Memoria para optar al título de Química Farmacéutica / El cardiomiocito adulto es una célula terminalmente diferenciada con escasa capacidad replicativa y responsable de la contracción del miocardio. El ión calcio en conjunto con el AMP cíclico son los segundos mensajeros que regulan la contracción del cardiomiocito. Por otra parte la diabetes mellitus tipo II se asocia a un mayor riesgo cardiovascular (“cardiomiopatía diabética”), siendo muy frecuentes alteraciones sistólicas y diastólicas en el corazón de un paciente diabético. Dado que insulina es la principal hormona asociada a la diabetes es importante determinar si existe alguna relación entre ella y el calcio en el cardiomiocito adulto. En una investigación previa de nuestro Laboratorio se describió que insulina aumenta el calcio intracelular en cultivos primarios de cardiomiocitos neonatos, presentando esta respuesta dos componentes, uno rápido dependiente del calcio externo y el canal tipo L y receptor de ryanodina y otro lento dependiente de la vía transduccional IP3/receptor IP3. Interesantemente, este último componente media los efectos de insulina a nivel de la translocación del GLUT4 a la membrana plasmática y el posterior ingreso de glucosa a estas células. En base a estos antecedentes se propuso en esta memoria como hipótesis que insulina también aumenta los niveles intracelulares de Ca2+ en el cardiomiocito adulto a través de un mecanismo dependiente del Ca2+ extracelular y del almacenado en reservorios intracelulares. Nuestro objetivo consistió en estudiar la activación del sistema de señalización río abajo del receptor de insulina y su dependencia del calcio y el efecto tanto de insulina como IGF-1 en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito adulto de rata. Las células se expusieron a insulina 100 nM por distintos períodos de tiempo y se evaluó la activación del receptor mediante su autofosforilación en tirosina y de las proteínas kinasas Akt (Ser 473) y Erk 1/2 mediante Western blot. La presencia del receptor de insulina en el cardiomiocito de rata adulta se detectó por inmunofluorescencia en tyr1150/1151. Las tres proteínas evaluadas alcanzaron un máximo de activación significativo con respecto a los controles a los 5 min post- estímulo con insulina. Por otra parte, las células preincubadas con la sonda fluorescente para calcio Fluo3- AM se estudiaron por microscopía confocal para determinar cambios en los niveles de calcio intracelulares inducidos por insulina e IGF-1. Ambos péptidos no produjeron aumentos significativos en los niveles de calcio intracelulares tanto en medio de reposo sin calcio como en medio de reposo con calcio y evaluando distintas zonas celulares y concentraciones de los compuestos, mientras que conocidos estímulos (ionomicina y KCl), empleados como controles positivos, aumentaron el calcio intracelular. Asimismo, insulina e IGF-1 no modificaron la frecuencia de contracción del cardiomiocito adulto. Sin embargo, ensayos de fosforilación de la proteína Akt (Ser 473) en ausencia de calcio intracelular mediante el uso de BAPTA-AM mostraron niveles inferiores a los observados en presencia de este catión. En cambio, la fosforilación del receptor de insulina no se modificó al quelar el calcio intracelular en el cardiomiocito adulto. Estos resultados sugieren que probablemente las diferencias en cuanto a fenotipo y genotipo, así como las diferencias en las preferencias de sustratos energéticos de cardiomiocitos neonatos y adultos podrían constituir razones por las cuales ambos tipos celulares se comportan de manera distinta en cuanto a la relación insulina y calcio. En conclusión, insulina activa su vía transduccional en el cardiomiocito adulto. No obstante, ni insulina ni IGF-1 inducen cambios en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito adulto ya sea afectando la entrada desde el extracelular o la salida desde reservorios intracelulares de manera detectable con Fluo3- AM. Sin embargo, dado que este catión moduló la activación de la vía de señalización de insulina a nivel de la proteína kinasa Akt, futuras investigaciones deberán aclarar estas discrepancias / Cardiomyocytes are fully differentiated cells with limited proliferation capacity and responsible for myocardial contraction. Ca2+ and cyclic AMP are second messengers regulating cardiomyocyte contraction. On the other hand type II diabetes mellitus has been associated with increased cardiovascular risk (diabetic cardiomyopathy), being frequent systolic and diastolic alterations in the diabetic heart. Because insulin is the main hormone linked to diabetes, it is important to determine whether there is any relationship between this peptide hormone and calcium in the adult cardiomyocyte. In a previous work in our laboratory, we reported that insulin increased intracellular Ca2+ in primary cultured neonatal cardiomyocytes. This response has two components, a rapid one characterized by its dependence by external Ca2+ and the L-type Ca2+ channel/ryanodine receptor, and a slow component depending on IP3/IP3 receptor signaling pathway. Interestingly the latter component mediates insulin effects on GLUT4 translocation to the plasma membrane and subsequent glucose uptake. Based on this evidence, we propose that insulin also increases intracellular Ca2+ levels in isolated adult rat cardiomyocytes through a mechanism involving extracellular and intracellular Ca2+. The aim of this work was to study the activation of insulin receptor downstream signaling pathway and its regulation by Ca2+ as well as the effects of insulin and IGF-1 on the intracellular Ca2+ levels in isolated adult rat cardiomyocytes. To this end, cells were exposed to 100 nM insulin for different time periods and the activation of the insulin receptor was assessed by its tyrosine autophosphorylation and the phosphorylation of protein kinases Akt (Ser 473) and Erk 1/2 by Western Blot. The presence of tyr1150/1151 insulin receptor in the adult rat cardiomyocyte was investigated by indirect immunofluorescence. These three signaling proteins reached a maximum activation at 5 min after insulin stimulation. On the other hand, cells preincubated with the fluorescent probe for calcium Fluo3-AM were studied by confocal microscopy to determine changes on intracellular Ca2+ levels induced by insulin and IGF-1. Both peptides did not produce any significant increases in intracellular calcium levels both in presence and absence of extracellular calcium and evaluating different cell areas and concentrations of the compounds. Stimuli like ionomycin and KCl, used as positive controls, increased intracellular Ca2+ levels in cardiac cells. Furthermore, insulin and IGF-1 did not affect the frequency of adult cardiomyocyte contraction. However, Akt phosphorylation on Ser 473 was lower in cells cultured with the intracellular calcium chelator BAPTA-AM that those cultured with medium containing this cation. In contrast, insulin receptor phosphorylation was not modified by BAPTA-AM on isolated adult rat cardiomyocytes. These results suggest that probably the differences in phenotype and genotype, as well as differences in energy substrate preferences by neonatal and adult cardiomyocytes could explain why both cell types behave differently with regard to the relationship between insulin and calcium. In summary, insulin activates its canonical signaling pathway in adult cardiomyocytes. However, neither insulin nor IGF-1 changed intracellular Ca2+ levels in isolated rat adult cardiomyocytes. However Ca2+ modulated the activation of the canonical insulin receptor signaling pathway at the level of Akt and future research should clarify these discrepancies

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Insulina y su receptor (RI) regulan el metabolismo de ácidos grasos y carbohidratos en el corazón. La activación de este receptor por su ligando endógeno desencadena una serie de eventos reguladores de la homeostasis energética del cardiomiocito. Se desconoce el efecto de insulina sobre los niveles de [Ca2+]i, un importante regulador de la contracción y de la transducción de señales en el cardiomiocito. Nuestro objetivo consistió en investigar el mecanismo mediante el cual insulina regula los niveles de [Ca2+]i en cultivos primarios de cardiomiocitos neonatos. Los resultados de inmunofluorescencia y microscopía confocal mostraron que el RI esta presente en la membrana plasmática, citoplasma y región perinuclear en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas, mientras que en cardiomiocitos adultos sólo se localizó en la membrana plasmática y sus inmediaciones. Los análisis Western blot revelaron que el RI está presente en extractos totales de cardiomiocitos y que al estimularlos con insulina 1 nM se activó la proteína kinasa ERK, un blanco río abajo conocido para el RI. Usando fluo-3AM y microscopía confocal se estableció que insulina aumentó en forma rápida (tiempo máximo: 1s) y transitoria (28 ± 6 seg) los niveles [Ca2+]i, alcanzando una respuesta máxima de 214 ± 31% [(ΔF/F)*100] (n=10) y dependiente de la concentración (0.1-1000 nM). Esta señal fue completamente bloqueada por genisteina (inhibidor inespecífico de tirosinas kinasas). Nifedipino (inhibidor del canal Ca2+ VLtype) bloqueó la señal rápida de Ca2+, dejando en evidencia una segunda señal mas lenta y de menor intensidad. Por otro lado, rianodina (inhibidor del canal de Ca2+ RyR) produjo un efecto similar al de nifedipino, sugiriendo una entrada de Ca2+ desde el espacio extracelular. La inhibición de PI3-K (LY294002), de PLC (U-73122) y la expresión adenoviral de un péptido secuestrador de subunidades βγ de proteína G heterotrimérica (Ad-βARKct), modificaron la cinética de la señal producida por insulina 1nM, registrándose señales rápidas de 1 seg de duración para cualquiera de estas condiciones. La inhibición de la proteína Gi/o con toxina pertussis solo modificó parcialmente el perfil cinético de la señal. De esta forma, nuestros resultados sugieren que aumenta los niveles de [Ca2+]i, a través de un mecanismo que involucra, en una primera etapa a la vía de transducción: IR-Ca2+ VLtype-RyR-Ca2+, y luego a la vía: IR-Gβγ-PI3K-PLC-IP3-Ca2+ / Insulin and its receptor (IR) regulate lipid and carbohydrate metabolism in the cardiac tissue. IR activation triggers a series of regulatory signaling events for cardiomyocyte energy homeostasis. Whether insulin changes intracellular calcium levels, an important second messeger for myocardial contraction remains unknown. Our aim was to investigate the mechanism by which insulin could regulate intracellular calcium levels in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Inmunofluorescence and confocal microscopy studies showed that the IR was detected in cytoplasmic membrane, cytoplasm and perinuclear region in primary cultured neonatal cardiomyocytes while in cultured adult rat cardiomyocytes was only located on or nearby the cytoplasmic membrane. Western blots analisis also revealed the presence of IR and the activation of ERK, a target in IR signaling molecule downstream of the IR, in total extract obtained from cardiomyocyte treated with insulin. Using Fluo3-AM and confocal microscopy, we detected that insulin increases fast (maximum after 1 sec) and transient (28 ± 6 sec) intracellular Ca2+ levels, reaching a maximum of 214 ± 1% [(ΔF/F)*100] (n=10). This effect was also concentration-dependent (0.1–1000 nM). This signal was completely blocked by genistein (a general tyrosine kinase inhibitor). Nifedipine (a Ca2+ V L-type channel inhibitor) blocked the first and fast signal of [Ca2+]i, revealing a more slower and smaller second component of the signal. Ryanodine (RyR channel Ca2+ blocker) produced an similar effect than nifedipine, suggesting a Ca2+ entry from the extracellular space. The inhibition of PI3K by LY- 294002, phosphoplipase C by U-73122 and the G protein βγ subunits by adenoviral expresion of a sequestering peptide (Adβarkct), modified the time-course of the insulin-induced signal, detecting fast increases in calcium levels for any of the studied experimental conditions. The inhibition of the αi/o subunit of G protein with pertussis toxin only modified partially the calcium kinetic pattern. Our results collectivelly suggest that insulin increases the [Ca2+]i levels by two signaling pathway, a first one involving the IR-Ca2+ VLtype-RyR-Ca2+ and a second conformed by IR-Gβγ-PI3K-PLC-IP3-Ca2+

Doctor en Bioquímica / Tanto los niveles intracelulares de Ca2+ ([Ca2+]i) como el transporte de la glucosa son fundamentales para la fisiología del cardiomiocito, sin embargo, aún no se ha investigado la interrelación entre ambos eventos. En esta tesis se investigó si insulina regula los niveles [Ca2+]i en el cardiomiocito, el mecanismo que participa y su papel en el transporte de glucosa vía GLUT4. Con este objetivo, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata se preincubaron con la sonda fluorescente para Ca2+ FLUO3-AM y se visualizaron los cambios en los niveles de Ca2+ por microscopia confocal. Las vías transduccionales que regulan los movimientos intracelulares de Ca2+ se intervinieron selectivamente con inhibidores químicos y herramientas genéticas. La captación de glucosa se evaluó utilizando [3H]-2-desoxiglucosa y los niveles de GLUT4 en la superficie celular se cuantificaron en cardiomiocitos no-permeabilizados transfectados con el plasmidio GLUT4-myc-eGFP. Los resultados mostraron que insulina indujo un rápido y transitorio aumento del [Ca2+]i en dos componentes. Los bloqueadores del canal L de Ca2+ nifedipino y del canal/receptor intracelular ryanodina sólo previnieron el primer componente componente. el segundo componente se redujo con: a) inhibidores selectivos del receptor de inositol-1,4,5-trifosfato: xestospongina C y 2 amino-etoxidifenilborato (2APB), b) disminución de la masa del receptor de IP3 vía siRNA y c) por transducción de un péptido inhibidor de señalización de las subunidades β de la proteína G (βark). La captación de glucosa inducida por insulina fue prevenida por el quelante del Ca2+ intracelular BAPTA-AM, 2 APB y βark, pero no por nifedipino ni ryanodina. De manera similar, la exposición del GLUT4-myc-eGFP en la membrana celular inducida por insulina fue inhibida por BAPTA-AM y xestospongina C, pero no por nifedipino. Sin embargo, este proceso también requirió la activación de PI3K y Akt para la segunda fase de liberación del [Ca2+]i y para la translocación del GLUT4. La transfección de un dominante negativo de PI3K inhibió parcialmente la exposición de GLUT4-myc-eGFP. En conclusión, insulina aumentó los niveles de [Ca2+]i vía IP3R en cultivos primarios de cardiomiocitos, regulando la captación de glucosa vía GLUT4. Esta nueva vía de señalización de insulina podría influenciar al metabolismo cardiaco en el miocardio adulto y estar modificada en condiciones metabólicas como son la obesidad, resistencia a insulina y diabetes / Intracellular calcium levels ([Ca2+]i) and glucose uptake are central to cardiomyocyte physiology, yet connections between them have not been studied. We investigated here whether insulin regulates [Ca2+]i in cultured cardiomyocytes, the participating mechanisms, and their influence on glucose uptake via glucose transporter 4 (GLUT4). Cultured neonatal rat cardiomyocytes were preloaded with the Ca2+ fluorescent dye FLUO3-AM and visualized by confocal microscopy. Ca2+ transport pathways were selectively targeted by chemical and molecular inhibition. Glucose uptake was assessed using [3H]2-deoxyglucose and surface GLUT4 levels were quantified in non-permeabilized cardiomyocytes transfected with GLUT4-myc-eGFP. Insulin stimulated a fast, two-component, transient increase in [Ca2+]i. Nifedipine and ryanodine prevented only the first component. The second one was reduced by inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3)-receptor selective inhibitors (xestospongin C, 2 amino-ethoxydiphenylborate), by type 2 IP3-receptor knockdown via siRNA, or by transfected G peptidic inhibitor ARKct. Insulin-stimulated glucose uptake was prevented by BAPTA-AM, 2-amino-ethoxydiphenylborate and ARK-ct, but not by nifedipine or ryanodine. Similarly, insulin-dependent exofacial exposure of GLUT4-myc-eGFP was inhibited by BAPTA-AM and xestospongin C but not by nifedipine. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and Akt were also required for the second phase of Ca2+-release and GLUT4 translocation. Transfected dominant-negative PI3K inhibited the latter. In conclusion, in primary neonatal cardiomyocytes, insulin induces an important component of Ca2+ release via IP3-receptor. This component signals to glucose uptake via GLUT4, revealing a so far unrealized contribution of IP3-sensitive Ca2+ stores to insulin action. This pathway may influence cardiac metabolism in conditions yet to be explored in adult myocardium

A redução dos hormônios gonadais seja pelo processo natural de falência folicular denominado nas humanas de menopausa, seja pela ooforectomia, está associado com aumento da incidência de doença cardiovascular em mulheres no período pós menopausa. O objetivo desse estudo é avaliar o efeito da ooforectomia e a suplementação com DHEA sobre a morfologia dos cardiomiócitos, a expressão de proteínas celulares envolvidas com crescimento e apoptose celular e a função cardíaca. A ooforectomia induz maior ganho de massa corporal e do coração, no entanto, a avaliação morfológica do VE mostrou que há uma redução da espessura dos cardiomiócitos e do número de núcleos. Ademais, o immunoblotting demonstrou uma diminuição na expressão das proteínas IR, IRS1 e AKT nos corações das ratas ooforectomizadas e os parâmetros hemodinâmicos foram semelhantes entre os grupos. O tratamento com DHEA reverteu a redução do número de núcleos sem interferir nos demais parâmetros avaliados. Os dados obtidos nos permite concluir que a ausência dos esteroides gonadais por si só resulta em modificações morfológicas dos cardiomiócitos que podem estar relacionados ao processo de apoptose sem afetar a função de bomba do coração e o uso do DHEA é capaz de reverter a redução numérica dos núcleos. / The reduction of gonadal hormones by menopause, the natural process of failure in the human follicle, or by surgical removal, is associated with increased incidence of cardiovascular disease in postmenopause women. The aim of this study is to evaluate the effect of oophorectomy and the DHEA supplementation on the morphology of cardiomyocytes, on the expression of proteins involved in cell growth, on apoptosis (IGF-1R, IR, IRS-1, PI3K, AKT, MAPKp42/44, JAK2) and on the cardiac function. Oophorectomy enhances both the body mass e heart weight, however the left ventricle showed a reduction in cardiomyocyte thickness by 15% and in the number of nuclei by 20%. Moreover the immunoblotting showed a decrease from 25 to 50% in the expression of IR, IRS-1 and AKT proteins in the hearts of oophorectomized rats. The hemodynamic parameters were similar between groups. Treatment with DHEA reversed the reduction in the number of nuclei with no change in the other parameters evaluated. Our data allow us to conclude that the absence of gonadal steroids per se induces morphological changes in the cardiomyocytes that may be related to apoptosis with no change on the heart pump function. The DHEA supplementation is able to reverse the reduced number of nuclei.

Em machos, tanto o envelhecimento quanto a obesidade induzida por dieta hiperlipídica (DHL) apresentam defeitos na ação insulínica, no entanto há carência de informações sobre fêmeas. Avaliamos a sensibilidade à insulina, tolerância à glicose, o padrão estral e a expressão de proteínas da via insulínica em hipotálamo e músculo de fêmeas C57BL6. Camundongos com 10 meses de vida e com 4 meses alimentados com DHL apresentaram aumento de coxins gordurosos, resistência à insulina e intolerância à glicose em relação a seus controles. A DHL induziu redução no número de corpos lúteos, precedido de alteração do padrão estral; aumento da expressão do IR e PI3K no hipotálamo e de PI3K/AKT1 e IL-6 em músculo gastrocnêmio. No hipotálamo dos animais com 10 meses foi detectada redução na expressão do IR e TNF alpha. Confirmamos a associação entre obesidade, resistência à insulina e intolerância a glicose induzidas por dieta hiperlipídica e envelhecimento em fêmeas. Além disso, nestes modelos foi detectada modificação na expressão do IR hipotalâmico de modo distinto. / In males, aging and obesity induced by high-fat diet (HFD) show defects in insulin action, but there is a lack of information about females. We evaluated the insulin sensitivity, glucose tolerance, estrous cycle and proteins expression of the intracellular insulin pathway in the hypothalamus and skeletal muscle of female C57BL6. Ten month-old mice and 4 mo HFD fed mice had increased fat pads, insulin resistance and glucose intolerance. The HFD fed group showed impaired estrous cycle pattern followed by reduced number of corpora lutea. There were also, increased IR and PI3K protein levels in the hypothalamus and increased PI3K/AKT1 and IL-6 proteins in skeletal muscle. In hypothalamus of 10 month-old mice there was a decreased IR and TNF alpha proteins level. Thus, our data confirm the association between obesity, insulin resistance and glucose intolerance induced by HFD and aging in female mice. Moreover, there were distinct change proteins in expression of the hypothalamic IR in both animal models.

A redução dos hormônios gonadais seja pelo processo natural de falência folicular denominado nas humanas de menopausa, seja pela ooforectomia, está associado com aumento da incidência de doença cardiovascular em mulheres no período pós menopausa. O objetivo desse estudo é avaliar o efeito da ooforectomia e a suplementação com DHEA sobre a morfologia dos cardiomiócitos, a expressão de proteínas celulares envolvidas com crescimento e apoptose celular e a função cardíaca. A ooforectomia induz maior ganho de massa corporal e do coração, no entanto, a avaliação morfológica do VE mostrou que há uma redução da espessura dos cardiomiócitos e do número de núcleos. Ademais, o immunoblotting demonstrou uma diminuição na expressão das proteínas IR, IRS1 e AKT nos corações das ratas ooforectomizadas e os parâmetros hemodinâmicos foram semelhantes entre os grupos. O tratamento com DHEA reverteu a redução do número de núcleos sem interferir nos demais parâmetros avaliados. Os dados obtidos nos permite concluir que a ausência dos esteroides gonadais por si só resulta em modificações morfológicas dos cardiomiócitos que podem estar relacionados ao processo de apoptose sem afetar a função de bomba do coração e o uso do DHEA é capaz de reverter a redução numérica dos núcleos. / The reduction of gonadal hormones by menopause, the natural process of failure in the human follicle, or by surgical removal, is associated with increased incidence of cardiovascular disease in postmenopause women. The aim of this study is to evaluate the effect of oophorectomy and the DHEA supplementation on the morphology of cardiomyocytes, on the expression of proteins involved in cell growth, on apoptosis (IGF-1R, IR, IRS-1, PI3K, AKT, MAPKp42/44, JAK2) and on the cardiac function. Oophorectomy enhances both the body mass e heart weight, however the left ventricle showed a reduction in cardiomyocyte thickness by 15% and in the number of nuclei by 20%. Moreover the immunoblotting showed a decrease from 25 to 50% in the expression of IR, IRS-1 and AKT proteins in the hearts of oophorectomized rats. The hemodynamic parameters were similar between groups. Treatment with DHEA reversed the reduction in the number of nuclei with no change in the other parameters evaluated. Our data allow us to conclude that the absence of gonadal steroids per se induces morphological changes in the cardiomyocytes that may be related to apoptosis with no change on the heart pump function. The DHEA supplementation is able to reverse the reduced number of nuclei.

Em machos, tanto o envelhecimento quanto a obesidade induzida por dieta hiperlipídica (DHL) apresentam defeitos na ação insulínica, no entanto há carência de informações sobre fêmeas. Avaliamos a sensibilidade à insulina, tolerância à glicose, o padrão estral e a expressão de proteínas da via insulínica em hipotálamo e músculo de fêmeas C57BL6. Camundongos com 10 meses de vida e com 4 meses alimentados com DHL apresentaram aumento de coxins gordurosos, resistência à insulina e intolerância à glicose em relação a seus controles. A DHL induziu redução no número de corpos lúteos, precedido de alteração do padrão estral; aumento da expressão do IR e PI3K no hipotálamo e de PI3K/AKT1 e IL-6 em músculo gastrocnêmio. No hipotálamo dos animais com 10 meses foi detectada redução na expressão do IR e TNF alpha. Confirmamos a associação entre obesidade, resistência à insulina e intolerância a glicose induzidas por dieta hiperlipídica e envelhecimento em fêmeas. Além disso, nestes modelos foi detectada modificação na expressão do IR hipotalâmico de modo distinto. / In males, aging and obesity induced by high-fat diet (HFD) show defects in insulin action, but there is a lack of information about females. We evaluated the insulin sensitivity, glucose tolerance, estrous cycle and proteins expression of the intracellular insulin pathway in the hypothalamus and skeletal muscle of female C57BL6. Ten month-old mice and 4 mo HFD fed mice had increased fat pads, insulin resistance and glucose intolerance. The HFD fed group showed impaired estrous cycle pattern followed by reduced number of corpora lutea. There were also, increased IR and PI3K protein levels in the hypothalamus and increased PI3K/AKT1 and IL-6 proteins in skeletal muscle. In hypothalamus of 10 month-old mice there was a decreased IR and TNF alpha proteins level. Thus, our data confirm the association between obesity, insulin resistance and glucose intolerance induced by HFD and aging in female mice. Moreover, there were distinct change proteins in expression of the hypothalamic IR in both animal models.

A angiotensina II (AngII) pode ativar as vias de sinalização das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs). Investigamos o papel da obesidade e das MAPKs na resposta à AngII em ratos obesos por injeção de glutamato monossódico (Ob). Artérias mesentéricas de resistência com endotélio intacto e não as artérias sem endotélio, isoladas de Ob, respondem menos à AngII. As respostas à noradrenalina e ao cloreto de potássio estavam inalteradas. Aumento da expressão do receptor AT2 (AT2R), da óxido nítrico sintase (eNOS) e da ERK1/2 podem estar envolvidos na menor resposta pois a inibição do AT2R, da eNOS e da ERK1/2 corrigiram-na. A maior ativação da ERK1/2 nos Ob levou à maior ativação da eNOS e maior geração de NO, diminuindo a resposta à Ang II. Concluímos que na obesidade, a resposta contrátil à Ang II é menor, como possível mecanismo adaptativo frente ao aumento da ativação do sistema renina-angiotensina. Esse mecanismo envolve a participação do endotélio com maior liberação de NO, aumento do número de AT2R, e da fosforilação da eNOS e da ERK1/2. / Angiotensin II (AngII) can activate mitogen-activated protein kinases (MAPKs) pathways. We investigated the role of obesity and MAPKs in AngII response in monosodium glutamate-induced obese rats (Ob). Endothelium-intact but not endothelium-denuded mesenteric resistance arteries isolated from Ob exhibited a lower response to AngII. The response to nordrenaline and potassium chloride were unaltered. Increased expression of AT2 receptor, nitric oxide synthase (eNOS) and ERK1/2 might be involved in the reduced response since inhibition of AT2R, eNOS and ERK1/2 corrected it. Increased activation of ERK 1/2 in Ob might activate eNOS, generating more NO and vasodilation that contributed to reduce the contraction to AngII. We concluded that, in obesity, the lower response to AngII might be an adaptive mechanism against the increased activation of the renin-angiotensin system. This mechanism involves the participation of the endothelium through a greater release of NO, increased AT2R, eNOS and ERK1/2 expressions.

A angiotensina II (AngII) pode ativar as vias de sinalização das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs). Investigamos o papel da obesidade e das MAPKs na resposta à AngII em ratos obesos por injeção de glutamato monossódico (Ob). Artérias mesentéricas de resistência com endotélio intacto e não as artérias sem endotélio, isoladas de Ob, respondem menos à AngII. As respostas à noradrenalina e ao cloreto de potássio estavam inalteradas. Aumento da expressão do receptor AT2 (AT2R), da óxido nítrico sintase (eNOS) e da ERK1/2 podem estar envolvidos na menor resposta pois a inibição do AT2R, da eNOS e da ERK1/2 corrigiram-na. A maior ativação da ERK1/2 nos Ob levou à maior ativação da eNOS e maior geração de NO, diminuindo a resposta à Ang II. Concluímos que na obesidade, a resposta contrátil à Ang II é menor, como possível mecanismo adaptativo frente ao aumento da ativação do sistema renina-angiotensina. Esse mecanismo envolve a participação do endotélio com maior liberação de NO, aumento do número de AT2R, e da fosforilação da eNOS e da ERK1/2. / Angiotensin II (AngII) can activate mitogen-activated protein kinases (MAPKs) pathways. We investigated the role of obesity and MAPKs in AngII response in monosodium glutamate-induced obese rats (Ob). Endothelium-intact but not endothelium-denuded mesenteric resistance arteries isolated from Ob exhibited a lower response to AngII. The response to nordrenaline and potassium chloride were unaltered. Increased expression of AT2 receptor, nitric oxide synthase (eNOS) and ERK1/2 might be involved in the reduced response since inhibition of AT2R, eNOS and ERK1/2 corrected it. Increased activation of ERK 1/2 in Ob might activate eNOS, generating more NO and vasodilation that contributed to reduce the contraction to AngII. We concluded that, in obesity, the lower response to AngII might be an adaptive mechanism against the increased activation of the renin-angiotensin system. This mechanism involves the participation of the endothelium through a greater release of NO, increased AT2R, eNOS and ERK1/2 expressions.

A administração de deidroepiandrosterona (DHEA) tem resultado em efeitos anti-diabetogênicos em animais de experimentação e no homem. Assim, o objetivo desse trabalho é avaliar o efeito do DHEA in vitro na expressão protéica do IR, do IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, ERK-1/2; na expressão gênica do PDX-1, do PGC-1, da insulina, do GLUT-2 e da glicocinase; e avaliar a secreção estática de insulina de ilhotas pancreáticas de ratos. O cultivo das ilhotas por 24 horas com DHEA, não induziu nenhuma alteração tanto na expressão das proteínas quanto na secreção estática de insulina estimulada por glicose. Ocorreu aumento da fosforilação de ERK-1/2 e na expressão gênica do PGC-1. As células RINm5F, cultivadas por 72 horas com DHEA, apresentaram aumento da expressão total de IRS-1 e IRS-2. Concluímos, que 24 horas de cultura com ilhotas não é tempo suficiente para observar nenhuma alteração induzida pelo DHEA, na secreção de insulina, e na expressão das proteínas da via IRS/PI3-K/Akt. Células RINm5F podem ser um modelo alternativo para investigar os efeitos diretos do DHEA. / The dehydroepiandrosterone (DHEA) administration has resulted in reduction of abdominal fat and protection against insulin resistance from experimental animals and humans. So, the purpose of this project is measure the in vitro effects from DHEA: on protein expression of insulin receptor, the proteins IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt, and ERK-1/2; on gene expression of transcriptional factors PDX-1 and PGC-1, insulin, glucose transport GLUT-2 and glicocinase; and to measure the static insulin secretion, on cultured pancreatic islets of the rat. The culture of pancreatic islet for 24 hours with DHEA, did not induce nothing alteration on protein expression of the IR, IRS-1, IRS-2, PI3-K, Akt-1 and ERK-1/2, and static insulin secretion induced by glucose. However, happened increase ERK-1/2 phosphorylation and PGC-1 gene expression. The RINm5F cells, cultured by 72 hours, showed increase of the IRS-1 and IRS-2 expression. We conclude that 24 hours of the pancreatic islets culture are not sufficient time to look any alteration induced by DHEA, on insulin secretion, and on protein expression involved on IRS/PI3-K/Akt pathway. RINm5F cells can be an alternative model to research the direct effects from DHEA.