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Oxidação da proteína dissulfeto isomerase pelo hidroperóxido de urato e as implicações sobre o endotélio vascular / Oxidation of protein disulfide isomerase by urate hydroperoxide and implications in vascular endotheliumMineiro, Marcela Franco 29 April 2019 (has links)
Em condições inflamatórias do sistema vascular, altas concentrações de mieloperoxidase somada à presença do ácido úrico, sugerem a formação local do oxidante hidroperóxido de urato. A ação desse peróxido já foi demonstrada sobre glutationa e peroxirredoxinas, tornando plausível a possibilidade de que outras proteínas tiólicas também pudessem ser alvo de oxidação. A proteína dissulfeto isomerase é uma ditiol-dissulfeto oxidoredutase e chaperona, localizada principalmente no retículo endoplasmático, onde participa do enovelamento de proteínas nascentes. Além disso, um pool dessas enzimas foi identificado na superfície da célula e no meio extracelular (secretada) e parece ser especialmente importante em eventos vasculares como ativação e agregação de plaquetas, trombose e remodelamento vascular. Primeiramente, foi investigado se o hidroperóxido de urato era capaz de oxidar a PDI. Pelo ensaio do DTNB foi verificado que os tióis livres da proteína eram consumidos após reação com o peróxido e, em seguida, por nLC-MS/MS os resíduos de cisteínas dos sítios catalíticos foram identificados como os principais alvos de oxidação. Embora não tenham sido verificadas outras modificações além de dissulfetos, foi observado que o tratamento com hidroperóxido promoveu agregação e inativação da proteína. Os estudos subsequentes envolveram uma linhagem de células endoteliais (HUVECs). Análises preliminares de citotoxicidade (detecção da atividade da enzima lactato desidrogenase no sobrenadante e incorporação de sondas fluorescentes ao DNA) mostraram que tratamentos com concentrações de até 400 µM de hidroperóxido de urato não são letais às células em cultura. Usando alquilantes impermeáveis à membrana celular foi mostrado que o hidroperóxido de urato oxida não só a proteína dissulfeto isomerase, mas também proteínas tiólicas totais expressas na superfície das HUVECs. Experimentos de wound healing foram feitos para avaliação da capacidade de migração das células mediante o tratamento com hidroperóxido de urato, mas nenhuma diferença foi observada. Contudo, a incubação das células com os agentes oxidantes hidroperóxido de urato e diamida, inibidores de PDI e integrina e um alquilante de tiol, resultaram, pelo menos nos trinta primeiros minutos, em menor capacidade de adesão das células à fibronectina. Além disso, as células tratadas com hidroperóxido de urato se tornaram mais sensíveis ao destacamento da placa de cultura e apresentaram alteração na morfologia. O tratamento com o peróxido também afetou a homeostase redox das HUVECs, observado pela diminuição da razão GSH/GSSG. Finalmente foram apresentadas evidênciasindiretas de que o ácido úrico é substrato da peroxidasina, uma heme peroxidase abundantemente expressa no sistema vascular. Primeiro, pelo ensaio do Amplex Red foi observado que a presença de ácido úrico na mistura reacional resultou em menor taxa de oxidação do reagente. Depois, por LC-MS/MS, também em amostra na qual o ácido úrico estava presente, foi identificado o hidroxiisourato, álcool resultante da decomposição do hidroperóxido de urato. Todo o conjunto de dados deverá contribuir para o maior entendimento da participação do hidroperóxido de urato em processos oxidativos vasculares − especialmente a oxidação de proteínas − que pode ser um dos mecanismos responsáveis pela alteração da função endotelial e da homeostase vascular. / During vascular inflammatory conditions, high amounts of myeloperoxidase added to the presence of uric acid, suggest the local formation of urate hydroperoxide. Its oxidative action has already been demonstrated on glutathione and peroxiredoxins, making plausible the possibility that other thiol proteins could also be a target for oxidation. The protein disulfide isomerase is a dithiol-disulfide oxidoreductase and chaperone, located mainly in the endoplasmic reticulum, where it is involved in the correct folding of nascent proteins. Also, a pool of these enzymes has been identified in cell surface and the extracellular (secreted) milieu and appears to be important in vascular events, such as platelet activation and aggregation, thrombosis and vascular remodeling. First, it was investigated whether urate hydroperoxide was capable of oxidizing PDI. By the DTNB assay, it was found that the free thiols of the protein were consumed after reaction with the peroxide and then, by nLC-MS / MS, the active redox cysteine residues were identified as the main oxidation targets. Although no modifications other than disulfides have been found, hydroperoxide treatment has been shown to promote protein aggregation and inactivation. Subsequent studies involved an endothelial cell line (HUVECs). Preliminary cytotoxicity analyzes (detection of lactate dehydrogenase enzyme activity in the supernatant and incorporation of fluorescent probes into DNA) have shown that treatments with concentrations up to 400 µM are not lethal to cells in culture. Then, using alkylating agents impermeable to the cell membrane, urate hydroperoxide was shown to oxidize not only PDI but also total thiol proteins expressed on HUVECs surface. Wound healing experiments were performed to evaluate cell migration after treatment with urate hydroperoxide, but no difference was observed. However, incubation of the cells with the oxidizing agents urate hydroperoxide and diamide, inhibitors of both PDI and integrin and a thiol alkylator, resulted, at least for the first thirty minutes, in reduced cell adhesion to fibronectin. In addition, cells treated with urate hydroperoxide became more sensitive to detachment from the culture dish and exhibited alterations in morphology. Treatment with the peroxide also affected the redox homeostasis of the HUVECs, observed by a decrease in the GSH / GSSG ratio. Finally, indirect evidence was presented that uric acid is a substrate of peroxidasin, a heme peroxidase abundantly expressed in the vascular system. First, with the Amplex Red assay it was observed that the presence of uric acid in the reaction mixture resulted in lower oxidation rates of the reagent. Then, by LC-MS / MS, hydroxyisourate, which is the alcohol derived from urate hydroperoxide decomposition, was also identified in samples containing uric acid. Taken together, the data presented should contribute to a better understanding of the involvement of urate hydroperoxide in vascular oxidative processes − especially protein oxidation − that may be one mechanism associated to disturbances in endothelial function and vascular homeostasis.
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Avaliação da interação do hidroperóxido de urato com a proteína dissulfeto isomerase (PDI) em processos inflamatórios / Evaluation of the interaction of urate hydroperoxide with protein disulfide isomerase (PDI) in inflammatory processesPatricio, Eliziane de Souza 11 July 2014 (has links)
A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.
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Efeito pró-oxidante do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis às alterações redox: implicações na resposta inflamatória / Pro-oxidant effect of urate hydroperoxide on redoxsensitive proteins: implications on inflammatory reponseCarvalho, Larissa Anastácio da Costa 19 May 2017 (has links)
O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.
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Efeito pró-oxidante do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis às alterações redox: implicações na resposta inflamatória / Pro-oxidant effect of urate hydroperoxide on redoxsensitive proteins: implications on inflammatory reponseLarissa Anastácio da Costa Carvalho 19 May 2017 (has links)
O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.
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Avaliação da interação do hidroperóxido de urato com a proteína dissulfeto isomerase (PDI) em processos inflamatórios / Evaluation of the interaction of urate hydroperoxide with protein disulfide isomerase (PDI) in inflammatory processesEliziane de Souza Patricio 11 July 2014 (has links)
A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.
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