Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-01-24Bitstream added on 2014-06-13T19:05:27Z : No. of bitstreams: 1 fujihara_cj_dr_botfmfvz.pdf: 490522 bytes, checksum: f5cc6ca2873683444dae82be569a56a6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O estímulo estressante promove ativação do eixo neuronal e hormonal em todos os animais. No eixo hormonal observa-se a ativação do eixo Hipotalâmico-Hipofisário-Adrenal (HHA), havendo a liberação de glucocorticóides na corrente sanguínea, que visam a disponibilização de energia para o animal lutar ou fugir contra o agente estressor. Em aves o principal glucocorticóide produzido pela córtex da adrenal é a corticosterona. Após o término do evento estressor, as concentrações plasmáticas retornam aos niveis basais pelo processo de retroalimentação e metabolização. Devido a variabilidade na porcentagem de produção, metabolização e excreção dos hormônios ligados ao estresse, é impressindível realizar a validação, tanto laboratorial quanto fisiológica dos métodos de dosagem a serem empregados para cada espécie. Com o objetivo de realizar a validação fisiológica da dosagem de metabólitos urofecais pela técnica de Enzimaimunoensaio em Papagaio-verdadeiro (A. aestiva), foram utilizados 24 animais (12 machos e 12 fêmeas) separados nos seguintes experimentos: Experimento I – 02 machos e 02 fêmeas, separados em dois grupos (01 macho/ 01 fêmeas) de acordo com o tipo de anticorpos (Corticosterona 72T e Cortisona 32a) utilizado no ensaio, as amostras urofecais de cada animal foram coletadas no momento da administração de hormonio adrenocorticotrófico (ACTH) e a cada 03 horas (h), por 21 h consencutivas; Experimento II – 12 machos e 12 fêmeas separados em quatro grupos (03 machos/03 fêmeas) de acordo com o desafio empregado (Controle, ACTH, Dexametasona, Salina), foram coletadas amostras urofecais no momento da administração intramuscular da solução correspondente para cada grupo e a cada 03 horas, por 24 horas consecutivas; Experimento III – 12 machos... / Stress stimulate neuronal and hormonal axis in all animals. In the hormonal axis is observed activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), with the release of glucocorticoids into the bloodstream, providing energy for the animal fly or fight in the front of stressor. Corticosterone is the major glucocorticoid produced by adrenal cortex in birds. After the stressor event, plasma concentrations returned to baseline levels by feedback process and metabolism. Due to variability in production, metabolism and excretion percentage of stress hormones, laboratorial and physiological validation are necessary for use methods of dosage for each species. In order to perform physiological validation of urofecal metabolites measurement by enzyme immunoassay in Blue-fronted parrot (A. aestiva), we used 24 animals (12 males and 12 females) separated in the following experiments: Experiment I - 02 males and 02 females, divided into two groups (01 male/01 female) according to type of antibodies (72T Corticosterone and Cortisone 32a). Urofecal samples from each animal were collected at the time of administration of ACTH and every 03 hours (h), during 21 h; Experiment II - 12 males and 12 females divided into four groups (03 males/03 females) according to the solution administared (control, ACTH, dexamethasone, Salina), urofecal samples were collected at the time of intramuscular administration, corresponding for each group and every 03 hours for 24 consecutive hours; Experiment III - 12 males and 11 females divided into two groups (06 males/05 females) according to the sample type (fecal and urofecal), samples were collected at the time of intramuscular injection of ACTH and every 03 hours for 24 consecutive hours. We observed the following results: Cortisone 32a presented increased sensitivity to measure corticosterone... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Cezinande de Meira / Banca: Ian Martins / Banca: José Mauríci Barbante Duarte / Banca: Ricardo José Garcia Pereira / Resumo: O estímulo estressante promove ativação do eixo neuronal e hormonal em todos os animais. No eixo hormonal observa-se a ativação do eixo Hipotalâmico-Hipofisário-Adrenal (HHA), havendo a liberação de glucocorticóides na corrente sanguínea, que visam a disponibilização de energia para o animal lutar ou fugir contra o agente estressor. Em aves o principal glucocorticóide produzido pela córtex da adrenal é a corticosterona. Após o término do evento estressor, as concentrações plasmáticas retornam aos niveis basais pelo processo de retroalimentação e metabolização. Devido a variabilidade na porcentagem de produção, metabolização e excreção dos hormônios ligados ao estresse, é impressindível realizar a validação, tanto laboratorial quanto fisiológica dos métodos de dosagem a serem empregados para cada espécie. Com o objetivo de realizar a validação fisiológica da dosagem de metabólitos urofecais pela técnica de Enzimaimunoensaio em Papagaio-verdadeiro (A. aestiva), foram utilizados 24 animais (12 machos e 12 fêmeas) separados nos seguintes experimentos: Experimento I - 02 machos e 02 fêmeas, separados em dois grupos (01 macho/ 01 fêmeas) de acordo com o tipo de anticorpos (Corticosterona 72T e Cortisona 32a) utilizado no ensaio, as amostras urofecais de cada animal foram coletadas no momento da administração de hormonio adrenocorticotrófico (ACTH) e a cada 03 horas (h), por 21 h consencutivas; Experimento II - 12 machos e 12 fêmeas separados em quatro grupos (03 machos/03 fêmeas) de acordo com o desafio empregado (Controle, ACTH, Dexametasona, Salina), foram coletadas amostras urofecais no momento da administração intramuscular da solução correspondente para cada grupo e a cada 03 horas, por 24 horas consecutivas; Experimento III - 12 machos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Stress stimulate neuronal and hormonal axis in all animals. In the hormonal axis is observed activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), with the release of glucocorticoids into the bloodstream, providing energy for the animal fly or fight in the front of stressor. Corticosterone is the major glucocorticoid produced by adrenal cortex in birds. After the stressor event, plasma concentrations returned to baseline levels by feedback process and metabolism. Due to variability in production, metabolism and excretion percentage of stress hormones, laboratorial and physiological validation are necessary for use methods of dosage for each species. In order to perform physiological validation of urofecal metabolites measurement by enzyme immunoassay in Blue-fronted parrot (A. aestiva), we used 24 animals (12 males and 12 females) separated in the following experiments: Experiment I - 02 males and 02 females, divided into two groups (01 male/01 female) according to type of antibodies (72T Corticosterone and Cortisone 32a). Urofecal samples from each animal were collected at the time of administration of ACTH and every 03 hours (h), during 21 h; Experiment II - 12 males and 12 females divided into four groups (03 males/03 females) according to the solution administared (control, ACTH, dexamethasone, Salina), urofecal samples were collected at the time of intramuscular administration, corresponding for each group and every 03 hours for 24 consecutive hours; Experiment III - 12 males and 11 females divided into two groups (06 males/05 females) according to the sample type (fecal and urofecal), samples were collected at the time of intramuscular injection of ACTH and every 03 hours for 24 consecutive hours. We observed the following results: Cortisone 32a presented increased sensitivity to measure corticosterone... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Os receptores tireoidianos (TRs) são proteínas envolvidas em várias funções fisiológicas importantes para os organismos, pois são potentes reguladores do desenvolvimento, divisão e diferenciação celular, metabolismo e homeostase. Eles são responsáveis pela regulação da transcrição de genes-alvo específicos, mediando efeitos pleiotrópicos de hormônios lipofílicos nas células. Na ausência de ligantes essas proteínas estão complexadas a correpressores, impedindo a transcrição de genes por elas regulados. Por outro lado, a presença do ligante induz à transcrição através da ligação a elementos responsivos do DNA e coativadores. Nesse trabalho alguns aspectos do TR foram evidenciados, permintindo-se um melhor conhecimento acerca do funcionamento e estrutura desse receptor. Os experimentos de oligomerização revelaram a presença dos tetrâmeros do TR, os quais estavam restritos ao Receptor X Retinóico, sugerindo mecanismos novos na regulação do receptor. Os ensaios de raios-X a baixos ângulos resultaram nos primeiros modelos estruturais de baixa resolução de construções maiores do TR, demonstrando o correto posicionamento de seus domínios em sua estrutura geral, o que forneceu informações importantes sobre sua estrutura geral. Os experimentos de fluorescência avaliaram a ligação desses receptores a diversos elementos responsivos, em termos de constantes de dissociação e seletividade para cada um deles. E, por fim, os experimentos de troca de hidrogênio por deutério revelaram a movimentação que ocorre no domínio de ligação do ligante do receptor antes e após a adição do ligante T3. Esses resultados ampliam um pouco mais os conhecimentos sobre os mecanismos de ação e sobre a estrutura quaternária dos TR, promovendo um melhor entendimento dos conceitos básicos envolvidos na atuação dessas macromoléculas, as quais estão inseridas em redes complexas de regulação e interação com outras proteínas. / The thyroid receptors (TRs) are proteins, which are involved in diverse and important physiological functions in the organisms, since they are regulators of development, cell divison and differentiation, metabolism and homeostasis. They are responsible by the regulation of specific gene transcription, through pleiotropic effects of lipophilic hormones in the cells. In the absence of the ligand these proteins are complexed to correpressors and block the transcription of genes that are regulated by them On the other hand, in the presence of the ligand transcription is induced through the binding of the receptors to DNA response elements and coactivators. New findings about TR described in this study helped to improve the understanding of the function and structure of the receptor. This was accomplished by: oligomerization experiments which showed the presence of TR tetramers, a quarternary structure described before only for the Retinoid Receptor X, and suggested new regulation mechanisms for the receptors; the small angle X-ray scattering assays which resulted in the first low resolution structural models of bigger constructions of TR, showing the correct position of TR domains and providing important information about the global TR structure; the anisotropy fluorescence experiments which evaluated the binding of these receptors to diverse response elements, in terms of dissociation constants and selectivity for each one of the HREs tested; and finally, the hydrogen/deuterium experiments which revealed the ligand binding domain mobility before and after the ligand addition. In summary, we can say that these results all together extended the knowledge about the TR action mechanisms and its quarternary strucuture, providing better understanding of the basic concepts involved in these macromolecules behavior, which are inserted into a complex network of regulation and interaction with other proteins.

Os receptores tireoidianos (TRs) são proteínas envolvidas em várias funções fisiológicas importantes para os organismos, pois são potentes reguladores do desenvolvimento, divisão e diferenciação celular, metabolismo e homeostase. Eles são responsáveis pela regulação da transcrição de genes-alvo específicos, mediando efeitos pleiotrópicos de hormônios lipofílicos nas células. Na ausência de ligantes essas proteínas estão complexadas a correpressores, impedindo a transcrição de genes por elas regulados. Por outro lado, a presença do ligante induz à transcrição através da ligação a elementos responsivos do DNA e coativadores. Nesse trabalho alguns aspectos do TR foram evidenciados, permintindo-se um melhor conhecimento acerca do funcionamento e estrutura desse receptor. Os experimentos de oligomerização revelaram a presença dos tetrâmeros do TR, os quais estavam restritos ao Receptor X Retinóico, sugerindo mecanismos novos na regulação do receptor. Os ensaios de raios-X a baixos ângulos resultaram nos primeiros modelos estruturais de baixa resolução de construções maiores do TR, demonstrando o correto posicionamento de seus domínios em sua estrutura geral, o que forneceu informações importantes sobre sua estrutura geral. Os experimentos de fluorescência avaliaram a ligação desses receptores a diversos elementos responsivos, em termos de constantes de dissociação e seletividade para cada um deles. E, por fim, os experimentos de troca de hidrogênio por deutério revelaram a movimentação que ocorre no domínio de ligação do ligante do receptor antes e após a adição do ligante T3. Esses resultados ampliam um pouco mais os conhecimentos sobre os mecanismos de ação e sobre a estrutura quaternária dos TR, promovendo um melhor entendimento dos conceitos básicos envolvidos na atuação dessas macromoléculas, as quais estão inseridas em redes complexas de regulação e interação com outras proteínas. / The thyroid receptors (TRs) are proteins, which are involved in diverse and important physiological functions in the organisms, since they are regulators of development, cell divison and differentiation, metabolism and homeostasis. They are responsible by the regulation of specific gene transcription, through pleiotropic effects of lipophilic hormones in the cells. In the absence of the ligand these proteins are complexed to correpressors and block the transcription of genes that are regulated by them On the other hand, in the presence of the ligand transcription is induced through the binding of the receptors to DNA response elements and coactivators. New findings about TR described in this study helped to improve the understanding of the function and structure of the receptor. This was accomplished by: oligomerization experiments which showed the presence of TR tetramers, a quarternary structure described before only for the Retinoid Receptor X, and suggested new regulation mechanisms for the receptors; the small angle X-ray scattering assays which resulted in the first low resolution structural models of bigger constructions of TR, showing the correct position of TR domains and providing important information about the global TR structure; the anisotropy fluorescence experiments which evaluated the binding of these receptors to diverse response elements, in terms of dissociation constants and selectivity for each one of the HREs tested; and finally, the hydrogen/deuterium experiments which revealed the ligand binding domain mobility before and after the ligand addition. In summary, we can say that these results all together extended the knowledge about the TR action mechanisms and its quarternary strucuture, providing better understanding of the basic concepts involved in these macromolecules behavior, which are inserted into a complex network of regulation and interaction with other proteins.

A administração de deidroepiandrosterona (DHEA) tem resultado em efeitos anti-diabetogênicos em animais de experimentação e no homem. Assim, o objetivo desse trabalho é avaliar o efeito do DHEA in vitro na expressão protéica do IR, do IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, ERK-1/2; na expressão gênica do PDX-1, do PGC-1, da insulina, do GLUT-2 e da glicocinase; e avaliar a secreção estática de insulina de ilhotas pancreáticas de ratos. O cultivo das ilhotas por 24 horas com DHEA, não induziu nenhuma alteração tanto na expressão das proteínas quanto na secreção estática de insulina estimulada por glicose. Ocorreu aumento da fosforilação de ERK-1/2 e na expressão gênica do PGC-1. As células RINm5F, cultivadas por 72 horas com DHEA, apresentaram aumento da expressão total de IRS-1 e IRS-2. Concluímos, que 24 horas de cultura com ilhotas não é tempo suficiente para observar nenhuma alteração induzida pelo DHEA, na secreção de insulina, e na expressão das proteínas da via IRS/PI3-K/Akt. Células RINm5F podem ser um modelo alternativo para investigar os efeitos diretos do DHEA. / The dehydroepiandrosterone (DHEA) administration has resulted in reduction of abdominal fat and protection against insulin resistance from experimental animals and humans. So, the purpose of this project is measure the in vitro effects from DHEA: on protein expression of insulin receptor, the proteins IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, and ERK-1/2; on gene expression of transcriptional factors PDX-1 and PGC-1, insulin, glucose transport GLUT-2 and glicocinase; and to measure the static insulin secretion, on cultured pancreatic islets of the rat. The culture of pancreatic islet for 24 hours with DHEA, did not induce nothing alteration on protein expression of the IR, IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt-1 and ERK-1/2, and static insulin secretion induced by glucose. However, happened increase ERK-1/2 phosphorylation and PGC-1 gene expression. The RINm5F cells, cultured by 72 hours, showed increase of the IRS-1 and IRS-2 expression. We conclude that 24 hours of the pancreatic islets culture are not sufficient time to look any alteration induced by DHEA, on insulin secretion, and on protein expression involved on IRS/PI3-K/Akt pathway. RINm5F cells can be an alternative model to research the direct effects from DHEA.

A administração de deidroepiandrosterona (DHEA) tem resultado em efeitos anti-diabetogênicos em animais de experimentação e no homem. Assim, o objetivo desse trabalho é avaliar o efeito do DHEA in vitro na expressão protéica do IR, do IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, ERK-1/2; na expressão gênica do PDX-1, do PGC-1, da insulina, do GLUT-2 e da glicocinase; e avaliar a secreção estática de insulina de ilhotas pancreáticas de ratos. O cultivo das ilhotas por 24 horas com DHEA, não induziu nenhuma alteração tanto na expressão das proteínas quanto na secreção estática de insulina estimulada por glicose. Ocorreu aumento da fosforilação de ERK-1/2 e na expressão gênica do PGC-1. As células RINm5F, cultivadas por 72 horas com DHEA, apresentaram aumento da expressão total de IRS-1 e IRS-2. Concluímos, que 24 horas de cultura com ilhotas não é tempo suficiente para observar nenhuma alteração induzida pelo DHEA, na secreção de insulina, e na expressão das proteínas da via IRS/PI3-K/Akt. Células RINm5F podem ser um modelo alternativo para investigar os efeitos diretos do DHEA. / The dehydroepiandrosterone (DHEA) administration has resulted in reduction of abdominal fat and protection against insulin resistance from experimental animals and humans. So, the purpose of this project is measure the in vitro effects from DHEA: on protein expression of insulin receptor, the proteins IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, and ERK-1/2; on gene expression of transcriptional factors PDX-1 and PGC-1, insulin, glucose transport GLUT-2 and glicocinase; and to measure the static insulin secretion, on cultured pancreatic islets of the rat. The culture of pancreatic islet for 24 hours with DHEA, did not induce nothing alteration on protein expression of the IR, IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt-1 and ERK-1/2, and static insulin secretion induced by glucose. However, happened increase ERK-1/2 phosphorylation and PGC-1 gene expression. The RINm5F cells, cultured by 72 hours, showed increase of the IRS-1 and IRS-2 expression. We conclude that 24 hours of the pancreatic islets culture are not sufficient time to look any alteration induced by DHEA, on insulin secretion, and on protein expression involved on IRS/PI3-K/Akt pathway. RINm5F cells can be an alternative model to research the direct effects from DHEA.