京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24983号 / 生博第512号 / 新制||生||68(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 荒木 崇, 教授 鈴木 淳, 教授 谷口 雄一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Le Laboratoire de Recherche en Nanosciences EA 4682 s’est récemment équipé de la microscopie à force atomique haute-vitesse (HS-AFM) permettant la visualisation en temps réel des dynamiques d’interactions d’un panel infini d’échantillons biologiques à l’échelle nanométrique. De nombreux champ de recherche nécessite la mise au point de techniques permettant à la fois une imagerie dynamique (vidéomicroscopie) mais également de plus en plus une imagerie haute résolution (microscopie champ proche). Ce couplage a été récemment obtenu grâce au développement de la microscopie à force atomique ultra-rapide. La limitation actuelle de ce microscope ultra-rapide, à savoir l’acquisition d’informations en relation uniquement avec la surface de l’objet biologique étudié, crée un rempart à l’obtention de connaissances nouvelles sur les dynamiques sous-jacentes que renferment certains systèmes biomoléculaires. Pour s’affranchir de cette contrainte, nous nous proposons dans ce projet de faire évoluer notre outil de nanocaractérisation en lui ajoutant des fonctionnalités optiques et des fonctionnalités permettant de faire de la spectroscopie de force. La conduite de ce projet se fera selon un travail de développement instrumental scindé en deux grandes étapes : - l’apport d’outils de microscopie optique conventionnels : FRAP – FRET – FLIM – Fluorescence – TIRFM. Nous couplons ainsi la nanocaractérisation hautement résolue spatialement et temporellement avec des informations intrinsèques de nos échantillons. Cette complémentarité apparaît de plus en plus comme fondamentale dans les demandes des biologistes. - la mise au point de protocoles de fonctionnalisation de leviers AFM afin de réaliser de la spectroscopie de force et ainsi obtenir des informations sur les propriétés mécaniques des échantillons biologiques. Ce projet de recherche sera réalisé au Laboratoire de Recherche en Nanosciences EA 4682, Université de Reims Champagne Ardenne sous la direction du Pr. Michael Molinari et du Dr. Maxime Ewald récemment recruté en tant que maître de conférences (sept. 2013) et qui pu démarrer la thématique de la microscopie AFM haute-vitesse au sein de l’équipe. Il s’effectuera en collaboration avec le Pr. T. Ando du Biophysics Lab’ de l’Université de Kanazawa (Japon) pour la partie instrumentation, et avec le Dr. Gabriel Paës pour l’étude des échantillons biologiques. Les objets étudiés lors de cette thèse seront liés au projet ANR Lignoprog qui vient de démarrer au 1er novembre 2014 porté par Dr. Gabriel Paës (INRA UMR FARE, Reims). Dans ce projet, des échantillons biologiques se doivent d’être caractériser en dynamique. Ils concernent la biomasse lignocellulosique (BL), réseau complexe de polymères constituant les parois végétales (PV). La complexité architecturale et chimique de la BL est un frein à sa conversion industrielle. Pour atteindre ce but, non seulement la fraction cellulosique mais aussi les fractions hémicellulosiques et ligneuses doivent être valorisées, sinon les bio-raffineries ne seront pas compétitives. Le principal challenge à relever est celui du coût élevé et de la relative faible efficacité de l’étape de déconstruction enzymatique de la BL. Avec les fonctionnalités d’imagerie développées dans ce projet, nous espérons apporter des éléments de réponses sur la déconstruction enzymatique. Par ailleurs, même si les objets étudiés seront principalement ceux du projet Lignoprog, une validation du dispositif pourra être réalisée en parallèle sur d’autres échantillons biologiques tels que des cellules vivantes seront envisagées : caractérisation, mise en évidence leur réactivité vis-à-vis des divers paramètres physiologiques du milieu (pH, concentration, composition), corrélation de ces résultats avec leurs propriétés mécaniques. / Our laboratory recently acquired a high-speed atomic force microscope (HS-AFM) which enables us to visualize in real time a wide range of biological samples and their dynamics of interaction at nanoscale. Several research fields require the development of new techniques in order to get high resolution imaging and dynamic imaging at the same time. This is why HS-AFM was developed. Its current limitation is that the only data it provides are about the surface which means we can’t get access to what occurs beneath. This is limiting the knowledge we could get about the underlying dynamics of some biomolecular system. In order to overcome this issue, we propose to upgrade this nanocharacterization tool by combining optical microscopy and force spectroscopy. This project of instrumental development will be in two major steps: - the adding of conventional optical microscopy : fluorescence, TIRFM, FRAP, FRET, FLIM. The aim is to nanocharacterize sample with highly spatiotemporal data combined in combination with integral data (fundamental to respond to biological issues) - the development of tip functionalization protocols in order to achieve force spectroscopy and get mechanical properties of biological samples This project will take place at the Laboratory of Research in Nanosciences, EA 4682, University of Reims Champagne Ardennes, under the supervision of Pr. Michael Molinari and Dr. Maxime Ewald who started HS-AFM among our team. We will collaborate with Pr. T. Ando from the Biophysics Lab of Kanazawa University (Japan) for the instrumental part and with Dr. Gabriel Paës for the biological samples. The samples used during this thesis will be linked to an ANR project called Lignoprog directed by Dr. Gabriel Paës (INRA, UMR FARE, Reims) and started on the first of November, 2014. In the project, the dynamical aspect of the biological samples is essential. Indeed, lignocellulosic biomass is a complex network of polymers composing plant cell wall. Its architectural and chemical complexity prevents its industrial conversion. In order to be cost-effective, bio refineries need to valorize all the fractions: cellulose, hemicelluloses and lignins. The major challenge is the high cost and low efficiency of the enzymatic hydrolysis of the lignocellulosic biomass. Our aim is to bring some answer to understand better and improve enzymatic hydrolysis thanks to the HS-AFM and the combination of new functionalities. By the way, the disposal might be validated on other biological samples in parallel, such as live cells in order to characterize them, enlighten their reactivity in response to physiological parameters of the medium (pH, concentration, composition) and correlate the results with mechanical properties.

De nombreuses fonctions de la membrane plasma dépendent de manière vitale de sa structure et de sa dynamique. L’observation d’une diffusion anomale in vivo et in vitro par l’utilisation de la microscopie en fluorescence et par le pistage de particules Isolées ont permis de développer notre conception de la membrane, en la faisant passer d’un fluide homogène à deux couches avec des protéines se diffusant librement, à une mosaïque extrêmement organisée, surpeuplée et agglomérée de lipides et de protéines. Malheureusement, il n’a pas été possible d’apparenter les diffusions anomales à des détails moléculaires en raison du manque de capacité d’observation moléculaire directe et unmarqués Dans cotre cas, nous utilisons la microscopie à force atomique à grande vitesse, et une méthodologie d’analyse innovante pour analyser le pore en formant la protéine Lysine dans un environnement surpeuplé et nous documentons l’existence de différents régimes de diffusion au sein de la même membrane. Nous montrons la formation de phases locales de verre, où les protéines sont attrapées dans des cages formées par proximité cages sur des échelles de temps allant jusqu’à 10 s, ce qui n’avait pas été antérieurement observé de manière expérimentale pour les membranes biologiques. De plus, autour de patchs d’apparence solide et de molécules immobiles nous avons pu détecter une phase du verre plus lente qui mène à l’emprisonnement de la protéine et à la création d’un périmètre de diffusion de la membrane diminué . / Many functions of the plasma membrane depend critically on itsstructure and dynamics. Observation of anomalous diffusion in vivo and in vitro usingfluorescence microscopy and single particle tracking has advanced our concept of themembrane from a homogeneous fluid bilayer with freely diffusing proteins to a highlyorganized crowded and clustered mosaic of lipids and proteins. Unfortunately,anomalous diffusion could not be related to local molecular details given the lack ofdirect and unlabeled molecular observation capabilities. Here, we use high-speedatomic force microscopy and a novel analysis methodology to analyze the poreforming protein lysenin in a highly crowded environment and document coexistenceof several diffusion regimes within one membrane. We show the formation of localglassy phases, where proteins are trapped in neighbor-formed cages for time scales upto 10 s, which had not been previously experimentally reported for biologicalmembranes. Furthermore, around solid-like patches and immobile molecules aslower glass phase is detected leading to protein trapping and creating a perimeter ofdecreased membrane diffusion.

La microscopie à force atomique (AFM) permet de visualiser la topographie d’échantillons organiqueset inorganiques à l’échelle atomique. Les innovations les plus récentes offrent désormais la possibilitéd’accéder aux propriétés nano-mécaniques des échantillons (élasticité, adhésion…). Son panel defonctionnalités permet de pallier aux besoins des nanotechnologies, tant dans les domaines de laphysique, de la chimie que de la biologie.Cependant, les besoins nécessaires à la compréhension des processus biologiques imposent aumicroscope à force atomique des vitesses d’acquisitions rapides, inférieures à la seconde par image. Leséquipements classiques n’offrent pas cette possibilité. C’est pour s’affranchir de ce verrou technologique,pour l’étude dynamique, qu’un prototype de microscope à force atomique à haute-vitesse a étédéveloppé (HS-AFM) en partenariat avec l’équipe du Professeur T. Ando à l’Université de Kanazawa(Japon). Il permet d’atteindre des vitesses de balayage identiques aux vitesses vidéos : 25-50 images/s, enmilieu liquide. Le dispositif est en perpétuelle amélioration : nouvelle boucle d’asservissement, domainesde balayage augmentés. La haute résolution est, quant à elle, assurée par des leviers miniaturisés munisde sur-pointes en carbone. Parallèlement à l’innovation du microscope en lui-même, des modulescomplémentaires ont été développés : module pousse seringue et module chauffant.Le potentiel de ce prototype, développé dans le cadre d’un programme ANR PNANO 2008 HSnanobio-Imaging, a été montré via l’étude d’une petite protéine de choc thermique : la protéine sHspLo18. Cette protéine, issue de la bactérie lactique Oenococcus oeni, offrait la possibilité d’étudier deschangements de degrés d’oligomérisation en fonction du pH, ainsi que le rôle chaperon et lipochaperonen cas de stress environnemental d’autres complexes biologiques. L’utilisation des techniques demicroscopie couplée à des études biochimiques sur ce modèle protéique a permis d’appréhender l’effetdes surfaces sur l’adsorption et la dynamique des complexes biologiques. L’interaction protéine – surfacea pu être approchée et s’avère utile au développement des capteurs à protéines / The atomic force microscopy (AFM) gives access to the topography of organic and inorganic samplesat the atomic scale. The latest innovations offer the possiblity to understand the sample nano-mechanicalproperties (elasticity, adhesion...). Its feature set allows overcoming the demands of nanotechnology,both in the fields of physics, chemistry and biology.However, understanding biological processes require faster acquisitions for the atomic forcemicroscopy, less than a second per frame. As conventional equipment does not offer the possibility toovercome the constraint of time for dynamical studies, a prototype of high-speed atomic forcemicroscope (HS-AFM) was developed in partnership with Professor T. Ando group of Kanazawa University(Japan). It can reach scanning video speed: 25-50 frames/s in a liquid medium. The device is beingconstantly improved: new feedback control, larger scanning sizes. The resolution is provided byminiaturized cantilevers with carbon EBD-tips. In parallel to innovative modules on the microscope, addonshave been developed: syringe pump and heating modules.The potential of the prototype, developed within the framework of the program ANR PNANO 2008HS-nanobio-Imaging, has been shown through the study of a small heat shock protein: the protein sHspLo18. This protein, from the lactic acid bacterium Oenococcus oeni, offered the possibility of a variouschanges of oligomerization degrees according to the pH, and also the chaperone and lipochaperon activityof protein under the influence of an environmental stress. The use of these techniques of microscopiescoupled with biochemical studies on this proteic model allowed to dread the effect of surfaces on theadsorption and the dynamics of biological complexes. The interaction protein – surface coulb be toapprehend and proves to be useful for the development of protein sensors developed in the laboratory

Le microscope à force atomique (AFM) fait partie des microscopies de champ proche dites à sonde locale. De par sa versatilité, un grand nombre de domaines des nanosciences tant en physique, que chimie ou biologie utilisent cette technique. Cependant, le champ d’investigation de la microscopie AFM classique est restreint temporellement et spatialement. En effet, en raison de sa limite de vitesse d’acquisition d’image et sa limite de caractérisation des interactions en surface, des études de dynamique moléculaire ou d’éléments sub-surface ne sont pas envisageables. Nous montrons donc que la caractérisation en volume est permise en utilisant une méthode d’imagerie non destructive, la microscopie de champ proche holographique ultrasonore (SNFUH). Cette méthode développée pour étudier à l.air et en liquide, a fourni des informations localisées en profondeur avec une haute résolution spatiale, en utilisant des fréquences de résonance dans la gamme du MHz. Une calibration a été effectuée sur des échantillons de structures enterrées ou non, réalisés par lithographie e-beam. Ces échantillons ont été utilisés pour ajuster les fréquences de résonance et comprendre la formation des images en mode acoustique (profondeur investiguée et inversion de contraste). Cet outil non invasif et innovant de caractérisation a donc été développé. Il présente un énorme potentiel pour des échantillons biologiques en termes de résolution et d’information. Les microscopes AFMclassique et acoustique SNFUH sont soumis à des contraintes de temps. Pour s’en affranchir, un prototype, le microscope à force atomique haute-vitesse (HS-AFM) a été développé par l’équipe du Professeur T. Ando à l’Université de Kanazawa (Japon). Il autorise ainsi le balayage à vitesse vidéo, i.e. 25 images/s, en milieu liquide. Nous avons amélioré le prototype avec une nouvelle génération de boucle d’asservissement et augmenté la zone de caractérisation. La résolution dépend fortement du levier utilisé. De plus une qualité d’image supérieure est obtenue grâce à l’utilisation de surpointes en carbone sur ces mêmes leviers. Finalement, nous montrons des résultats obtenus avec ces deux techniques de microscopies sur différents édi.ces biologiques en milieu liquide. Ainsi, avec le microscope AFM haute-vitesse, des dynamiques biomoléculaires ont pu être visualisées (ex : structures protéine-ADN) avec une résolution nanométrique. Puis une étude des changements conformationnels intracellulaires de kératinocytes vivantes dans leur milieu physiologique a été réalisée par microscopie acoustique SNFUH et montre la dégradation du matériel biologique. L’ensemble de ces résultats ouvre un nouveau champ d’investigation dans le domaine de la biologie. / The atomic force microscope (AFM) made part of scanning near-field probe microscopy. Thanks to its versatility, many fields as physics, chemistry or biology use this technique. However, the field of investigation of the classical AFM microscope is limited temporally and spatially. Indeed, due to his scan speed limitation and surface interaction caracterisation limitation, studies of molecular dynamics and sub-surface elements are not possible. We show that the volume caracterisation is permitted using a non-destructive imaging method, called Scanning Near-Field by Ultrasound Holography (SNFUH). This tool developed for study in air and liquid has provided depth information as well as spatial resolution at the nanometer scale using resonant frequencies of about range of MHz. Calibration has been performed on samples of buried or not structures made by e-beam lithography and have been used to adjust the resonant frequency and understand the acoustic image formation (depth investigation and contrast in-version). We have developed a non-invasive and innovative tool of characterization for biology : he presents a huge potential for biological samples in terms of resolution and information. Classical AFM and acoustic SNFUH microscopes are time resolution limited. To overcome this time constraint, a prototype, High Speed Atomic Force Microscope (HS-AFM), has been developed by the team of Prof. T. Ando, Kanazawa University (Japan). It allows a scan rate at video speed, i.e. 25 frames/s, in liquid medium. We have improved the prototype, through a new generation of feedback control and increased the scan area. The resolution depends strongly of the probe used. Moreover a better image quality is obtained through the use of carbon tips on these cantilevers. Finally, we show our results obtained with these two microscopy techniques about biological buildings in liquid environment. Thereby, with the HS-AFM microscope, biomolecular dynamics have been visualized (e.g. protein-DNA structures) with nanometric resolution. Then a study about intracellular conformational changes of keratinocytes living cells in their physiological medium has been realized by acoustic microscopy SNFUH and show deterioration of biological components. All of these results provide new insights in biology field.

Ce travail de thèse se focalise sur le couplage du microscope à force atomique haute–vitesse (HS-AFM) et de la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) pour la détection des biomolécules. Nous avons élaboré un protocole de fabrication pour produire les substrats “SERS-actifs”. L’efficacité des substrats de nanoparticules cristalline d’or, d’argent ou bimétallique argent–or a été évaluée. Nous avons étudié l’impact des propriétés optiques et morphologiques des substrats sur l’intensité Raman en analysant des échantillons tests tels que la bipyridine éthylène et le bleu de méthylène. Nous nous sommes interessés à trois problematiques biologiques distinctes par analyses HS-AFM et SERS. Dans un premier cas, nous avons détecté la signature chimique de protéine cytochrome b5. Ce travail a été suivi par des études sur le changement de conformation de la protéine de choc thermique leuconostoc oenos Lo 18 en fonction de la concentration et du pH. La dernière application consiste en l’analyse des interactions membrane – virus. Afin de réaliser les analyses simultanées Raman/AFM, nous avons adapté notre protocole de fabrication pour couvrir la surface des pointes AFM commerciales par des nanoparticules d’or cristallines. Les études de diffusion Raman exaltée par effet de pointe (TERS) ont été effectuées sur les échantillons de disulfure de molybdène pour évaluer la qualité des pointes TERS. Pour finir, nous présentons une nouvelle configuration de couplage HS-AFM et spectroscopie Raman. Nous discutons des modifications et des défis rencontrés. / This thesis focuses on the coupling of High–Speed Atomic Force Microscopy (HS-AFM) and Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) for biomolecule analysis. We have designed a fabrication protocol to manufacture “SERS-active” substrates. The efficacy of gold, silver and gold-silver bimetallic crystalline nanoparticle substrates were evaluated. We have investigated the impact of optical and morphological features of the substrates on Raman signal intensity by analyzing well-known samples such as bipyridine ethylene and methylene blue molecules. We took an interest in three distinct biological problematics with HS-AFM and SERS analyses. First, we have detected the chemical signature of cytochrome b5 protein. This study was followed by the investigation of conformational changes of small heat shock leuconostoc oenos Lo 18 protein in function of pH level and concentrations. The last application consists to the analyse a membrane and a virus interaction. In order to realize simultaneous Raman/AFM analysis, we have adapted our fabrication protocol to cover the surface of commercial AFM probes by crystalline gold nanoparticles. Tip – Enhanced Raman Spectroscopy (TERS) studies were performed on molybdenum disulfide to evaluate the quality of TERS probes. In the last part of this work, we have designed a new setup to combine Ando’s HS-AFM setup with Raman spectroscopy. We present the modifications that have been carried out and the challenges that we have encountered.