Introdução: A incidência de baixa estatura devido a deficiência do hormônio do crescimento (DGH) ocorre em 1:4.000-10.000 nascidos vivos. Diversos fatores de transcrição são necessários para a diferenciação dos cinco tipos de células produtoras de 6 hormônios hipofisários. Mutações nos fatores de transcrição HESX1, GLI2, LHX3, LHX4, SOX2, SOX3, PROP1 e POU1F1 foram descritas em pacientes com deficiência hormonal hipofisária isolada ou múltipla associada ou não a outras malformações. Mutações no gene OTX2, um fator de transcrição responsável pela formação da vesicula ocular e pela hipófise, podem causar malformações oculares tais como anoftalmia e microftalmia, isoladamente ou em associação com DGH isolado (DGHI) ou deficiência hipofisária hormonal múltipla (DHHM). Recentemente, dois pacientes não relacionados com DHHM e neuroipófise ectópica, sem anormalidades oculares foram descritos com mutações em heterozigose no OTX2 sugerindo um papel deste gene na etiologia do hipopituitarismo sem outras características sindrômicas. Objetivo: O objetivo desse trabalho foi o de analisar o gene OTX2 em pacientes com DGHI ou DHHM e correlacionar os achados moleculares com o fenótipo. Pacientes: Foram estudados 125 pacientes com DHHM (6 filhos de pais consangüíneos e 33 com parentes com baixa estatura) e 33 com DGHI (7 filhos de pais consangüíneos e 8 com parentes com baixa estatura). Materiais e métodos: Amostras de DNA dos pacientes foram submetidas à reação de polimerização em cadeia utilizando-se primers intrônicos desenhados para amplificar os 3 exons e as regiões flanqueadoras do gene OTX2. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados pelo método de Sanger. Resultados: Uma nova variante alélica c.689A>T, p.H230L em heterozigose no exon 5 foi encontrado em um único paciente com deficiência de GH, TSH, LH/FSH e ACTH associada a neuroipófise ectópica, sem malformação ocular. A histidina na posição 230 é altamente conservada em todas as espécies de vertebrados, e a análise in silico prediz um efeito prejudicial à estrutura da proteína. A análise da variante na família revelou 8 parentes não afetados como portadores heterozigotos, sugerindo uma doença autossômica dominante com padrão de penetrância incompleta. Esta variante não foi encontrada em 400 alelos de 200 controles brasileiros, porém foi descrito como polimorfismo no banco de dados de SNP em uma população européia americana, com incidência de 1 alelo T, entre 8600 alelos, sendo assim considerado raro. Encontramos também outras quatro variantes alélicas na casuística (c.98-70C> A; c.420G> C, p.P148P; c.435C> T, p.S145S; C * 10G> A), não conservadas entre as espécies. Duas delas levando a troca silenciosa de amino ácidos, sem efeito deletério no sítio exonic splice enhancer. Conclusão A nossa coorte de 158 pacientes é a maior população rastreada para mutações no OTX2 e a detecção de uma variante suspeita em heterozigose em um único paciente portador de hipopituitarismo e neuroipófise ectópica sugere que mutações no OTX2 são uma causa rara de DHHM ou DGHI sem malformação ocular na população estudada. O achado molecular da variante c.689A>T, p.H230L em heterozigose, com padrão de penetrância incompleta é consistente com a observação de que as características fenotípicas de camundongos heterozigotos com perda de função do Otx2 são fortemente influenciados pela background genético, não podendo dessa forma, descartar que outros moduladores genéticos possam ser responsáveis pela penetrância incompleta nessa família. Essa hipótese deverá ser investigada pela análise do exoma do paciente e seus familiares. O fato de a variante estar localizada numa região altamente conservada entre as espécies, sugere que a mesma seja causadora do fenótipo em questão, porém serão necessários os estudos funcionais de transfecção transitória para determinar se se trata de perda de função ou efeito negativo dominante de genes alvos expressos no ectoderme oral ou neural / Introduction: The incidence of short stature due to growth hormone deficiency (GHD) occurs in 1:4.000-10.000 live births. Several transcription factors are required for differentiation of five types of cells producing 6 pituitary hormones. Mutations in the transcription factors HESX1, GLI2, LHX3, LHX4, SOX2, SOX3, PROP1 and POU1F1 have been described in patients with isolated pituitary hormone deficiency or multiple associated or not with other malformations. Mutations in OTX2, a transcription factor responsible for the formation of the eye vesicle and the pituitary gland, can cause ocular malformations such as anophthalmia and microphthalmia, alone or in association with isolated GHD (IGHD) or combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Recently, two unrelated patients with CPHD and ectopic neurohypophysis without ocular abnormalities were described with heterozygous mutations in OTX2 suggesting a role of this gene in the etiology of hypopituitarism without other syndromic features. Objective: The aim of this study was to analyze the OTX2 gene in patients with GHD or CPHD and correlate the molecular findings with the phenotype. Patients: We studied 125 patients with CPHD (6 children of consanguineous parents and 33 relatives with short stature) and 33 with IGHD (7 children of consanguineous parents and 8 relatives with short stature). Materials and methods: DNA samples from the patients were subjected to polymerase chain reaction using intronic primers designed to amplify the 3 exons and flanking regions of the gene OTX2. The PCR products were purified and sequenced by the Sanger method. Results: A new heterozygous allelic variant c.689A> T, p.H230L in exon 5 was found in one patient with deficiencies of GH, TSH, LH / FSH and ACTH associated with ectopic neurohypophysis without ocular malformation. The histidine at position 230 is strongly conserved in all vertebrate species, and in silico analysis predicts a detrimental effect on protein structure. The analysis of the variant in the family revealed eight unaffected relatives as heterozygous carriers, suggesting an autosomal dominant pattern with incomplete penetrance. This variant was not found in 400 alleles of 200 Brazilian controls, but it was described as a polymorphism in the SNP database in a European American population, with an incidence of 1 T allele among 8600 alleles, and therefore considered rare. We also found four other allelic variants in the samples (c.98-70C> A; c.420G> C, p.P148P; c.435C> T, p.S145S; C * 10G> A), not conserved between species. Two of them leading to a silent amino acid exchange, without deleterious effect in the exonic splice enhancer site. Conclusion Our cohort of 158 patients is the largest population screened for mutations in OTX2 and the detection of a suspected heterozygous variant in one patient with hypopituitarism and ectopic neurohypophysis suggests that OTX2 mutations are a rare cause of CPHD/IGHD without ocular malformation in the studied population. The molecular finding of a heterozygous variant c.689A> T, p.H230L, with incomplete penetrance pattern is consistent with the observation that the phenotypic characteristics of mice with heterozygous loss of function of Otx2 are strongly influenced by genetic background, suggesting that other genetic modulators may be responsible for the incomplete penetrance in this family. This hypothesis should be investigated by analysis of exoma in the patient and their family. The fact that the variant is located in a region highly conserved among species suggests that it is causing the phenotype in question, but it will require the functional studies with transient transfections to determine whether it is the loss of function or effect of dominant negative target genes expressed in neural or oral ectoderm

Introdução: A incidência de baixa estatura devido a deficiência do hormônio do crescimento (DGH) ocorre em 1:4.000-10.000 nascidos vivos. Diversos fatores de transcrição são necessários para a diferenciação dos cinco tipos de células produtoras de 6 hormônios hipofisários. Mutações nos fatores de transcrição HESX1, GLI2, LHX3, LHX4, SOX2, SOX3, PROP1 e POU1F1 foram descritas em pacientes com deficiência hormonal hipofisária isolada ou múltipla associada ou não a outras malformações. Mutações no gene OTX2, um fator de transcrição responsável pela formação da vesicula ocular e pela hipófise, podem causar malformações oculares tais como anoftalmia e microftalmia, isoladamente ou em associação com DGH isolado (DGHI) ou deficiência hipofisária hormonal múltipla (DHHM). Recentemente, dois pacientes não relacionados com DHHM e neuroipófise ectópica, sem anormalidades oculares foram descritos com mutações em heterozigose no OTX2 sugerindo um papel deste gene na etiologia do hipopituitarismo sem outras características sindrômicas. Objetivo: O objetivo desse trabalho foi o de analisar o gene OTX2 em pacientes com DGHI ou DHHM e correlacionar os achados moleculares com o fenótipo. Pacientes: Foram estudados 125 pacientes com DHHM (6 filhos de pais consangüíneos e 33 com parentes com baixa estatura) e 33 com DGHI (7 filhos de pais consangüíneos e 8 com parentes com baixa estatura). Materiais e métodos: Amostras de DNA dos pacientes foram submetidas à reação de polimerização em cadeia utilizando-se primers intrônicos desenhados para amplificar os 3 exons e as regiões flanqueadoras do gene OTX2. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados pelo método de Sanger. Resultados: Uma nova variante alélica c.689A>T, p.H230L em heterozigose no exon 5 foi encontrado em um único paciente com deficiência de GH, TSH, LH/FSH e ACTH associada a neuroipófise ectópica, sem malformação ocular. A histidina na posição 230 é altamente conservada em todas as espécies de vertebrados, e a análise in silico prediz um efeito prejudicial à estrutura da proteína. A análise da variante na família revelou 8 parentes não afetados como portadores heterozigotos, sugerindo uma doença autossômica dominante com padrão de penetrância incompleta. Esta variante não foi encontrada em 400 alelos de 200 controles brasileiros, porém foi descrito como polimorfismo no banco de dados de SNP em uma população européia americana, com incidência de 1 alelo T, entre 8600 alelos, sendo assim considerado raro. Encontramos também outras quatro variantes alélicas na casuística (c.98-70C> A; c.420G> C, p.P148P; c.435C> T, p.S145S; C * 10G> A), não conservadas entre as espécies. Duas delas levando a troca silenciosa de amino ácidos, sem efeito deletério no sítio exonic splice enhancer. Conclusão A nossa coorte de 158 pacientes é a maior população rastreada para mutações no OTX2 e a detecção de uma variante suspeita em heterozigose em um único paciente portador de hipopituitarismo e neuroipófise ectópica sugere que mutações no OTX2 são uma causa rara de DHHM ou DGHI sem malformação ocular na população estudada. O achado molecular da variante c.689A>T, p.H230L em heterozigose, com padrão de penetrância incompleta é consistente com a observação de que as características fenotípicas de camundongos heterozigotos com perda de função do Otx2 são fortemente influenciados pela background genético, não podendo dessa forma, descartar que outros moduladores genéticos possam ser responsáveis pela penetrância incompleta nessa família. Essa hipótese deverá ser investigada pela análise do exoma do paciente e seus familiares. O fato de a variante estar localizada numa região altamente conservada entre as espécies, sugere que a mesma seja causadora do fenótipo em questão, porém serão necessários os estudos funcionais de transfecção transitória para determinar se se trata de perda de função ou efeito negativo dominante de genes alvos expressos no ectoderme oral ou neural / Introduction: The incidence of short stature due to growth hormone deficiency (GHD) occurs in 1:4.000-10.000 live births. Several transcription factors are required for differentiation of five types of cells producing 6 pituitary hormones. Mutations in the transcription factors HESX1, GLI2, LHX3, LHX4, SOX2, SOX3, PROP1 and POU1F1 have been described in patients with isolated pituitary hormone deficiency or multiple associated or not with other malformations. Mutations in OTX2, a transcription factor responsible for the formation of the eye vesicle and the pituitary gland, can cause ocular malformations such as anophthalmia and microphthalmia, alone or in association with isolated GHD (IGHD) or combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Recently, two unrelated patients with CPHD and ectopic neurohypophysis without ocular abnormalities were described with heterozygous mutations in OTX2 suggesting a role of this gene in the etiology of hypopituitarism without other syndromic features. Objective: The aim of this study was to analyze the OTX2 gene in patients with GHD or CPHD and correlate the molecular findings with the phenotype. Patients: We studied 125 patients with CPHD (6 children of consanguineous parents and 33 relatives with short stature) and 33 with IGHD (7 children of consanguineous parents and 8 relatives with short stature). Materials and methods: DNA samples from the patients were subjected to polymerase chain reaction using intronic primers designed to amplify the 3 exons and flanking regions of the gene OTX2. The PCR products were purified and sequenced by the Sanger method. Results: A new heterozygous allelic variant c.689A> T, p.H230L in exon 5 was found in one patient with deficiencies of GH, TSH, LH / FSH and ACTH associated with ectopic neurohypophysis without ocular malformation. The histidine at position 230 is strongly conserved in all vertebrate species, and in silico analysis predicts a detrimental effect on protein structure. The analysis of the variant in the family revealed eight unaffected relatives as heterozygous carriers, suggesting an autosomal dominant pattern with incomplete penetrance. This variant was not found in 400 alleles of 200 Brazilian controls, but it was described as a polymorphism in the SNP database in a European American population, with an incidence of 1 T allele among 8600 alleles, and therefore considered rare. We also found four other allelic variants in the samples (c.98-70C> A; c.420G> C, p.P148P; c.435C> T, p.S145S; C * 10G> A), not conserved between species. Two of them leading to a silent amino acid exchange, without deleterious effect in the exonic splice enhancer site. Conclusion Our cohort of 158 patients is the largest population screened for mutations in OTX2 and the detection of a suspected heterozygous variant in one patient with hypopituitarism and ectopic neurohypophysis suggests that OTX2 mutations are a rare cause of CPHD/IGHD without ocular malformation in the studied population. The molecular finding of a heterozygous variant c.689A> T, p.H230L, with incomplete penetrance pattern is consistent with the observation that the phenotypic characteristics of mice with heterozygous loss of function of Otx2 are strongly influenced by genetic background, suggesting that other genetic modulators may be responsible for the incomplete penetrance in this family. This hypothesis should be investigated by analysis of exoma in the patient and their family. The fact that the variant is located in a region highly conserved among species suggests that it is causing the phenotype in question, but it will require the functional studies with transient transfections to determine whether it is the loss of function or effect of dominant negative target genes expressed in neural or oral ectoderm

Introdução: Alterações em genes relacionados com a secreção de GH ou a organogênese hipofisária foram identificadas em pacientes com deficiência de hormônio do crescimento (DGH) congênita. Entretanto, poucos casos de DGH têm sua etiologia esclarecida. O GHRH é um candidato óbvio para explicar a deficiência isolada de GH (DIGH). Na literatura, os estudos de análise do GHRH não conseguiram identificar mutações, porém são antigos e utilizaram uma metodologia com limitações. A maioria dos pacientes com deficiência hipotálamo-hipofisária múltipla (DHHM) apresenta neuroipófise ectópica sugerindo a importância do estudo de genes que atuam no início do desenvolvimento hipofisário, com expressão inclusive no infundíbulo. O GLI2 é um fator de transcrição na sinalização Sonic Hedgehog, envolvido com o início da embriogênese hipofisária, expresso na bolsa de Rathke primordial e no diencéfalo ventral. Previamente, mutações no GLI2 foram encontradas em pacientes com holoprosencefalia, e também alterações hipofisárias. Objetivos: Analisar o GHRH em 151 pacientes com DIGH (42 brasileiros e 109 encaminhados de centros internacionais) e analisar o GLI2 em 180 pacientes brasileiros com DIGH ou DHHM por PCR e sequenciamento automático dos genes; e descrever o fenótipo dos pacientes com mutações identificadas. Resultados: No GHRH foram identificadas seis variantes em heterozigose com previsão benigna pelas análises in silico. A análise do GLI2 identificou três mutações novas em heterozigose com códon de parada prematuro (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X), e geração de proteínas truncadas, com perda do domínio responsável pela ativação transcricional. A mutação p.L788fsX794 foi identificada numa paciente com baixa estatura, polidactilia, epilepsia e hipoglicemias. Apresentava deficiência de GH, TSH, ACTH, prolactina, LH e FSH. Na investigação familiar foi diagnosticada DIGH em dois tios e DHHM numa prima. Estes familiares, além de sua mãe e outros parentes maternos também apresentaram a mutação e polidactilia. A mutação p.L694fsX722 foi identificada num menino com baixa estatura por deficiência de GH, além de lábio leporino e fenda palatina. Seu pai, embora saudável, também apresentou a mutação. A mutação p.E380X foi identificada numa lactente com retardo no desenvolvimento, hipoglicemias, poliúria e polidipsia. Apresentava deficiência de GH, ACTH, TSH e ADH. Sua mãe aparentemente normal também apresentou a mutação. Todos os pacientes com DGH e mutação no GLI2 apresentaram neuroipófise ectópica (não visualizada na paciente com p.E380X), adenoipófise hipoplásica e ausência de holoprosencefalia na ressonância magnética. Dezoito variantes não-sinônimas também foram identificadas no GLI2 em 24 pacientes. Dezesseis dessas variantes foram consideradas deletérias em pelo menos um programa de predição in silico e dez delas não foram encontradas em população controle. O fenótipo dos pacientes foi predominante de DHHM e com neuroipófise ectópica e sem holoprosencefalia. Variantes silenciosas, intrônicas e polimorfismos foram identificados no GLI2, mas aparentemente sem alteração funcional. Conclusão: Não identificamos mutação no GHRH e se realmente existe mutação neste gene como causa de DGH, deve ser muito rara. Variantes no GLI2 são frequentes (15%), indicando seu importante papel na etiologia da DGH congênita. Além disso, ampliamos o espectro fenotípico dos pacientes com mutações no GLI2, que foi caracterizado por DIGH ou DHHM, inclusive com diabetes insipidus, neuroipófise ectópica (maioria) e ausência de holoprosencefalia. Outras características observadas foram polidactilia, defeito de linha média facial e herança autossômica dominante com penetrância incompleta / Introduction: Alterations in genes related to GH secretion and pituitary organogenesis have been identified in patients with congenital GH deficiency (GHD). However, in only few cases of GHD the etiology has been established. GH-releasing hormone (GHRH) is an obvious candidate to explain isolated GH deficiency (IGHD). Previous reports in the literature did not identify mutations in GHRH, however, the methodology used was limited. Most patients with combined pituitary hormone deficiency (CPHD) have an ectopic posterior pituitary lobe (EPP) suggesting the study of genes involved in early pituitary development and also expressed in the infundibulum. GLI2 is a transcription factor in Sonic hedgehog signaling expressed in the primordial Rathkes pouch and ventral diencephalon during early pituitary development. Previously, GLI2 mutations were found in patients with holoprosencephaly and pituitary abnormalities. Aim: Analyse GHRH in 151 patients with IGHD (42 Brazilian and 101 from international centers) and GLI2 in 180 Brazilian patients with IGHD or CPHD by PCR and automatic sequencing, and describe the phenotype of patients with mutations. Results: In GHRH, six heterozygous variants that are benign according to in silico analysis were identified. GLI2 study revealed three novel heterozygous mutations leading to premature stop codons (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X) and truncated proteins, without the transcriptional activator domain. p.L788fsX794 was identified in a girl with short stature, polydactyly, epilepsy and hypoglycemia. She had GH, TSH, ACTH, prolactina, LH and FSH deficiencies. Two uncles had IGHD and one cousin CPHD. These relatives, the mother and other maternal relatives had polydactyly and carried the mutation. p.L694fsX722 was identified in a boy with short stature due to GHD who also had cleft lip and palate. His healthy father also carried the mutation. p.E380X was identified in an infant with delayed development, hypoglycemia, polyuria and polydipsia. She had GH, ACTH, TSH and ADH deficiencies. Her apparently normal mother also carried the mutation. All patients with GHD and GLI2 mutations had an EPP (not visualized in the patient with p.E380X), hypoplastic anterior pituitary lobe and absence of holoprosencephaly on MRI. Eighteen non-synonymous variants in GLI2 were identified in 24 patients. Sixteen of these were considered deleterious in at least one in silico prediction program and ten of these were not found in the control population. The phenotype was mainly of CPHD and EPP without holoprosencephaly. Several synonymous and intronic GLI2 variants and polymorphisms apparently without functional consequences were identified. Conclusions: No mutations in GHRH were identified and if mutations in this gene exist as a cause of IGHD, they must be very rare. Variants in GLI2 are frequent (15%) indicating its important role in the etiology of GHD. Furthermore, we expanded the clinical spectrum of patients with GLI2 mutations characterized by IGHD or CPHD including diabetes insipidus, ectopic posterior pituitary lobe (in most patients) and absence of holoprosencephaly. Additional features were polydactyly and midline facial defects and the inheritance was autosomal dominant with incomplete penetrance

Estudos em modelos animais transgênicos possibilitaram o conhecimento de parte dos genes envolvidos na embriogênese hipofisária e da etiologia genética do hipopituitarismo em humanos. Entretanto, a etiologia da maior parte dos casos de hipopituitarismo congênito, principalmente os associados à neuro-hipófise ectópica (NE), ainda é pouco definida. Mutações no gene PROP1 são a causa genética mais comum de hipopituitarismo descritas até o momento, mas estão sempre associadas à neuro-hipófise tópica. Estudos destinados a esclarecer o mecanismo molecular da mutação do gene Prop1 em camundongos demonstraram a participação da via de sinalização Notch e de seus componentes, dentre eles, o gene Hes1. O HES1 é um gene que codifica um fator de transcrição que participa de estágios precoces do desenvolvimento hipofisário e está envolvido com a morfogênese da neuro-hipófise. A avaliação do camundongo com nocaute em homozigose deste gene acarreta uma hipoplasia da adeno-hipófise e ausência da neuro-hipófise; e sua expressão constitutiva está associada ao hipopituitarismo. Como a NE é um achado comum no hipopituitarismo congênito e o gene HES1 pode estar relacionado a sua fisiopatologia, a região codificadora do gene HES1 foi avaliada em 192 pacientes com hipopituitarismo congênito. A variante alélica c.578G > A (p.G193D) em heterozigose foi encontrada em um paciente com hipopituitarismo congênito associado à NE. A avaliação da predição in silico do efeito funcional da variante pela ferramenta MutationTaster sugere que a troca do aminoácido glicina, altamente conservado entre os mamíferos, por ácido aspártico, seja deletéria. No estudo da segregação familiar, quatro irmãos aparentemente normais apresentam a mesma variante, sendo que dois deles possuem alterações discretas na imagem da hipófise. Em conclusão, esta é uma nova variante alélica descrita no gene HES1, ausente em grandes bancos de dados e controles saudáveis da população brasileira, mas presente em irmãos não afetados. Estudos funcionais in vitro são necessários para esclarecer o efeito biológico desta variante. Um padrão de herança complexo com penetrância incompleta é possível e já descrito em outros genes associados ao hipopituitarismo. Na tentativa de elucidar a causa genética do hipopituitarismo neste caso, o material genético deste paciente e de seus familiares foram submetidos ao sequenciamento do exoma, mas os resultados estão inconclusivos até o momento / Studies of transgenic animal models have allowed for the discovery of genes involved in human pituitary embryogenesis and the genetic etiology of hypopituitarism. However, the genetic causes of most cases of congenital hypopituitarism, especially those associated with an ectopic posterior pituitary, remain poorly defined. Mutations in the gene PROP1 are the most common genetic causes of hypopituitarism described to date, and are always associated with an ectopic posterior pituitary. Studies to elucidate the molecular mechanisms of Prop1 mutations in mice have demonstrated the involvement of the Notch signaling pathway, including its downstream target Hes1. The HES1 gene encodes a transcription factor that participates in early stages of pituitary development and is involved in posterior pituitary morphogenesis. Hes1 knockout mice exhibit a hypoplastic anterior pituitary and absence of a posterior pituitary. Conversely, constitutive expression of Hes1 is associated with hypopituitarism. Since an ectopic posterior pituitary is commonly found in congenital hypopituitarism and the HES1 gene may be related to its pathophysiology, the coding region of gene HES1 was screened in 192 patients with congenital hypopituitarism. A heterozygous allelic variant c.578G >A (p.G193D) was identified in a patient with congenital hypopituitarism associated with an ectopic posterior pituitary. Assessment by MutationTaster, a bioinformatic tool for in silico prediction of functional effect of missense variants, suggests that substitution of glycine (a highly conserved amino acid in this position among mammals) for aspartic acid is deleterious. In the genetic study of family members, we identified four apparently normal siblings with the same variant, two of which have discrete changes in their pituitary MRI. In conclusion, we described a new allelic variant in the gene HES1, absent in large databases and healthy Brazilian controls, but present in the unaffected siblings. In vitro functional studies are needed to clarify the biological effect of this variant. A complex pattern of inheritance with incomplete penetrance is possible in this case, as it has already been described in other genes associated with hypopituitarism. In an attempt to elucidate the genetic cause of hypopituitarism in the family described, DNA samples of this patient and his family were submitted to exome sequencing, but results are inconclusive at this time

Introdução: Alterações em genes relacionados com a secreção de GH ou a organogênese hipofisária foram identificadas em pacientes com deficiência de hormônio do crescimento (DGH) congênita. Entretanto, poucos casos de DGH têm sua etiologia esclarecida. O GHRH é um candidato óbvio para explicar a deficiência isolada de GH (DIGH). Na literatura, os estudos de análise do GHRH não conseguiram identificar mutações, porém são antigos e utilizaram uma metodologia com limitações. A maioria dos pacientes com deficiência hipotálamo-hipofisária múltipla (DHHM) apresenta neuroipófise ectópica sugerindo a importância do estudo de genes que atuam no início do desenvolvimento hipofisário, com expressão inclusive no infundíbulo. O GLI2 é um fator de transcrição na sinalização Sonic Hedgehog, envolvido com o início da embriogênese hipofisária, expresso na bolsa de Rathke primordial e no diencéfalo ventral. Previamente, mutações no GLI2 foram encontradas em pacientes com holoprosencefalia, e também alterações hipofisárias. Objetivos: Analisar o GHRH em 151 pacientes com DIGH (42 brasileiros e 109 encaminhados de centros internacionais) e analisar o GLI2 em 180 pacientes brasileiros com DIGH ou DHHM por PCR e sequenciamento automático dos genes; e descrever o fenótipo dos pacientes com mutações identificadas. Resultados: No GHRH foram identificadas seis variantes em heterozigose com previsão benigna pelas análises in silico. A análise do GLI2 identificou três mutações novas em heterozigose com códon de parada prematuro (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X), e geração de proteínas truncadas, com perda do domínio responsável pela ativação transcricional. A mutação p.L788fsX794 foi identificada numa paciente com baixa estatura, polidactilia, epilepsia e hipoglicemias. Apresentava deficiência de GH, TSH, ACTH, prolactina, LH e FSH. Na investigação familiar foi diagnosticada DIGH em dois tios e DHHM numa prima. Estes familiares, além de sua mãe e outros parentes maternos também apresentaram a mutação e polidactilia. A mutação p.L694fsX722 foi identificada num menino com baixa estatura por deficiência de GH, além de lábio leporino e fenda palatina. Seu pai, embora saudável, também apresentou a mutação. A mutação p.E380X foi identificada numa lactente com retardo no desenvolvimento, hipoglicemias, poliúria e polidipsia. Apresentava deficiência de GH, ACTH, TSH e ADH. Sua mãe aparentemente normal também apresentou a mutação. Todos os pacientes com DGH e mutação no GLI2 apresentaram neuroipófise ectópica (não visualizada na paciente com p.E380X), adenoipófise hipoplásica e ausência de holoprosencefalia na ressonância magnética. Dezoito variantes não-sinônimas também foram identificadas no GLI2 em 24 pacientes. Dezesseis dessas variantes foram consideradas deletérias em pelo menos um programa de predição in silico e dez delas não foram encontradas em população controle. O fenótipo dos pacientes foi predominante de DHHM e com neuroipófise ectópica e sem holoprosencefalia. Variantes silenciosas, intrônicas e polimorfismos foram identificados no GLI2, mas aparentemente sem alteração funcional. Conclusão: Não identificamos mutação no GHRH e se realmente existe mutação neste gene como causa de DGH, deve ser muito rara. Variantes no GLI2 são frequentes (15%), indicando seu importante papel na etiologia da DGH congênita. Além disso, ampliamos o espectro fenotípico dos pacientes com mutações no GLI2, que foi caracterizado por DIGH ou DHHM, inclusive com diabetes insipidus, neuroipófise ectópica (maioria) e ausência de holoprosencefalia. Outras características observadas foram polidactilia, defeito de linha média facial e herança autossômica dominante com penetrância incompleta / Introduction: Alterations in genes related to GH secretion and pituitary organogenesis have been identified in patients with congenital GH deficiency (GHD). However, in only few cases of GHD the etiology has been established. GH-releasing hormone (GHRH) is an obvious candidate to explain isolated GH deficiency (IGHD). Previous reports in the literature did not identify mutations in GHRH, however, the methodology used was limited. Most patients with combined pituitary hormone deficiency (CPHD) have an ectopic posterior pituitary lobe (EPP) suggesting the study of genes involved in early pituitary development and also expressed in the infundibulum. GLI2 is a transcription factor in Sonic hedgehog signaling expressed in the primordial Rathkes pouch and ventral diencephalon during early pituitary development. Previously, GLI2 mutations were found in patients with holoprosencephaly and pituitary abnormalities. Aim: Analyse GHRH in 151 patients with IGHD (42 Brazilian and 101 from international centers) and GLI2 in 180 Brazilian patients with IGHD or CPHD by PCR and automatic sequencing, and describe the phenotype of patients with mutations. Results: In GHRH, six heterozygous variants that are benign according to in silico analysis were identified. GLI2 study revealed three novel heterozygous mutations leading to premature stop codons (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X) and truncated proteins, without the transcriptional activator domain. p.L788fsX794 was identified in a girl with short stature, polydactyly, epilepsy and hypoglycemia. She had GH, TSH, ACTH, prolactina, LH and FSH deficiencies. Two uncles had IGHD and one cousin CPHD. These relatives, the mother and other maternal relatives had polydactyly and carried the mutation. p.L694fsX722 was identified in a boy with short stature due to GHD who also had cleft lip and palate. His healthy father also carried the mutation. p.E380X was identified in an infant with delayed development, hypoglycemia, polyuria and polydipsia. She had GH, ACTH, TSH and ADH deficiencies. Her apparently normal mother also carried the mutation. All patients with GHD and GLI2 mutations had an EPP (not visualized in the patient with p.E380X), hypoplastic anterior pituitary lobe and absence of holoprosencephaly on MRI. Eighteen non-synonymous variants in GLI2 were identified in 24 patients. Sixteen of these were considered deleterious in at least one in silico prediction program and ten of these were not found in the control population. The phenotype was mainly of CPHD and EPP without holoprosencephaly. Several synonymous and intronic GLI2 variants and polymorphisms apparently without functional consequences were identified. Conclusions: No mutations in GHRH were identified and if mutations in this gene exist as a cause of IGHD, they must be very rare. Variants in GLI2 are frequent (15%) indicating its important role in the etiology of GHD. Furthermore, we expanded the clinical spectrum of patients with GLI2 mutations characterized by IGHD or CPHD including diabetes insipidus, ectopic posterior pituitary lobe (in most patients) and absence of holoprosencephaly. Additional features were polydactyly and midline facial defects and the inheritance was autosomal dominant with incomplete penetrance

Estudos em modelos animais transgênicos possibilitaram o conhecimento de parte dos genes envolvidos na embriogênese hipofisária e da etiologia genética do hipopituitarismo em humanos. Entretanto, a etiologia da maior parte dos casos de hipopituitarismo congênito, principalmente os associados à neuro-hipófise ectópica (NE), ainda é pouco definida. Mutações no gene PROP1 são a causa genética mais comum de hipopituitarismo descritas até o momento, mas estão sempre associadas à neuro-hipófise tópica. Estudos destinados a esclarecer o mecanismo molecular da mutação do gene Prop1 em camundongos demonstraram a participação da via de sinalização Notch e de seus componentes, dentre eles, o gene Hes1. O HES1 é um gene que codifica um fator de transcrição que participa de estágios precoces do desenvolvimento hipofisário e está envolvido com a morfogênese da neuro-hipófise. A avaliação do camundongo com nocaute em homozigose deste gene acarreta uma hipoplasia da adeno-hipófise e ausência da neuro-hipófise; e sua expressão constitutiva está associada ao hipopituitarismo. Como a NE é um achado comum no hipopituitarismo congênito e o gene HES1 pode estar relacionado a sua fisiopatologia, a região codificadora do gene HES1 foi avaliada em 192 pacientes com hipopituitarismo congênito. A variante alélica c.578G > A (p.G193D) em heterozigose foi encontrada em um paciente com hipopituitarismo congênito associado à NE. A avaliação da predição in silico do efeito funcional da variante pela ferramenta MutationTaster sugere que a troca do aminoácido glicina, altamente conservado entre os mamíferos, por ácido aspártico, seja deletéria. No estudo da segregação familiar, quatro irmãos aparentemente normais apresentam a mesma variante, sendo que dois deles possuem alterações discretas na imagem da hipófise. Em conclusão, esta é uma nova variante alélica descrita no gene HES1, ausente em grandes bancos de dados e controles saudáveis da população brasileira, mas presente em irmãos não afetados. Estudos funcionais in vitro são necessários para esclarecer o efeito biológico desta variante. Um padrão de herança complexo com penetrância incompleta é possível e já descrito em outros genes associados ao hipopituitarismo. Na tentativa de elucidar a causa genética do hipopituitarismo neste caso, o material genético deste paciente e de seus familiares foram submetidos ao sequenciamento do exoma, mas os resultados estão inconclusivos até o momento / Studies of transgenic animal models have allowed for the discovery of genes involved in human pituitary embryogenesis and the genetic etiology of hypopituitarism. However, the genetic causes of most cases of congenital hypopituitarism, especially those associated with an ectopic posterior pituitary, remain poorly defined. Mutations in the gene PROP1 are the most common genetic causes of hypopituitarism described to date, and are always associated with an ectopic posterior pituitary. Studies to elucidate the molecular mechanisms of Prop1 mutations in mice have demonstrated the involvement of the Notch signaling pathway, including its downstream target Hes1. The HES1 gene encodes a transcription factor that participates in early stages of pituitary development and is involved in posterior pituitary morphogenesis. Hes1 knockout mice exhibit a hypoplastic anterior pituitary and absence of a posterior pituitary. Conversely, constitutive expression of Hes1 is associated with hypopituitarism. Since an ectopic posterior pituitary is commonly found in congenital hypopituitarism and the HES1 gene may be related to its pathophysiology, the coding region of gene HES1 was screened in 192 patients with congenital hypopituitarism. A heterozygous allelic variant c.578G >A (p.G193D) was identified in a patient with congenital hypopituitarism associated with an ectopic posterior pituitary. Assessment by MutationTaster, a bioinformatic tool for in silico prediction of functional effect of missense variants, suggests that substitution of glycine (a highly conserved amino acid in this position among mammals) for aspartic acid is deleterious. In the genetic study of family members, we identified four apparently normal siblings with the same variant, two of which have discrete changes in their pituitary MRI. In conclusion, we described a new allelic variant in the gene HES1, absent in large databases and healthy Brazilian controls, but present in the unaffected siblings. In vitro functional studies are needed to clarify the biological effect of this variant. A complex pattern of inheritance with incomplete penetrance is possible in this case, as it has already been described in other genes associated with hypopituitarism. In an attempt to elucidate the genetic cause of hypopituitarism in the family described, DNA samples of this patient and his family were submitted to exome sequencing, but results are inconclusive at this time