O etanol contribui significativamente para que a matriz energética do país se apresente extremamente favorável quanto à participação da energia renovável. A demanda por este biocombustível é crescente e tecnologias que permitam a sua produção de forma sustentável é de suma importância, como a fermentação com alto teor de etanol, já empregada em alguns países. Linhagens de leveduras com tolerância a múltiplos estresses muito contribuíram para a implantação de tal tecnologia no Brasil. Neste contexto se insere o presente trabalho, o qual busca linhagens de leveduras capazes de suportar os estresses impostos por uma fermentação com alto teor alcoólico. Para tal, 3 entre as melhores linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae atualmente disponíveis (CAT-1, PE-2 e SA- 1), foram utilizadas num programa para a seleção de híbridos para tolerância múltipla aos estresses etanólico, osmótico, ácido, além de outros, inerentes à fermentação com alto teor de etanol. Estas linhagens foram esporuladas e dissecadas para obtenção de células haplóides, as quais foram submetidas a cruzamentos entre- e intra-linhagens. Foram conduzidos cruzamentos massais (aleatórios) cujos produtos foram submetidos à evolução adaptativa em meios com os fatores estressantes em intensidades crescentes no transcorrer de 80 gerações. Ao final da evolução buscou-se variantes prevalentes na população de híbridos, os quais foram submetidos a novos procedimentos seletivos com imposições de várias condições estressantes. Igualmente foram conduzidos cruzamentos direcionados entre haplóides mediante micromanipulação, sendo tais híbridos submetidos ao mesmo procedimento seletivo nos meios estressantes. Assim, a partir de 230 haplóides das 3 linhagens, 174 isolados (120 oriundos dos cruzamentos massais e 54 dos cruzamentos direcionados) foram pré-selecionados pela maior tolerância aos meios seletivos, tendo os seus cariótipos estabelecidos mediante a cariotipagem eletroforética. Os isolados com maior tolerância (27) foram novamente avaliados em fermentações com reciclo de células e sob condições de elevado teor alcoólico (até 14,5% v/v) em mosto de melaço e água. Em todas as etapas da seleção os isolados foram comparados com as linhagens parentais (CAT-1, PE-2 e SA-1), sendo que ao final do processo seletivo destacou-se a linhagem 35B (híbrido entre CAT-1 e PE-2) com atributos fermentativos superiores aos exibidos pelos parentais. Tais atributos fermentativos contemplaram parâmetros bioquímicos, fisiológicos e tecnológicos (rendimento em etanol, viabilidade celular, crescimento em biomassa, formação de glicerol e teores celulares de carboidratos de reserva glicogênio e trealose). Os resultados permitem sugerir que devido às características fermentativas desejáveis do híbrido 35B, o mesmo possa ser empregado no processo industrial para ser avaliado como uma promissora linhagem a conduzir a fermentação com alto teor alcoólico. / Ethanol contributes significantly to the energy country matrix, which presents itself as extremely favorable to the share of renewable energy. The demand for this biofuel is increasing and technologies for its production in a sustainable way is of paramount importance such as fermentation with very high gravity, already used in some countries. Yeast strains tolerant to multiple stresses greatly contributed to the deployment of such technology in Brazil. In this context the present work is inserted, which seeks yeast strains capable of withstanding the stresses imposed by high ethanol content fermentation. In order that, three of the best industrial strains of Saccharomyces cerevisiae currently available (CAT-1, PE-2 and SA-1), were used in a program to select hybrids with tolerance towards multiples stresses: ethanolic, osmotic and acid, besides other factors involved in a high ethanol content fermentation. These strains were sporulated and dissected to obtain haploid cells, which were submitted to inter- and intra-strains crossings. Hybrids from polycrossings (random crossings) were subjected to an adaptative evolution in media with increasing stressing action over the course of 80 generations. At the end of evolution, prevalent variants were sought in the hybrids population, and submitted to new selective procedures with several stressing conditions. In the same way, directed crossings (between identified haplois) were performed by micromanipulation, and the resulting hybrids were subjected to the same selective procedure. Therefore, from 230 haploid from the 3 parent strains, 174 were isolated (120 from polycrossings and 54 from directed crossings) and pre-selected for higher tolerance in selective media; moreover their karyotypes were established by electrophoretic karyotyping. Strains showing greater tolerance (27) were again evaluated during cell recycling fermentations with high ethanol content (up to 14.5% v/v) using must formulated with water and molasses. At all stages, the isolates were compared with the parental strains (CAT-1, PE-2 and SA-1), and at the end of the selection process, the strain 35B (hybrid between CAT-1 and PE-2) standed out with fermentative attributes higher than the parentals. The fermentative performance was assessed by biochemical, physiological and technological parameters (ethanol efficiency, cell viability, biomass gain, glycerol formation and cellular levels of reserve carbohydrates - glycogen and trehalose). The results suggest that due to desirable fermentation traits, the hybrid 35B, could be used as starter in industrial fermentation process with high ethanol content.

O etanol contribui significativamente para que a matriz energética do país se apresente extremamente favorável quanto à participação da energia renovável. A demanda por este biocombustível é crescente e tecnologias que permitam a sua produção de forma sustentável é de suma importância, como a fermentação com alto teor de etanol, já empregada em alguns países. Linhagens de leveduras com tolerância a múltiplos estresses muito contribuíram para a implantação de tal tecnologia no Brasil. Neste contexto se insere o presente trabalho, o qual busca linhagens de leveduras capazes de suportar os estresses impostos por uma fermentação com alto teor alcoólico. Para tal, 3 entre as melhores linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae atualmente disponíveis (CAT-1, PE-2 e SA- 1), foram utilizadas num programa para a seleção de híbridos para tolerância múltipla aos estresses etanólico, osmótico, ácido, além de outros, inerentes à fermentação com alto teor de etanol. Estas linhagens foram esporuladas e dissecadas para obtenção de células haplóides, as quais foram submetidas a cruzamentos entre- e intra-linhagens. Foram conduzidos cruzamentos massais (aleatórios) cujos produtos foram submetidos à evolução adaptativa em meios com os fatores estressantes em intensidades crescentes no transcorrer de 80 gerações. Ao final da evolução buscou-se variantes prevalentes na população de híbridos, os quais foram submetidos a novos procedimentos seletivos com imposições de várias condições estressantes. Igualmente foram conduzidos cruzamentos direcionados entre haplóides mediante micromanipulação, sendo tais híbridos submetidos ao mesmo procedimento seletivo nos meios estressantes. Assim, a partir de 230 haplóides das 3 linhagens, 174 isolados (120 oriundos dos cruzamentos massais e 54 dos cruzamentos direcionados) foram pré-selecionados pela maior tolerância aos meios seletivos, tendo os seus cariótipos estabelecidos mediante a cariotipagem eletroforética. Os isolados com maior tolerância (27) foram novamente avaliados em fermentações com reciclo de células e sob condições de elevado teor alcoólico (até 14,5% v/v) em mosto de melaço e água. Em todas as etapas da seleção os isolados foram comparados com as linhagens parentais (CAT-1, PE-2 e SA-1), sendo que ao final do processo seletivo destacou-se a linhagem 35B (híbrido entre CAT-1 e PE-2) com atributos fermentativos superiores aos exibidos pelos parentais. Tais atributos fermentativos contemplaram parâmetros bioquímicos, fisiológicos e tecnológicos (rendimento em etanol, viabilidade celular, crescimento em biomassa, formação de glicerol e teores celulares de carboidratos de reserva glicogênio e trealose). Os resultados permitem sugerir que devido às características fermentativas desejáveis do híbrido 35B, o mesmo possa ser empregado no processo industrial para ser avaliado como uma promissora linhagem a conduzir a fermentação com alto teor alcoólico. / Ethanol contributes significantly to the energy country matrix, which presents itself as extremely favorable to the share of renewable energy. The demand for this biofuel is increasing and technologies for its production in a sustainable way is of paramount importance such as fermentation with very high gravity, already used in some countries. Yeast strains tolerant to multiple stresses greatly contributed to the deployment of such technology in Brazil. In this context the present work is inserted, which seeks yeast strains capable of withstanding the stresses imposed by high ethanol content fermentation. In order that, three of the best industrial strains of Saccharomyces cerevisiae currently available (CAT-1, PE-2 and SA-1), were used in a program to select hybrids with tolerance towards multiples stresses: ethanolic, osmotic and acid, besides other factors involved in a high ethanol content fermentation. These strains were sporulated and dissected to obtain haploid cells, which were submitted to inter- and intra-strains crossings. Hybrids from polycrossings (random crossings) were subjected to an adaptative evolution in media with increasing stressing action over the course of 80 generations. At the end of evolution, prevalent variants were sought in the hybrids population, and submitted to new selective procedures with several stressing conditions. In the same way, directed crossings (between identified haplois) were performed by micromanipulation, and the resulting hybrids were subjected to the same selective procedure. Therefore, from 230 haploid from the 3 parent strains, 174 were isolated (120 from polycrossings and 54 from directed crossings) and pre-selected for higher tolerance in selective media; moreover their karyotypes were established by electrophoretic karyotyping. Strains showing greater tolerance (27) were again evaluated during cell recycling fermentations with high ethanol content (up to 14.5% v/v) using must formulated with water and molasses. At all stages, the isolates were compared with the parental strains (CAT-1, PE-2 and SA-1), and at the end of the selection process, the strain 35B (hybrid between CAT-1 and PE-2) standed out with fermentative attributes higher than the parentals. The fermentative performance was assessed by biochemical, physiological and technological parameters (ethanol efficiency, cell viability, biomass gain, glycerol formation and cellular levels of reserve carbohydrates - glycogen and trehalose). The results suggest that due to desirable fermentation traits, the hybrid 35B, could be used as starter in industrial fermentation process with high ethanol content.

O aumento da participação dos biocombustíveis na matriz energética mundial pode ajudar a prolongar a existência das reservas de petróleo, mitigar as ameaças representadas pela mudança climática e permitir melhor segurança do fornecimento de energia em uma escala global. Neste cenário, o processo brasileiro da produção de etanol a partir da cana-de-açúcar tem ganhado papel de destaque, pelo alto rendimento e baixo custo da produção. Linhagens de S. cerevisiae são amplamente empregadas nas fermentações industriais e, embora sejam consideradas mais tolerantes em relação a outras, o processo brasileiro impõe uma variedade de fatores estressantes sob a mesma, afetando o seu metabolismo e crescimento. A fermentação com alto teor alcoólico, realizada a partir da utilização de mostos contendo altas concentrações de açúcares, é uma das maneiras mais eficientes de se obter elevados níveis de etanol. No entanto, tal tecnologia procede ocasionando efeitos deletérios adicionais à levedura. Neste contexto, aumentar a tolerância da levedura é de fundamental importância para alcançar um desempenho fermentativo satisfatório. Neste estudo foram avaliadas linhagens de S. cerevisiae, isogênicas a linhagem industrial CAT-1, com a sobre-expressão dos genes TRP1 e MSN2, envolvidos na biossíntese de triptofano e na resposta geral ao estresse, respectivamente. Tais linhagens foram avaliadas quanto ao seu potencial para realizar fermentações com alto teor alcoólico, simulando as condições industriais brasileiras. Os resultados revelaram que o gene MSN2, na versão truncada, favoreceu a linhagem principalmente com relação ao estresse osmótico, aumentando a velocidade de fermentação e o consumo de açúcares. O gene TRP1 promoveu maior crescimento da linhagem em meio YEPD com 8% de etanol, contudo, tornou a linhagem menos viável em concentrações acima deste nível. No presente trabalho também foi avaliado o efeito da suplementação de aminoácidos na fisiologia da linhagem CAT-1 em meio YNB e em mostos de melaço e xarope de cana-de-açúcar. A suplementação com histidida promoveu maior crescimento e viabilidade celular nos diferentes meios testados. Além de histidina, os aminoácidos lisina e alanina aumentaram o crescimento da CAT-1 em mosto de melaço. A suplementação de triptofano e asparagina também promoveu aumento da viabilidade celular em mosto de xarope. Por outro lado, nos testes em microplacas a suplementação com cisteína depreciou o crescimento da linhagem em meio YNB com 10 e 12% de etanol e em mosto de melaço com 20% de ART. Os resultados obtidos indicam que tanto a engenharia genética, quanto a suplementação de aminoácidos podem ser alternativas viáveis para aumentar a tolerância de S. cerevisiae, para suportar condições de múltiplo estresse, encontradas em destilarias brasileiras. / The expansion biofuels participation in the world energy matrix would help to extend the existence of fossil fuel reservoirs, mitigate the threats of climate change, and enable a better security of energy supply. The Brazilian process of ethanol production from sugarcane has gained an important role in the global energy scenario, for the high yield and low production cost. S. cerevisiae species is widely used in industrial fermentations for being resistant, but the Brazilian process imposes a variety of stressing factors to the yeast, affecting its metabolism and growth. The Very High Gravity Fermentation is performed by the utilization of musts with high sugar concentration and is one of the most efficient ways for obtaining high ethanol levels. However, this technology causes additional deleterious effects to the yeast. In this context, increasing yeast tolerance is of fundamental importance for a satisfactory fermentative performance. In this study we assessed S. cerevisiae strains - isogenic to the industrial strain CAT-1 - with over expression of TRP1 and MSN2 genes involved to tryptophan biosynthesis and in general stress response, respectively. These strains were evaluated for their potential to perform fermentations with high ethanol content, simulating the conditions of Brazilian distilleries. The results showed that the MSN2 gene in the truncated version improved strain mainly to respond to the osmotic stress, increasing in fermentation velocity and the consumption of sugars. The TRP1 gene overexpression promoted higher growth in YEPD medium with 8% ethanol, however, decreased viability at concentrations above this level. The present work also evaluated the effect of amino acid supplementation on the physiology of the CAT-1 strain in YNB medium and in molasses and syrup of sugarcane. Histidide supplementation increased the growth and cell viability in the different media tested. In addition to histidine, the amino acids lysine and alanine increased the growth of CAT-1 in molasses. Supplementation of tryptophan and asparagine also promoted increased cell viability in sugarcane syrup. On the other hand, in microplate assays, cysteine supplementation decreased growth in YNB medium with 10 and 12% ethanol, and in molasses with 20% ART. The results indicate that both genetic engineering and amino acid supplementation may be viable alternatives to increase tolerance of S. cerevisiae to supporting multiple stress conditions typical in Brazilian distilleries.

O aumento da participação dos biocombustíveis na matriz energética mundial pode ajudar a prolongar a existência das reservas de petróleo, mitigar as ameaças representadas pela mudança climática e permitir melhor segurança do fornecimento de energia em uma escala global. Neste cenário, o processo brasileiro da produção de etanol a partir da cana-de-açúcar tem ganhado papel de destaque, pelo alto rendimento e baixo custo da produção. Linhagens de S. cerevisiae são amplamente empregadas nas fermentações industriais e, embora sejam consideradas mais tolerantes em relação a outras, o processo brasileiro impõe uma variedade de fatores estressantes sob a mesma, afetando o seu metabolismo e crescimento. A fermentação com alto teor alcoólico, realizada a partir da utilização de mostos contendo altas concentrações de açúcares, é uma das maneiras mais eficientes de se obter elevados níveis de etanol. No entanto, tal tecnologia procede ocasionando efeitos deletérios adicionais à levedura. Neste contexto, aumentar a tolerância da levedura é de fundamental importância para alcançar um desempenho fermentativo satisfatório. Neste estudo foram avaliadas linhagens de S. cerevisiae, isogênicas a linhagem industrial CAT-1, com a sobre-expressão dos genes TRP1 e MSN2, envolvidos na biossíntese de triptofano e na resposta geral ao estresse, respectivamente. Tais linhagens foram avaliadas quanto ao seu potencial para realizar fermentações com alto teor alcoólico, simulando as condições industriais brasileiras. Os resultados revelaram que o gene MSN2, na versão truncada, favoreceu a linhagem principalmente com relação ao estresse osmótico, aumentando a velocidade de fermentação e o consumo de açúcares. O gene TRP1 promoveu maior crescimento da linhagem em meio YEPD com 8% de etanol, contudo, tornou a linhagem menos viável em concentrações acima deste nível. No presente trabalho também foi avaliado o efeito da suplementação de aminoácidos na fisiologia da linhagem CAT-1 em meio YNB e em mostos de melaço e xarope de cana-de-açúcar. A suplementação com histidida promoveu maior crescimento e viabilidade celular nos diferentes meios testados. Além de histidina, os aminoácidos lisina e alanina aumentaram o crescimento da CAT-1 em mosto de melaço. A suplementação de triptofano e asparagina também promoveu aumento da viabilidade celular em mosto de xarope. Por outro lado, nos testes em microplacas a suplementação com cisteína depreciou o crescimento da linhagem em meio YNB com 10 e 12% de etanol e em mosto de melaço com 20% de ART. Os resultados obtidos indicam que tanto a engenharia genética, quanto a suplementação de aminoácidos podem ser alternativas viáveis para aumentar a tolerância de S. cerevisiae, para suportar condições de múltiplo estresse, encontradas em destilarias brasileiras. / The expansion biofuels participation in the world energy matrix would help to extend the existence of fossil fuel reservoirs, mitigate the threats of climate change, and enable a better security of energy supply. The Brazilian process of ethanol production from sugarcane has gained an important role in the global energy scenario, for the high yield and low production cost. S. cerevisiae species is widely used in industrial fermentations for being resistant, but the Brazilian process imposes a variety of stressing factors to the yeast, affecting its metabolism and growth. The Very High Gravity Fermentation is performed by the utilization of musts with high sugar concentration and is one of the most efficient ways for obtaining high ethanol levels. However, this technology causes additional deleterious effects to the yeast. In this context, increasing yeast tolerance is of fundamental importance for a satisfactory fermentative performance. In this study we assessed S. cerevisiae strains - isogenic to the industrial strain CAT-1 - with over expression of TRP1 and MSN2 genes involved to tryptophan biosynthesis and in general stress response, respectively. These strains were evaluated for their potential to perform fermentations with high ethanol content, simulating the conditions of Brazilian distilleries. The results showed that the MSN2 gene in the truncated version improved strain mainly to respond to the osmotic stress, increasing in fermentation velocity and the consumption of sugars. The TRP1 gene overexpression promoted higher growth in YEPD medium with 8% ethanol, however, decreased viability at concentrations above this level. The present work also evaluated the effect of amino acid supplementation on the physiology of the CAT-1 strain in YNB medium and in molasses and syrup of sugarcane. Histidide supplementation increased the growth and cell viability in the different media tested. In addition to histidine, the amino acids lysine and alanine increased the growth of CAT-1 in molasses. Supplementation of tryptophan and asparagine also promoted increased cell viability in sugarcane syrup. On the other hand, in microplate assays, cysteine supplementation decreased growth in YNB medium with 10 and 12% ethanol, and in molasses with 20% ART. The results indicate that both genetic engineering and amino acid supplementation may be viable alternatives to increase tolerance of S. cerevisiae to supporting multiple stress conditions typical in Brazilian distilleries.