Introdução: Alterações em genes relacionados com a secreção de GH ou a organogênese hipofisária foram identificadas em pacientes com deficiência de hormônio do crescimento (DGH) congênita. Entretanto, poucos casos de DGH têm sua etiologia esclarecida. O GHRH é um candidato óbvio para explicar a deficiência isolada de GH (DIGH). Na literatura, os estudos de análise do GHRH não conseguiram identificar mutações, porém são antigos e utilizaram uma metodologia com limitações. A maioria dos pacientes com deficiência hipotálamo-hipofisária múltipla (DHHM) apresenta neuroipófise ectópica sugerindo a importância do estudo de genes que atuam no início do desenvolvimento hipofisário, com expressão inclusive no infundíbulo. O GLI2 é um fator de transcrição na sinalização Sonic Hedgehog, envolvido com o início da embriogênese hipofisária, expresso na bolsa de Rathke primordial e no diencéfalo ventral. Previamente, mutações no GLI2 foram encontradas em pacientes com holoprosencefalia, e também alterações hipofisárias. Objetivos: Analisar o GHRH em 151 pacientes com DIGH (42 brasileiros e 109 encaminhados de centros internacionais) e analisar o GLI2 em 180 pacientes brasileiros com DIGH ou DHHM por PCR e sequenciamento automático dos genes; e descrever o fenótipo dos pacientes com mutações identificadas. Resultados: No GHRH foram identificadas seis variantes em heterozigose com previsão benigna pelas análises in silico. A análise do GLI2 identificou três mutações novas em heterozigose com códon de parada prematuro (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X), e geração de proteínas truncadas, com perda do domínio responsável pela ativação transcricional. A mutação p.L788fsX794 foi identificada numa paciente com baixa estatura, polidactilia, epilepsia e hipoglicemias. Apresentava deficiência de GH, TSH, ACTH, prolactina, LH e FSH. Na investigação familiar foi diagnosticada DIGH em dois tios e DHHM numa prima. Estes familiares, além de sua mãe e outros parentes maternos também apresentaram a mutação e polidactilia. A mutação p.L694fsX722 foi identificada num menino com baixa estatura por deficiência de GH, além de lábio leporino e fenda palatina. Seu pai, embora saudável, também apresentou a mutação. A mutação p.E380X foi identificada numa lactente com retardo no desenvolvimento, hipoglicemias, poliúria e polidipsia. Apresentava deficiência de GH, ACTH, TSH e ADH. Sua mãe aparentemente normal também apresentou a mutação. Todos os pacientes com DGH e mutação no GLI2 apresentaram neuroipófise ectópica (não visualizada na paciente com p.E380X), adenoipófise hipoplásica e ausência de holoprosencefalia na ressonância magnética. Dezoito variantes não-sinônimas também foram identificadas no GLI2 em 24 pacientes. Dezesseis dessas variantes foram consideradas deletérias em pelo menos um programa de predição in silico e dez delas não foram encontradas em população controle. O fenótipo dos pacientes foi predominante de DHHM e com neuroipófise ectópica e sem holoprosencefalia. Variantes silenciosas, intrônicas e polimorfismos foram identificados no GLI2, mas aparentemente sem alteração funcional. Conclusão: Não identificamos mutação no GHRH e se realmente existe mutação neste gene como causa de DGH, deve ser muito rara. Variantes no GLI2 são frequentes (15%), indicando seu importante papel na etiologia da DGH congênita. Além disso, ampliamos o espectro fenotípico dos pacientes com mutações no GLI2, que foi caracterizado por DIGH ou DHHM, inclusive com diabetes insipidus, neuroipófise ectópica (maioria) e ausência de holoprosencefalia. Outras características observadas foram polidactilia, defeito de linha média facial e herança autossômica dominante com penetrância incompleta / Introduction: Alterations in genes related to GH secretion and pituitary organogenesis have been identified in patients with congenital GH deficiency (GHD). However, in only few cases of GHD the etiology has been established. GH-releasing hormone (GHRH) is an obvious candidate to explain isolated GH deficiency (IGHD). Previous reports in the literature did not identify mutations in GHRH, however, the methodology used was limited. Most patients with combined pituitary hormone deficiency (CPHD) have an ectopic posterior pituitary lobe (EPP) suggesting the study of genes involved in early pituitary development and also expressed in the infundibulum. GLI2 is a transcription factor in Sonic hedgehog signaling expressed in the primordial Rathkes pouch and ventral diencephalon during early pituitary development. Previously, GLI2 mutations were found in patients with holoprosencephaly and pituitary abnormalities. Aim: Analyse GHRH in 151 patients with IGHD (42 Brazilian and 101 from international centers) and GLI2 in 180 Brazilian patients with IGHD or CPHD by PCR and automatic sequencing, and describe the phenotype of patients with mutations. Results: In GHRH, six heterozygous variants that are benign according to in silico analysis were identified. GLI2 study revealed three novel heterozygous mutations leading to premature stop codons (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X) and truncated proteins, without the transcriptional activator domain. p.L788fsX794 was identified in a girl with short stature, polydactyly, epilepsy and hypoglycemia. She had GH, TSH, ACTH, prolactina, LH and FSH deficiencies. Two uncles had IGHD and one cousin CPHD. These relatives, the mother and other maternal relatives had polydactyly and carried the mutation. p.L694fsX722 was identified in a boy with short stature due to GHD who also had cleft lip and palate. His healthy father also carried the mutation. p.E380X was identified in an infant with delayed development, hypoglycemia, polyuria and polydipsia. She had GH, ACTH, TSH and ADH deficiencies. Her apparently normal mother also carried the mutation. All patients with GHD and GLI2 mutations had an EPP (not visualized in the patient with p.E380X), hypoplastic anterior pituitary lobe and absence of holoprosencephaly on MRI. Eighteen non-synonymous variants in GLI2 were identified in 24 patients. Sixteen of these were considered deleterious in at least one in silico prediction program and ten of these were not found in the control population. The phenotype was mainly of CPHD and EPP without holoprosencephaly. Several synonymous and intronic GLI2 variants and polymorphisms apparently without functional consequences were identified. Conclusions: No mutations in GHRH were identified and if mutations in this gene exist as a cause of IGHD, they must be very rare. Variants in GLI2 are frequent (15%) indicating its important role in the etiology of GHD. Furthermore, we expanded the clinical spectrum of patients with GLI2 mutations characterized by IGHD or CPHD including diabetes insipidus, ectopic posterior pituitary lobe (in most patients) and absence of holoprosencephaly. Additional features were polydactyly and midline facial defects and the inheritance was autosomal dominant with incomplete penetrance

Introdução: Alterações em genes relacionados com a secreção de GH ou a organogênese hipofisária foram identificadas em pacientes com deficiência de hormônio do crescimento (DGH) congênita. Entretanto, poucos casos de DGH têm sua etiologia esclarecida. O GHRH é um candidato óbvio para explicar a deficiência isolada de GH (DIGH). Na literatura, os estudos de análise do GHRH não conseguiram identificar mutações, porém são antigos e utilizaram uma metodologia com limitações. A maioria dos pacientes com deficiência hipotálamo-hipofisária múltipla (DHHM) apresenta neuroipófise ectópica sugerindo a importância do estudo de genes que atuam no início do desenvolvimento hipofisário, com expressão inclusive no infundíbulo. O GLI2 é um fator de transcrição na sinalização Sonic Hedgehog, envolvido com o início da embriogênese hipofisária, expresso na bolsa de Rathke primordial e no diencéfalo ventral. Previamente, mutações no GLI2 foram encontradas em pacientes com holoprosencefalia, e também alterações hipofisárias. Objetivos: Analisar o GHRH em 151 pacientes com DIGH (42 brasileiros e 109 encaminhados de centros internacionais) e analisar o GLI2 em 180 pacientes brasileiros com DIGH ou DHHM por PCR e sequenciamento automático dos genes; e descrever o fenótipo dos pacientes com mutações identificadas. Resultados: No GHRH foram identificadas seis variantes em heterozigose com previsão benigna pelas análises in silico. A análise do GLI2 identificou três mutações novas em heterozigose com códon de parada prematuro (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X), e geração de proteínas truncadas, com perda do domínio responsável pela ativação transcricional. A mutação p.L788fsX794 foi identificada numa paciente com baixa estatura, polidactilia, epilepsia e hipoglicemias. Apresentava deficiência de GH, TSH, ACTH, prolactina, LH e FSH. Na investigação familiar foi diagnosticada DIGH em dois tios e DHHM numa prima. Estes familiares, além de sua mãe e outros parentes maternos também apresentaram a mutação e polidactilia. A mutação p.L694fsX722 foi identificada num menino com baixa estatura por deficiência de GH, além de lábio leporino e fenda palatina. Seu pai, embora saudável, também apresentou a mutação. A mutação p.E380X foi identificada numa lactente com retardo no desenvolvimento, hipoglicemias, poliúria e polidipsia. Apresentava deficiência de GH, ACTH, TSH e ADH. Sua mãe aparentemente normal também apresentou a mutação. Todos os pacientes com DGH e mutação no GLI2 apresentaram neuroipófise ectópica (não visualizada na paciente com p.E380X), adenoipófise hipoplásica e ausência de holoprosencefalia na ressonância magnética. Dezoito variantes não-sinônimas também foram identificadas no GLI2 em 24 pacientes. Dezesseis dessas variantes foram consideradas deletérias em pelo menos um programa de predição in silico e dez delas não foram encontradas em população controle. O fenótipo dos pacientes foi predominante de DHHM e com neuroipófise ectópica e sem holoprosencefalia. Variantes silenciosas, intrônicas e polimorfismos foram identificados no GLI2, mas aparentemente sem alteração funcional. Conclusão: Não identificamos mutação no GHRH e se realmente existe mutação neste gene como causa de DGH, deve ser muito rara. Variantes no GLI2 são frequentes (15%), indicando seu importante papel na etiologia da DGH congênita. Além disso, ampliamos o espectro fenotípico dos pacientes com mutações no GLI2, que foi caracterizado por DIGH ou DHHM, inclusive com diabetes insipidus, neuroipófise ectópica (maioria) e ausência de holoprosencefalia. Outras características observadas foram polidactilia, defeito de linha média facial e herança autossômica dominante com penetrância incompleta / Introduction: Alterations in genes related to GH secretion and pituitary organogenesis have been identified in patients with congenital GH deficiency (GHD). However, in only few cases of GHD the etiology has been established. GH-releasing hormone (GHRH) is an obvious candidate to explain isolated GH deficiency (IGHD). Previous reports in the literature did not identify mutations in GHRH, however, the methodology used was limited. Most patients with combined pituitary hormone deficiency (CPHD) have an ectopic posterior pituitary lobe (EPP) suggesting the study of genes involved in early pituitary development and also expressed in the infundibulum. GLI2 is a transcription factor in Sonic hedgehog signaling expressed in the primordial Rathkes pouch and ventral diencephalon during early pituitary development. Previously, GLI2 mutations were found in patients with holoprosencephaly and pituitary abnormalities. Aim: Analyse GHRH in 151 patients with IGHD (42 Brazilian and 101 from international centers) and GLI2 in 180 Brazilian patients with IGHD or CPHD by PCR and automatic sequencing, and describe the phenotype of patients with mutations. Results: In GHRH, six heterozygous variants that are benign according to in silico analysis were identified. GLI2 study revealed three novel heterozygous mutations leading to premature stop codons (p.L788fsX794, p.L694fsX722 e p.E380X) and truncated proteins, without the transcriptional activator domain. p.L788fsX794 was identified in a girl with short stature, polydactyly, epilepsy and hypoglycemia. She had GH, TSH, ACTH, prolactina, LH and FSH deficiencies. Two uncles had IGHD and one cousin CPHD. These relatives, the mother and other maternal relatives had polydactyly and carried the mutation. p.L694fsX722 was identified in a boy with short stature due to GHD who also had cleft lip and palate. His healthy father also carried the mutation. p.E380X was identified in an infant with delayed development, hypoglycemia, polyuria and polydipsia. She had GH, ACTH, TSH and ADH deficiencies. Her apparently normal mother also carried the mutation. All patients with GHD and GLI2 mutations had an EPP (not visualized in the patient with p.E380X), hypoplastic anterior pituitary lobe and absence of holoprosencephaly on MRI. Eighteen non-synonymous variants in GLI2 were identified in 24 patients. Sixteen of these were considered deleterious in at least one in silico prediction program and ten of these were not found in the control population. The phenotype was mainly of CPHD and EPP without holoprosencephaly. Several synonymous and intronic GLI2 variants and polymorphisms apparently without functional consequences were identified. Conclusions: No mutations in GHRH were identified and if mutations in this gene exist as a cause of IGHD, they must be very rare. Variants in GLI2 are frequent (15%) indicating its important role in the etiology of GHD. Furthermore, we expanded the clinical spectrum of patients with GLI2 mutations characterized by IGHD or CPHD including diabetes insipidus, ectopic posterior pituitary lobe (in most patients) and absence of holoprosencephaly. Additional features were polydactyly and midline facial defects and the inheritance was autosomal dominant with incomplete penetrance

Introdução: A incidência de baixa estatura devido a deficiência do hormônio do crescimento (DGH) ocorre em 1:4.000-10.000 nascidos vivos. Diversos fatores de transcrição são necessários para a diferenciação dos cinco tipos de células produtoras de 6 hormônios hipofisários. Mutações nos fatores de transcrição HESX1, GLI2, LHX3, LHX4, SOX2, SOX3, PROP1 e POU1F1 foram descritas em pacientes com deficiência hormonal hipofisária isolada ou múltipla associada ou não a outras malformações. Mutações no gene OTX2, um fator de transcrição responsável pela formação da vesicula ocular e pela hipófise, podem causar malformações oculares tais como anoftalmia e microftalmia, isoladamente ou em associação com DGH isolado (DGHI) ou deficiência hipofisária hormonal múltipla (DHHM). Recentemente, dois pacientes não relacionados com DHHM e neuroipófise ectópica, sem anormalidades oculares foram descritos com mutações em heterozigose no OTX2 sugerindo um papel deste gene na etiologia do hipopituitarismo sem outras características sindrômicas. Objetivo: O objetivo desse trabalho foi o de analisar o gene OTX2 em pacientes com DGHI ou DHHM e correlacionar os achados moleculares com o fenótipo. Pacientes: Foram estudados 125 pacientes com DHHM (6 filhos de pais consangüíneos e 33 com parentes com baixa estatura) e 33 com DGHI (7 filhos de pais consangüíneos e 8 com parentes com baixa estatura). Materiais e métodos: Amostras de DNA dos pacientes foram submetidas à reação de polimerização em cadeia utilizando-se primers intrônicos desenhados para amplificar os 3 exons e as regiões flanqueadoras do gene OTX2. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados pelo método de Sanger. Resultados: Uma nova variante alélica c.689A>T, p.H230L em heterozigose no exon 5 foi encontrado em um único paciente com deficiência de GH, TSH, LH/FSH e ACTH associada a neuroipófise ectópica, sem malformação ocular. A histidina na posição 230 é altamente conservada em todas as espécies de vertebrados, e a análise in silico prediz um efeito prejudicial à estrutura da proteína. A análise da variante na família revelou 8 parentes não afetados como portadores heterozigotos, sugerindo uma doença autossômica dominante com padrão de penetrância incompleta. Esta variante não foi encontrada em 400 alelos de 200 controles brasileiros, porém foi descrito como polimorfismo no banco de dados de SNP em uma população européia americana, com incidência de 1 alelo T, entre 8600 alelos, sendo assim considerado raro. Encontramos também outras quatro variantes alélicas na casuística (c.98-70C> A; c.420G> C, p.P148P; c.435C> T, p.S145S; C * 10G> A), não conservadas entre as espécies. Duas delas levando a troca silenciosa de amino ácidos, sem efeito deletério no sítio exonic splice enhancer. Conclusão A nossa coorte de 158 pacientes é a maior população rastreada para mutações no OTX2 e a detecção de uma variante suspeita em heterozigose em um único paciente portador de hipopituitarismo e neuroipófise ectópica sugere que mutações no OTX2 são uma causa rara de DHHM ou DGHI sem malformação ocular na população estudada. O achado molecular da variante c.689A>T, p.H230L em heterozigose, com padrão de penetrância incompleta é consistente com a observação de que as características fenotípicas de camundongos heterozigotos com perda de função do Otx2 são fortemente influenciados pela background genético, não podendo dessa forma, descartar que outros moduladores genéticos possam ser responsáveis pela penetrância incompleta nessa família. Essa hipótese deverá ser investigada pela análise do exoma do paciente e seus familiares. O fato de a variante estar localizada numa região altamente conservada entre as espécies, sugere que a mesma seja causadora do fenótipo em questão, porém serão necessários os estudos funcionais de transfecção transitória para determinar se se trata de perda de função ou efeito negativo dominante de genes alvos expressos no ectoderme oral ou neural / Introduction: The incidence of short stature due to growth hormone deficiency (GHD) occurs in 1:4.000-10.000 live births. Several transcription factors are required for differentiation of five types of cells producing 6 pituitary hormones. Mutations in the transcription factors HESX1, GLI2, LHX3, LHX4, SOX2, SOX3, PROP1 and POU1F1 have been described in patients with isolated pituitary hormone deficiency or multiple associated or not with other malformations. Mutations in OTX2, a transcription factor responsible for the formation of the eye vesicle and the pituitary gland, can cause ocular malformations such as anophthalmia and microphthalmia, alone or in association with isolated GHD (IGHD) or combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Recently, two unrelated patients with CPHD and ectopic neurohypophysis without ocular abnormalities were described with heterozygous mutations in OTX2 suggesting a role of this gene in the etiology of hypopituitarism without other syndromic features. Objective: The aim of this study was to analyze the OTX2 gene in patients with GHD or CPHD and correlate the molecular findings with the phenotype. Patients: We studied 125 patients with CPHD (6 children of consanguineous parents and 33 relatives with short stature) and 33 with IGHD (7 children of consanguineous parents and 8 relatives with short stature). Materials and methods: DNA samples from the patients were subjected to polymerase chain reaction using intronic primers designed to amplify the 3 exons and flanking regions of the gene OTX2. The PCR products were purified and sequenced by the Sanger method. Results: A new heterozygous allelic variant c.689A> T, p.H230L in exon 5 was found in one patient with deficiencies of GH, TSH, LH / FSH and ACTH associated with ectopic neurohypophysis without ocular malformation. The histidine at position 230 is strongly conserved in all vertebrate species, and in silico analysis predicts a detrimental effect on protein structure. The analysis of the variant in the family revealed eight unaffected relatives as heterozygous carriers, suggesting an autosomal dominant pattern with incomplete penetrance. This variant was not found in 400 alleles of 200 Brazilian controls, but it was described as a polymorphism in the SNP database in a European American population, with an incidence of 1 T allele among 8600 alleles, and therefore considered rare. We also found four other allelic variants in the samples (c.98-70C> A; c.420G> C, p.P148P; c.435C> T, p.S145S; C * 10G> A), not conserved between species. Two of them leading to a silent amino acid exchange, without deleterious effect in the exonic splice enhancer site. Conclusion Our cohort of 158 patients is the largest population screened for mutations in OTX2 and the detection of a suspected heterozygous variant in one patient with hypopituitarism and ectopic neurohypophysis suggests that OTX2 mutations are a rare cause of CPHD/IGHD without ocular malformation in the studied population. The molecular finding of a heterozygous variant c.689A> T, p.H230L, with incomplete penetrance pattern is consistent with the observation that the phenotypic characteristics of mice with heterozygous loss of function of Otx2 are strongly influenced by genetic background, suggesting that other genetic modulators may be responsible for the incomplete penetrance in this family. This hypothesis should be investigated by analysis of exoma in the patient and their family. The fact that the variant is located in a region highly conserved among species suggests that it is causing the phenotype in question, but it will require the functional studies with transient transfections to determine whether it is the loss of function or effect of dominant negative target genes expressed in neural or oral ectoderm

Introdução: A incidência de baixa estatura devido a deficiência do hormônio do crescimento (DGH) ocorre em 1:4.000-10.000 nascidos vivos. Diversos fatores de transcrição são necessários para a diferenciação dos cinco tipos de células produtoras de 6 hormônios hipofisários. Mutações nos fatores de transcrição HESX1, GLI2, LHX3, LHX4, SOX2, SOX3, PROP1 e POU1F1 foram descritas em pacientes com deficiência hormonal hipofisária isolada ou múltipla associada ou não a outras malformações. Mutações no gene OTX2, um fator de transcrição responsável pela formação da vesicula ocular e pela hipófise, podem causar malformações oculares tais como anoftalmia e microftalmia, isoladamente ou em associação com DGH isolado (DGHI) ou deficiência hipofisária hormonal múltipla (DHHM). Recentemente, dois pacientes não relacionados com DHHM e neuroipófise ectópica, sem anormalidades oculares foram descritos com mutações em heterozigose no OTX2 sugerindo um papel deste gene na etiologia do hipopituitarismo sem outras características sindrômicas. Objetivo: O objetivo desse trabalho foi o de analisar o gene OTX2 em pacientes com DGHI ou DHHM e correlacionar os achados moleculares com o fenótipo. Pacientes: Foram estudados 125 pacientes com DHHM (6 filhos de pais consangüíneos e 33 com parentes com baixa estatura) e 33 com DGHI (7 filhos de pais consangüíneos e 8 com parentes com baixa estatura). Materiais e métodos: Amostras de DNA dos pacientes foram submetidas à reação de polimerização em cadeia utilizando-se primers intrônicos desenhados para amplificar os 3 exons e as regiões flanqueadoras do gene OTX2. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados pelo método de Sanger. Resultados: Uma nova variante alélica c.689A>T, p.H230L em heterozigose no exon 5 foi encontrado em um único paciente com deficiência de GH, TSH, LH/FSH e ACTH associada a neuroipófise ectópica, sem malformação ocular. A histidina na posição 230 é altamente conservada em todas as espécies de vertebrados, e a análise in silico prediz um efeito prejudicial à estrutura da proteína. A análise da variante na família revelou 8 parentes não afetados como portadores heterozigotos, sugerindo uma doença autossômica dominante com padrão de penetrância incompleta. Esta variante não foi encontrada em 400 alelos de 200 controles brasileiros, porém foi descrito como polimorfismo no banco de dados de SNP em uma população européia americana, com incidência de 1 alelo T, entre 8600 alelos, sendo assim considerado raro. Encontramos também outras quatro variantes alélicas na casuística (c.98-70C> A; c.420G> C, p.P148P; c.435C> T, p.S145S; C * 10G> A), não conservadas entre as espécies. Duas delas levando a troca silenciosa de amino ácidos, sem efeito deletério no sítio exonic splice enhancer. Conclusão A nossa coorte de 158 pacientes é a maior população rastreada para mutações no OTX2 e a detecção de uma variante suspeita em heterozigose em um único paciente portador de hipopituitarismo e neuroipófise ectópica sugere que mutações no OTX2 são uma causa rara de DHHM ou DGHI sem malformação ocular na população estudada. O achado molecular da variante c.689A>T, p.H230L em heterozigose, com padrão de penetrância incompleta é consistente com a observação de que as características fenotípicas de camundongos heterozigotos com perda de função do Otx2 são fortemente influenciados pela background genético, não podendo dessa forma, descartar que outros moduladores genéticos possam ser responsáveis pela penetrância incompleta nessa família. Essa hipótese deverá ser investigada pela análise do exoma do paciente e seus familiares. O fato de a variante estar localizada numa região altamente conservada entre as espécies, sugere que a mesma seja causadora do fenótipo em questão, porém serão necessários os estudos funcionais de transfecção transitória para determinar se se trata de perda de função ou efeito negativo dominante de genes alvos expressos no ectoderme oral ou neural / Introduction: The incidence of short stature due to growth hormone deficiency (GHD) occurs in 1:4.000-10.000 live births. Several transcription factors are required for differentiation of five types of cells producing 6 pituitary hormones. Mutations in the transcription factors HESX1, GLI2, LHX3, LHX4, SOX2, SOX3, PROP1 and POU1F1 have been described in patients with isolated pituitary hormone deficiency or multiple associated or not with other malformations. Mutations in OTX2, a transcription factor responsible for the formation of the eye vesicle and the pituitary gland, can cause ocular malformations such as anophthalmia and microphthalmia, alone or in association with isolated GHD (IGHD) or combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Recently, two unrelated patients with CPHD and ectopic neurohypophysis without ocular abnormalities were described with heterozygous mutations in OTX2 suggesting a role of this gene in the etiology of hypopituitarism without other syndromic features. Objective: The aim of this study was to analyze the OTX2 gene in patients with GHD or CPHD and correlate the molecular findings with the phenotype. Patients: We studied 125 patients with CPHD (6 children of consanguineous parents and 33 relatives with short stature) and 33 with IGHD (7 children of consanguineous parents and 8 relatives with short stature). Materials and methods: DNA samples from the patients were subjected to polymerase chain reaction using intronic primers designed to amplify the 3 exons and flanking regions of the gene OTX2. The PCR products were purified and sequenced by the Sanger method. Results: A new heterozygous allelic variant c.689A> T, p.H230L in exon 5 was found in one patient with deficiencies of GH, TSH, LH / FSH and ACTH associated with ectopic neurohypophysis without ocular malformation. The histidine at position 230 is strongly conserved in all vertebrate species, and in silico analysis predicts a detrimental effect on protein structure. The analysis of the variant in the family revealed eight unaffected relatives as heterozygous carriers, suggesting an autosomal dominant pattern with incomplete penetrance. This variant was not found in 400 alleles of 200 Brazilian controls, but it was described as a polymorphism in the SNP database in a European American population, with an incidence of 1 T allele among 8600 alleles, and therefore considered rare. We also found four other allelic variants in the samples (c.98-70C> A; c.420G> C, p.P148P; c.435C> T, p.S145S; C * 10G> A), not conserved between species. Two of them leading to a silent amino acid exchange, without deleterious effect in the exonic splice enhancer site. Conclusion Our cohort of 158 patients is the largest population screened for mutations in OTX2 and the detection of a suspected heterozygous variant in one patient with hypopituitarism and ectopic neurohypophysis suggests that OTX2 mutations are a rare cause of CPHD/IGHD without ocular malformation in the studied population. The molecular finding of a heterozygous variant c.689A> T, p.H230L, with incomplete penetrance pattern is consistent with the observation that the phenotypic characteristics of mice with heterozygous loss of function of Otx2 are strongly influenced by genetic background, suggesting that other genetic modulators may be responsible for the incomplete penetrance in this family. This hypothesis should be investigated by analysis of exoma in the patient and their family. The fact that the variant is located in a region highly conserved among species suggests that it is causing the phenotype in question, but it will require the functional studies with transient transfections to determine whether it is the loss of function or effect of dominant negative target genes expressed in neural or oral ectoderm

O sistema hormônio de crescimento (GH) / fator de crescimento insulina- símile tipo 1 (IGF-1) é o principal determinante e regulador do crescimento linear pósnatal. O GH é codificado pelo gene Growth Hormone 1 (GH1). Mutações no GH1 com efeito dominante negativo e herança autossômica dominante são as principais causas monogênicas de deficiência isolada de hormônio de crescimento (DIGH), enquanto deleções ou mutações de ponto no GH1 causam formas raras autossômicas recessivas de DIGH. No grupo de pacientes com DIGH do ambulatório de Endocrinologia do Desenvolvimento do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, foram identificadas apenas deleções em homozigose no GH1 mesmo após estudo criterioso deste gene. Esta diferença em relação aos dados descritos na literatura poderia ser justificada pelo critério diagnóstico para a DIGH adotado pelo nosso grupo, sendo utilizado pico de GH em teste de estímulo inferior a 3,3 ug/L, em contraste com os valores de corte descritos na literatura que variam de 7 a 10 ug/L. Devido a esse fator, pacientes com mutações no GH1 com herança autossômica dominante poderiam estar sendo erroneamente diagnosticados como portadores de baixa estatura familiar ou idiopática (BEI) em nosso serviço. Adicionalmente, mutações que originam moléculas de GH biologicamente inativas também poderiam estar presentes nestes pacientes. Pelos fatores acima apresentados, expandimos o estudo do GH1 para um grupo de crianças classificadas como BEI. Foram selecionadas 98 de 487 crianças avaliadas em nosso serviço com baixa estatura utilizando os seguintes critérios: peso e comprimento normais para idade gestacional ao nascimento, escore-Z da altura < -2, escore-Z do IGF-1 < -1 e pico de resposta de GH >= 3,3 ug/L no teste de estímulo. DNA foi extraído de leucócitos periféricos desses pacientes para rastreamento de mutações no gene GH1. Realizamos estudo molecular por reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático de toda a região codificadora do GH1. Segregação familiar foi realizada para as variantes alélicas identificadas. Em nossa casuística, foram identificadas 10 variantes alélicas nos éxons 4 e 5 e no íntron 4 do GH1, sendo três variantes ainda não descritas na literatura (c.407G > A/p.Val122Ile, c.507C > T/p.Tyr169Tyr e c.456+19G > T). A análise in silico de todas as variantes identificadas indicou ausência de predição de efeito deletério sobre a proteína do GH. Estudo complementar realizado pelo nosso grupo identificou em crianças diagnosticadas com DIGH grave apenas uma paciente com mutação no GH1 responsável pela forma dominante desta doença. Em conclusão, mutações no GH1 causadoras da forma autossômica dominante de DIGH ou Tipo II não foram encontradas em nossa casuística, o que sugere que estas mutações sejam infrequentes em nossa população / The growth hormone (GH) / insulin-like growth factor-1 (IGF-1) axis is the most important hormonal regulator of post-natal linear growth. GH is encoded by the Growth Hormone 1 gene (GH1). Mutations in GH1 with dominant inheritance, which exerts a dominant negative effect on the bioactive GH isoforms, are the main causes of monogenic isolated deficiency of growth hormone (IGHD), while deletions or point mutations in GH1 are responsible for a rare autosomal recessive form of IGHD. However, only homozygous deletions were identified in patients with IGHD from Unidade de Endocrinologia do Desenvolvimento do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, even after detailed investigation of GH1. This difference regarding to literature can be caused by different criteria used to diagnose IGHD in our group, which adopted the cutoff value of peak GH < 3.3ug/L in response to stimulation test, in contrast to literature that describes other groups that use the cutoff peak value of the 7 - 10ug/L. Consequently, patients with autosomal dominant inheritance mutations in GH1 could be being erroneously diagnosed, as having idiopathic short stature (ISS) in our group. Additionally, mutations that cause biologically inactive GH can also be responsible for short stature in these patients. Due to the factors described above, we decided to screen mutations in GH1 in a group of children classified as ISS. We selected 98 of 487 children followed in our department with short stature according to the following criteria: normal birth weight and length for gestational age, height SDS <= -2, IGF-1 SDS < -1 and peak GH in stimulation test >= 3.3 ug/L. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leucocytes of the patients to screen for mutations in GH1. We performed molecular analysis by polymerase chain reaction and automated sequencing of the entire coding region of the GH1. Segregation analysis was performed in the presence of allelic variations. In our casuistic, we identified 10 allelic variants in exon 4, exon 5 and intron 4 of GH1, three of which have not been described (c.407G > A/p.Val122Ile, c.507C > T/p.Tyr169Tyr and c.456+19G >T). In silico analysis predicted that none of the mutant alleles would result in deleterious effect on the GH protein. An additional study in children diagnosed with severe IGHD, identified just one patient with the pathogenic GH1 mutation responsible for the dominant form of this disease. In summary, defects in GH1 responsible for the autosomal dominant form of IGHD or Type II were not found in our cohort of Brazilian patients, suggesting that these mutations are infrequent in our population

O sistema hormônio de crescimento (GH) / fator de crescimento insulina- símile tipo 1 (IGF-1) é o principal determinante e regulador do crescimento linear pósnatal. O GH é codificado pelo gene Growth Hormone 1 (GH1). Mutações no GH1 com efeito dominante negativo e herança autossômica dominante são as principais causas monogênicas de deficiência isolada de hormônio de crescimento (DIGH), enquanto deleções ou mutações de ponto no GH1 causam formas raras autossômicas recessivas de DIGH. No grupo de pacientes com DIGH do ambulatório de Endocrinologia do Desenvolvimento do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, foram identificadas apenas deleções em homozigose no GH1 mesmo após estudo criterioso deste gene. Esta diferença em relação aos dados descritos na literatura poderia ser justificada pelo critério diagnóstico para a DIGH adotado pelo nosso grupo, sendo utilizado pico de GH em teste de estímulo inferior a 3,3 ug/L, em contraste com os valores de corte descritos na literatura que variam de 7 a 10 ug/L. Devido a esse fator, pacientes com mutações no GH1 com herança autossômica dominante poderiam estar sendo erroneamente diagnosticados como portadores de baixa estatura familiar ou idiopática (BEI) em nosso serviço. Adicionalmente, mutações que originam moléculas de GH biologicamente inativas também poderiam estar presentes nestes pacientes. Pelos fatores acima apresentados, expandimos o estudo do GH1 para um grupo de crianças classificadas como BEI. Foram selecionadas 98 de 487 crianças avaliadas em nosso serviço com baixa estatura utilizando os seguintes critérios: peso e comprimento normais para idade gestacional ao nascimento, escore-Z da altura < -2, escore-Z do IGF-1 < -1 e pico de resposta de GH >= 3,3 ug/L no teste de estímulo. DNA foi extraído de leucócitos periféricos desses pacientes para rastreamento de mutações no gene GH1. Realizamos estudo molecular por reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático de toda a região codificadora do GH1. Segregação familiar foi realizada para as variantes alélicas identificadas. Em nossa casuística, foram identificadas 10 variantes alélicas nos éxons 4 e 5 e no íntron 4 do GH1, sendo três variantes ainda não descritas na literatura (c.407G > A/p.Val122Ile, c.507C > T/p.Tyr169Tyr e c.456+19G > T). A análise in silico de todas as variantes identificadas indicou ausência de predição de efeito deletério sobre a proteína do GH. Estudo complementar realizado pelo nosso grupo identificou em crianças diagnosticadas com DIGH grave apenas uma paciente com mutação no GH1 responsável pela forma dominante desta doença. Em conclusão, mutações no GH1 causadoras da forma autossômica dominante de DIGH ou Tipo II não foram encontradas em nossa casuística, o que sugere que estas mutações sejam infrequentes em nossa população / The growth hormone (GH) / insulin-like growth factor-1 (IGF-1) axis is the most important hormonal regulator of post-natal linear growth. GH is encoded by the Growth Hormone 1 gene (GH1). Mutations in GH1 with dominant inheritance, which exerts a dominant negative effect on the bioactive GH isoforms, are the main causes of monogenic isolated deficiency of growth hormone (IGHD), while deletions or point mutations in GH1 are responsible for a rare autosomal recessive form of IGHD. However, only homozygous deletions were identified in patients with IGHD from Unidade de Endocrinologia do Desenvolvimento do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, even after detailed investigation of GH1. This difference regarding to literature can be caused by different criteria used to diagnose IGHD in our group, which adopted the cutoff value of peak GH < 3.3ug/L in response to stimulation test, in contrast to literature that describes other groups that use the cutoff peak value of the 7 - 10ug/L. Consequently, patients with autosomal dominant inheritance mutations in GH1 could be being erroneously diagnosed, as having idiopathic short stature (ISS) in our group. Additionally, mutations that cause biologically inactive GH can also be responsible for short stature in these patients. Due to the factors described above, we decided to screen mutations in GH1 in a group of children classified as ISS. We selected 98 of 487 children followed in our department with short stature according to the following criteria: normal birth weight and length for gestational age, height SDS <= -2, IGF-1 SDS < -1 and peak GH in stimulation test >= 3.3 ug/L. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leucocytes of the patients to screen for mutations in GH1. We performed molecular analysis by polymerase chain reaction and automated sequencing of the entire coding region of the GH1. Segregation analysis was performed in the presence of allelic variations. In our casuistic, we identified 10 allelic variants in exon 4, exon 5 and intron 4 of GH1, three of which have not been described (c.407G > A/p.Val122Ile, c.507C > T/p.Tyr169Tyr and c.456+19G >T). In silico analysis predicted that none of the mutant alleles would result in deleterious effect on the GH protein. An additional study in children diagnosed with severe IGHD, identified just one patient with the pathogenic GH1 mutation responsible for the dominant form of this disease. In summary, defects in GH1 responsible for the autosomal dominant form of IGHD or Type II were not found in our cohort of Brazilian patients, suggesting that these mutations are infrequent in our population