalence rates of 39.7% (27/68) in farm A, 27.5% (11/40) in farm B and 36.6% (37/101) in farm C had no statistical difference; this epidemiological situation defined the increase of antibody titers for BoHV-1 in 72.7% (152/209) of the animals by vaccination with a single dose; the greater success of pregnancy (75%) in the first ET was observed in animals that were positive and reached titers higher than 256 after vaccination; in the statistical context, the single dose vaccination had no significative influence in the overall rates of pregnancy

Orientador: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Claudia Esther Alicia Rocio Hassan / Banca: João Pessoa Araújo Junior / Resumo: O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV / Abstract: Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a gammaherpesvirus associated with the development of Kaposi's sarcoma. The K1 protein of KSHV has been shown to induce increases the survival and proliferation of infected cells. The viral ORF-K1 shows high variability, so it is possible to distinguish different KSHV genotypes (genotypes A, B, C, D). So far, it is unclear whether different viral genotypes have their own biological characteristics. To this intent, recombinant vectors were generated containing the ORFK1 genotypes A and B. ORF-K1 was obtained from the DNA of primary effusion lymphoma (PEL) cell lines. The amplicon generated and the commercial vector were digested, bonded and cloned in E.coli DH5α. Selected clones underwent automated DNA sequencing. The generated sequences were compared with prototype sequences of ORF-K1. The amino acid sequences from vectors were generated and analyzed in the K1 ITAM-coding region. Validated clones were stably transfected into HEK293 cells and K1 expression was evaluated using Western blot (WB). DNA sequencing showed that the ORF-K1 recombinant vectors corresponds to the prototype sequences deposited from PEL cell lines. WB demonstrated the presence of K1 in the lysate of HEK293 transfected cells. Analysis of the K1 amino acid sequence encoded in the vectors revealed that ITAM domain of K1 (genotype B) has distinct amino acids from the ones in the ITAM domain of K1 (genotypes A and C). Therefore ORF-K1 recombinant vectors were produced and validated, and will be useful to establish an experimental model for analysis of the biological properties of the K1 protein / Mestre

Resumo: O presente estudo buscou detectar o herpesvirus felino tipo 1 (HVF-1) em fragmentos de conjuntiva de uma população de gatos pela técnica de PCR em tempo real. Além disso, procurou-se associar estes resultados aos sinais oculares verificados nestes animais. Para isso, foram utilizados 70 gatos, que conviviam em contato direto, provenientes de uma residência da cidade de Araçatuba, SP. Por meio de PCR em tempo real, foi detectado DNA de HVF-1 em 78,1% (25/32) dos gatos com ao menos um sinal ocular e em 26,3% (10/38) dos assintomáticos, totalizando uma prevalência de 50% (35/70) na amostra global. Nos animais com sinais de conjuntivite, em 60% (21/35) dos gatos positivos havia ao menos um destes sinais e nenhum destes nos 40% (14/35) restantes. Nos gatos com sinais de ceratite, em 49% (17/35) dos positivos havia ao menos um destes sinais e nenhum deste nos 51% (18/35) restantes. Foi detectada a presença de HVF-1 em todos (17/100%) os gatos com defeito epitelial corneal. Houve associação significativa entre a presença de ao menos um sinal ocular, ao menos um sinal de conjuntivite e de ceratite com os resultados do PCR. Em relação a cada sinal ocular, somente o defeito epitelial corneal e o blefarospasmo tiveram associação significativa com estes resultados e também estavam associados entre si, sugerindo que, nos gatos com sinais de ceratoconjuntivite, o defeito epitelial corneal pode ser um fator de influência ao surgimento do blefarospasmo. A elevada prevalência da infecção ocular por HVF-1 encontrada nos animais com sinais oculares sugere o agente como possível causador destas lesões / Abstract: This study aimed to detect feline herpesvirus type 1 (FHV-1) in the conjunctival fragments of a cat population by PCR real-time. In addition, we sought to associate these results to ocular signs observed in these animals. For this, we used 70 cats that lived in direct contact, from a residence from Araçatuba, SP. By means of real-time PCR, DNA was detected FHV-1 in 78.1% (25/32) of cats with at least one ocular sign and 26.3% (10/38) of asymptomatic patients, a total prevalence 50% (35/70) in the sample. In animals with signs of conjunctivitis in 60% (21/35) cats were positive at least one of these signals and none of the 40% (14/35) remaining. In cats with signs of keratitis in 49% (17/35) were positive from at least one of the signals and none of the 51% (18/35) remaining. We have detected the presence of FHV-1 at all (17/100%) cats with corneal epithelial defect. There was a significant association between the presence of at least one eye sign, at least a sign of conjunctivitis and keratitis with PCR results. For each ocular sign, only the corneal epithelial defect and blepharospasm were significantly associated with these outcomes and also were associated with each other, suggesting that, in cats with signs of keratitis, corneal epithelial defect may be a factor influencing the emergence of blepharospasm. The high prevalence of ocular infection by FHV-1 found in animals with ocular signs suggested as a possible causative agent of these injuries / Orientador: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Cristiane dos Santos Honsho / Banca: Flávia Resende Eugênio / Mestre

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Banca: Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Cursi / Resumo: A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia da reprodução aplicada rotineiramente no melhoramento genético da espécie bovina. No entanto, ainda não está determinado até que ponto sua utilização pode implicar na disseminação de patógenos, como por exemplo, do Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5), considerado um α-herpesvirus neuro- virulento, potencialmente patogênico em bovinos. Para avaliar o impacto da exposição de oócitos bovinos ao BoHV-5 este estudo avaliou as taxas de desenvolvimento dos embriões bovinos produzidos in vitro, a atividade mitocondrial, a ação antioxidante e a resposta ao estresse em dois grupos distintos; grupo controle e grupo expostos ao BoHV-5. A qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro, não foi afetada pela exposição ao BoHV- 5, a taxa de produção foi de 54,6 % no controle e 49,7% no exposto. O DNA viral correspondente ao gene US9 foi identificado em embriões bovinos no D7 após a fecundação in vitro e confirmado por reação imunofluorescência indireta. Os resultados revelaram diferenças (p<0,05) entre embrião do grupo de expostos e controle pelo MitoTracker Green FM, e pelo Jc-1. Não existiu diferença significativa nos índices de Hoechst 33342. Os embriões expostos produziram proteína antioxidante tipo 1 (AOP-1). Nenhum dos grupos produziram a proteína do choque térmico heat shock protein (Hsp 70.1). Ambos os grupos produziram a superóxido desmutase (SOD1), revelando atividade mitocondrial intensa, sem interferir na quantidade e qualidade dos embriões produzidos. Esses achados podem ajudar a entender a habilidade do α- herpesvirus em prevenir a apoptose / Abstract: The in vitro production of embryos is a biotechnology of reproduction routinely applied in the improvement of the bovine specie. However, it is not yet determined the extent to which its use may result in the spread of pathogens, such as the bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), considered an α-herpesvirus neuro-virulent, potentially pathogenic in cattle. To assess the impact of exposure of bovine oocytes to BoHV-5 we studied the developmental rates of bovine in vitro produced, mitochondrial activity, antioxidant effects, stress response into two distinct groups, control group and group exposed to BoHV-5. The quality of bovine embryos produced in vitro was not affected by exposure to BoHV-5, the production rate was 54.6% in the control and 49.7% in the exposure. The viral DNA corresponding to the US9 gene was identified in the D7 bovine embryos after in vitro fertilization and confirmed by indirect immunofluorescence reaction. The results revealed differences (p <0.05) between embryo exposed group and control by MitoTracker Green FM, and the Jc-1. There was no significant difference in rates of Hoechst 33342. The exposed embryos produced antioxidant protein type 1 (AOP-1). None of them produced heat shock protein (Hsp 70.1). Both groups produced the superoxide dismutase (SOD1), revealing intense mitochondrial activity, without interfering in the quantity and quality of embryos produced. These findings may help understand the ability of α-herpesvirus in preventing apoptosis / Mestre