This master thesis deals with monitoring of a content of deoxynivalenol, its metabolite deoxynivalenol-3-b-D-glucopyranoside and ochratoxin A in beer samples collected from retail market in the Czech Republic, Poland and Slovakia. The theoretical part describes general characteristics of mycotoxins, its transfer from field barely through malt to beer and its occurrence in beers. Malting process and brewing technology were also mentioned. Subsequently possibilities for a determination of the mycotoxins by the chromatografic and immunochemical method were presented. The experimental section describes analysis of 30 samples of beer. The analyses were conducted using ultra high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection (UPLC/FLR) for ochratoxin A and high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometer (HPLC/MS) for deoxynivalenol and its metabolite. Ochratoxin A was detected in 25 of the 30 samples in concentration range of 0,6 - 82,5 ng·l-1. Deoxynivalenol was found in 24 of the 30 samples with concentration range of 2,29 - 12,57 ug·l-1 and deoxynivalenol-3-b-D-glucopyranoside was occure in 19 of the 30 samples in concentration range of 2,45 - 12,47 ug·l-1. It was also assessed the relationship between beer gushing and presence of mycotoxins in beer. No connection between the parameters has been found. Consequently it is not possible to predict beer gushing from the presence of mycotoxins.

The topic of this Master thesis is The Monitoring of Biologically Active Substances of Coffee. The technological production of coffee beans from harvesting the crops to the final packaging is described in the theoretical part, together with the chemical composition of both green and roasted coffee beans. The next part sums up the current knowledge of biologically active substances that can be found in coffee and their effect on human health. The main focus has been put on phenolic compounds and their antioxidant properties. The last chapter of the theoretical part tells of modern ways which are used to define phenolic compounds. The practical part of the thesis identifies phenolic compounds in coffee beans of two kinds, Coffea arabica and Coffea canephora, roasted at different temperatures and in the range from very raw beans to over-roasted ones. A highly efficient High Performance Liquid Chromatography in connection with Mass Spectrometry has been used to detect the most significant phenolic compounds.

The thesis deals with monitoring of ascorbic acid and other substances in selected fruit drinks. The theoretical part begins with a summary of knowledge about the occurrence and importance of ascorbic acid and their physiological effects. Furthermore, the content of vitamin C in individual fruits is compared. The following part deals with the division of soft drinks and raw materials, used for the production of soft fruit drinks. Part of the thesis is focused on the technology of fruit juice production obtained by direct pressing of fruit material and technology of fruit drinks production from fruit concentrates. The practical part is focused on determination of vitamin C concentration as well as vitamins of group B (B1, B2, B3, B5, B6) and organic acids (citramic acid, citric acid, malic acid, pyruvic acid and succinic acid) in samples of direct fruit juices and juice from concentrate. Mass spectrometer-coupled high-performance liquid chromatography (HPLC-MS) was used to detect vitamin C and other substances.

The thesis on Monitoring alkaloids in tomatoes describes a group of alkaloids and also some of them. The thesis focuses on the Solanaceae family, especially the tomato plant, tomato production, important substances and their influence on human health. The thesis presents information about tomato products and their quality which is influenced by the general material. Furthermore, separative and identification methods which can qualify alkaloids are described. In the practical part of the thesis the content of alkaloids in whole tomato plant is found out qualitatively by DESI and DART technic, the amount of the present alkaloids in unripe fruit, semi-ripe fruit and ripe fruit quantitatively by High Performance Liquid Chromatography connected with Mass Spectrometry (HPLC/MS). The volume of alkaloids in tomato juice, ketchup and tomato paste are determined.

Tumors of the adrenal gland belong to the most frequent neoplasms in humans with a prevalence of 3–10 % in adults. The aim of the diagnostic workup is the identification of potentially hormone-secreting and / or malignant tumors, because most of these tumors will require surgical resection. Malignant adrenocortical carcinomas (ACC) are very rare and associated with a poor prognosis in advanced stages, therefore, an early and accurate diagnosis is crucial. Within this thesis, two liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) methods for the quantification of steroids in different biomaterials were developed to improve the diagnostic workup of adrenal tumors. First, an LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of cortisol and dexamethasone in serum samples after dexamethasone suppression test (DST) was developed, validated, and applied to 400 clinical samples. Newly established method-specific threshold concentrations for cortisol and dexamethasone increased DST specificity from 67.5 % to 92.4 % while preserving 100 % sensitivity. Second, an LC-MS/MS method for the quantification of eleven urinary steroids was developed and validated to improve the differentiation between ACC and adrenocortical adenomas (ACA). A decision tree requiring only two steroids was trained for classification and tested based on 24 h urine samples from 268 patients with adrenal tumor. Malignancy was excluded with a negative predictive value of 100 % in an independent validation cohort of 84 samples of 24-h urine. A newly proposed simplified diagnostic workflow with urinary steroid profiling as first tier test could obviate additional adrenal-specific imaging in 42 of 64 patients with ACA. The new DST method is already in clinical use at the University Hospital Würzburg, whereas the classification model based on urinary steroid profiling will require prospective validation in a larger cohort. / Nebennierentumoren gehören zu den häufigsten Neoplasmen beim Menschen und treten mit einer Prävalenz von 3–10 % bei Erwachsenen über 50 Jahren auf. Häufig wird die Raumforderung zufällig im Rahmen einer bildgebenden Untersuchung erkannt. Die meisten dieser sogenannten Inzidentalome sind gutartige und hormoninaktive Nebennierenrindenadenome (ACA), die keine therapeutische Intervention erfordern. Das Ziel der Nebennierentumor-Diagnostik ist die Abklärung potentieller Hormonaktivität und Malignität, denn diese Tumoren müssen zum Großteil operativ entfernt werden. Hormonaktive Tumoren können benigne oder maligne sein und sind durch die autonome Sekretion von Steroidhormonen charakterisiert. Maligne Nebennierenrindenkarzinome (ACC) sind sehr selten, aber aggressiv und mit einer schlechten Prognose im fortgeschrittenen Tumorstadium assoziiert. Da die therapeutischen Möglichkeiten für das ACC limitiert sind, ist eine schnelle und sichere Diagnostik erforderlich. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) Methoden zur Quantifizierung von Steroiden in Biomaterialien entwickelt, um damit die Diagnostik von Nebennierentumoren zu verbessern. Der 1 mg-Dexamethason-Hemmtest (DST) ist ein häufig durchgeführter Screening-Test zur Untersuchung auf autonome Cortisolsekretion. Dabei wird die Supprimierbarkeit der Cortisolsekretion durch die orale Einnahme von Dexamethason überprüft. Eine LC-MS/MS Methode zur simultanen Quantifizierung von Cortisol und Dexamethason im Serum wurde entwickelt, validiert und zur Messung von 400 DST-Patientenproben genutzt. Durch methodenspezifische Schwellenwertkonzentrationen für Cortisol und Dexamethason konnte die klinische Testspezifität von 67.5 % auf 92.4 % bei unveränderter Sensitivität von 100.0 % erhöht werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Verbesserung der Unterscheidung von ACC und ACA. Dafür wurde eine LC-MS/MS Methode zur Quantifizierung von elf Steroiden im Urin entwickelt und validiert. Über die Messung von 24 h Sammelurinproben von 268 Nebennierenrindentumor-Patienten wurde ein Klassifikationsmodell, das auf nur zwei Steroiden basiert, trainiert und getestet. Sowohl die analytische Methode als auch das Klassifikationsmodell wurden hinsichtlich Robustheit und Zeiteffizienz optimiert, um sich möglichst gut in die klinische Routine implementieren zu lassen. Außerdem lag der Fokus auf einer einfachen, nachvollziehbaren und direkten Datenauswertung und -interpretation. Als ein Hauptergebnis konnte Malignität in einer unabhängigen Validierungskohorte von 84 Patienten mit einem negativen prädiktiven Wert von 100 % ausgeschlossen werden. Nach einem vereinfachten diagnostischen Schema mit der Urin-Steroid-Analytik als erstem Screening-Test könnte bei 42 von 64 Patienten mit ACA auf eine zusätzliche nebennierenspezifische Bildgebung verzichtet werden. Des Weiteren wurden erstmals Spontanurinproben als Surrogatmatrix für 24 h Sammelurin in der Validierungskohorte getestet. Dabei unterschied sich der positive prädiktive Wert der Spontanurine mit 86.7 % kaum von den 87.5 % der 24-h Sammelurine, während auch mit Spontanurin ein negativer prädiktiver Wert von 100 % erzielt werden konnte, was einen wichtigen Schritt in die Richtung einer vereinfachten Probensammlung darstellt. Sowohl die simultane Quantifizierung von Cortisol und Dexamethason als auch die 24-h Urin-Steroid-Methode haben ihre Eignung für die klinische Routineanwendung bewiesen. Der Transfer der Urinmethode auf den deutlich einfacheren Spontanurin erfordert jedoch eine prospektive Validierung in einer größeren Patientenkohorte. Die neue DST-Methode wurde bereits im September 2021 in die klinische Routine am Universitätsklinikum Würzburg eingeführt.

Capparis spinosa is a wild and cultivated bush, which grows mainly in the Mediterranean Basin. Unopened flower buds, called capers are used in the Mediterranean cuisine as flavoring for meat, vegetable and other foods. Several studies evaluated bioactive component and antioxidant activity of Capparis spinosa, increasing the market demand and the economic importance of capers. The aim of this work was to evaluate the contents of bioactive compounds in floral buds fermented in salt of C. spinosa collected from different areas of Pantelleria Island (Italy), testing the effect on healthy function as total antioxidant compounds. Hydrophilic extracts of C. spinosa from Pantelleria Island were characterized by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Among 24 compounds were detected and quantified by HPLC-MS technique: several Kaempherol and Quercetin derivate were characterized, based on UV spectra and MSn fragmentation pattern. The antioxidative activity of caper hydrophilic extracts was assessed in a number of chemical assays (ORAC, DPPH and ABTS). In order to determine the genetic diversity within and among populations of Capparis spinosa from Pantelleria Island, AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism) markers were employed. Moreover, in the present study, a commercial model of an Electronic Nose (EN), EOS835 (Sacmi), was preliminarily used to investigate the flavor profile of capers. The EN technique was comparated with a classical techniques gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis, using Head Space Solid-Phase Microextraction (HS-SPME) as a solvent-free sample preparation method. / Capparis spinosa es un arbusto silvestre y cultivado, que crece principalmente en la cuenca mediterránea. Cuando los botones de las flores aún no están abiertas reciben el nombre de alcaparras y se utilizan en la alimentación. Varios estudios han demostrado la presencia de un número de componentes bioactivos in C. spinosa y su actividad antioxidante, lo que ha provocado un aumento de su demanda y ha incrementado la importancia económica de las alcaparras. El propósito de este trabajo fue evaluar el contenido de compuestos bioactivos en el capullo de la flor de C. spinosa conservado en salmuera, procedente de diferentes zonas de la isla de Pantelleria (Italia). Los resultados se expresan como actividad antioxidante total. La actividad antioxidante de los extractos hidrófilos de alcaparra se evaluó mediante pruebas químicas (ORAC, DPPH, ABTS). Con el fin de determinar la diversidad genética dentro y entre poblaciones de C. Spinosa, se utilizaron marcadores moleculares del tipo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Los extractos hidrófilos de C. spinosa se caracterizaron mediante cromatografía líquida de alta eficacia - ionización electrospray acoplada a espectrometría de masas. Se han identificado y cuantificado aproximadamente 24 compuestos con la técnica de HPLC-MS, y se han caracterizado varios derivados de kaempferol y quercetina, sobre la base de los espectros UV y con el modelo de fragmentación MSn. En el este estudio también se ha utilizado un modelo de nariz electrónica comercial (ES), EOS835 (Sacmi), para un estudio preliminar del perfil de aroma de las alcaparras. La técnica ES se ha comparado con una técnica de análisis clásicos tales como la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), utilizando como método de preparación de la muestra el espacio de cabeza de microextracción en fase sólida (HS-SPME) libre de disolventes. / Capparis spinosa és un arbust silvestre i conreat, que creix principalment a la conca mediterrània. Quan els botons de les flors encara no estan obertes reben el nom de tàperes i s'utilitzen en l'alimentació. Diversos estudis han demostrat la presència d'un nombre de components bioactius in C. spinosa i la seva activitat antioxidant, el que ha provocat un augment de la seva demanda i ha incrementat la importància econòmica de les tàperes. El propòsit d'aquest treball va ser avaluar el contingut de compostos bioactius en el capoll de la flor de C. spinosa conservat en salmorra, procedent de diferents zones de l'illa de Pantelleria (Itàlia). Els resultats s'expressen com a activitat antioxidant total. L'activitat antioxidant dels extractes hidròfils de tàperes es va avaluar mitjançant proves químiques (ORAC, DPPH, ABTS). Per tal de determinar la diversitat genètica dins i entre poblacions de C. Spinosa, es van utilitzar marcadors moleculars del tipus AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Els extractes hidròfils de C. spinosa es van caracteritzar mitjançant cromatografia líquida d'alta eficàcia - ionització electrospray acoblada a espectrometria de masses. S'han identificat i quantificat aproximadament 24 compostos amb la tècnica d'HPLC-MS, i s'han caracteritzat diversos derivats de kaempferol i quercetina, sobre la base dels espectres UV i amb el model de fragmentació MSN. Al aquest estudi també s'ha utilitzat un model de nas electrònic comercial (ES), EOS835 (Sacmi), per a un estudi preliminar del perfil d'aroma de les tàperes. La tècnica ÉS s'ha acoblat amb una tècnica d'anàlisi clàssics com ara la cromatografia de gasos acoblada a espectrometria de masses (GC-MS), utilitzant com a mètode de preparació de la mostra l'espai de cap de microextracció en fase sòlida (HS-SPME ) lliure de dissolvents. / Lo Bosco, F. (2017). Evaluation of antioxidant properties and assessment of genetic diversity of Capparis spinosa cultivated in Pantelleria Island [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/79872

In the past two decades, the identification of the structures involved in the mechanisms of cancer development have led to a paradigm shift in cancer therapy. Since 2001 orally administered small molecules such as kinase inhibitors are fundamental drugs in the personalized and targeted therapy of hematologic and oncologic neoplasms. However, side effects, therapeutic success is often accompanied by relevant restrictions, which may result in disease progression, a low quality of life, or treatment discontinuation. In addition, for some kinase inhibitors, therapy failure during treatment after an initially good response has been reported. It is known that the response to drug therapy varies considerably in patients. The same dosage may be effective in some patients while ineffective or toxic in others. Interindividual variabilities in drug exposure, and consequently sub- or supratherapeutic serum concentrations may be the cause. Factors such as drug-drug- or food-drug-interactions with drug-metabolizing enzymes and lifestyle (e.g., smoking, weight) are known to cause interindividual differences. In general, oral administration is predetermined to cause large interindividual variability in drug exposure because absorption in the gastrointestinal tract depends on food intake and the intragastric pH. For the recently approved kinase inhibitors afatinib, axitinib, bosutinib, cabozantinib, dabrafenib, lenvatinib, nilotinib, osimertinib, ruxolitinib, and trametinib, interindividual variability despite the same dosage has been described. So far, knowledge on the serum exposure and the therapeutically relevant serum concentrations from clinical routine is scarce. It is unclear whether side effects correlate with achieved serum concentrations and if therapy failure correlates with subtherapeutic serum concentrations. Innovation and paradigm shift are not only observed in cancer therapy but also in the handling of complications following cancer therapy. In patients undergoing allogeneic stem cell transplantation (allo-HSCT), cytomegalovirus (CMV) reactivation and disease are associated with increased transplant related mortality. Letermovir is a novel anti-CMV drug, which is used for prophylaxis in adult CMV-seropositive allo-HSCT recipients. Letermovir represents a scientific breakthrough, as the side effect profile compares favorably with the known highly toxic anti-CMV agents. However, letermovir is the victim and perpetrator in many clinically relevant drug-drug-interactions. As known from other anti-viral agents, inter- or intraindividual variability in systemic exposure may lead to therapy failure or the development of drug resistance. In vitro and clinical observations suggest that letermovir has a low genetic barrier to resistance. So far, knowledge on the serum exposure and the therapeutically relevant serum concentrations of letermovir from clinical routine is scarce. The objective of this work was to develop bioanalytical methods which are then used for the quantification of the systemic exposure of the ten kinase inhibitors and the anti-CMV agent letermovir in clinical routine. The aim was to gain first insights into the achieved serum concentration and the extent of interindividual variability in treated patient in a real-life setting. First, a high-performance-liquid chromatography (HPLC) method coupled with tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantification of the ten kinase inhibitors was developed and validated according to the relevant U.S. Food and Drug Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMA) guidelines. Expected cabozantinib, dabrafenib, nilotinib and osimertinib serum concentrations were quantifiable using the less sensitive but widely available diode array detector (DAD). Therefore, a cost-efficient alternative using HPLC coupled with DAD was developed and validated accordingly. The HPLC-DAD method was cross-validated using the gold standard LC-MS/MS and patient samples. For all four kinase inhibitors over 67% of patient samples per compound met FDA and EMA limits for reanalysis and EMA limits for cross-validation. The results indicate that the measured concentrations are comparable when using two different detectors. The developed LC-MS/MS method was applied to measure patient serum samples. Patients receiving the commonly used kinase inhibitors cabozantinib, dabrafenib, nilotinib, osimertinib, ruxolitinib and trametinib showed a high interindividual variability in serum concentrations for the same kinase inhibitor at the same dosage. The number of patients receiving afatinib (one) and osimertinib (two) was not sufficient to draw definite conclusions. Within this work, more detailed investigations were conducted in melanoma patients treated with dabrafenib and trametinib and in patients who received ruxolitinib after allo-HSCT for the treatment of Graft-versus-Host-Disease (GvHD). In melanoma patients, the median of the individual mean trough levels was 45.0 ng/mL (range: 20-155 ng/mL, dosage: 150 mg twice daily). For trametinib, the median of the mean trough levels was 11.2 ng/mL (range: 6.22-15.9 ng/mL, dosage: 2 mg once daily). Dose adjustments because of undesirable side effects in clinical routine were common. The observed data do not support a general monitoring of dabrafenib and trametinib in clinical routine. However, they provide the evidence for associations between toxicity and exposure, supporting the existing literature. Therefore, measuring exposure may assist decision-making regarding dose adjustments in clinical routine. In GvHD patients, a high degree of inter individual variability in median serum trough levels was observed: 39.9 ng/mL (range: 5.6-99.8 ng/mL, dosage: 10 mg twice daily). Patients not requiring dose reduction due to side effects had a significantly higher median of individual mean trough serum concentrations at the same daily dose (39.8 ng/mL versus 60.6 ng/ml). The study showed that a serum concentration of 21.1 ng/mL before next dose intake was associated with experiencing at least three side effects which should be evaluated in future studies. The study in GvHD patients showed that ruxolitinib, a predominantly Cytochrome P450 (CYP) 3A4 substrate, is commonly co-administered with posaconazole, a CYP3A4 inhibitor. Depending on the regulatory agency, the recommendations regarding dose adjustment were different (no (FDA) vs. 50% (EMA) dose adjustment). The magnitude of drug-drug-interaction in our clinical situation was investigated by developing a physiologically-based pharmacokinetic model using PK-Sim. The model predicted an increase in ruxolitinib maximum plasma concentration and area under the concentration-time curve by 20.5% and 59%, respectively, due to the concomitant posaconazole administration. The observed data do not support a general dose reduction by 50%, as suggested by the EMA. However, given the observed high degree of variability in ruxolitinib exposure some patients may be at risk for ruxolitinib overexposure because of the described interaction. Therefore, standard dosing should be applied with caution and ruxolitinib exposure should be monitored to identify patients at risk for overexposure and associated toxicity. For the quantification of letermovir serum concentrations a HPLC-DAD method was developed, validated, and applied to patient samples. A high degree of interindividual variability was observed. The analysis of trough concentrations revealed a median letermovir concentration of 2,603 ng/mL ( range: 175–12,281 ng/mL). The data represent first findings on letermovir exposure in routine clinical practice and remain to be placed in a clinical context. The developed methods and the results of this work provide the basis for future clinical investigations regarding dose individualization for the investigated kinase inhibitors and letermovir. Given the observed variability between patients at the same dosage, the methods are helpful to identify patients at risk for over- or underdosing at an early stage during therapy. Measuring drug exposure and establishing safe and effective therapeutic ranges may assist decision-making regarding dose adjustments in clinical routine. / In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Identifizierung von Strukturen, die an den Mechanismen der Krebsentstehung beteiligt sind, zu einem Paradigmenwechsel in der Krebstherapie geführt. Seit 2001 sind oral verabreichte „small molecules“ wie Kinase-Inhibitoren grundlegende Bestandteile der personalisierten und gezielten Therapie von hämatologischen und onkologischen Neoplasien. Aufgrund ihrer Nebenwirkungen ist der therapeutische Erfolg jedoch oft mit erheblichen Einschränkungen verbunden, die unter anderem zum Fortschreiten der Krankheit, zu einer geringen Lebensqualität oder zum Abbruch der Behandlung führen können. Darüber hinaus wird bei einigen Kinase-Inhibitoren über Therapieversagen während der Behandlung nach anfänglich gutem Ansprechen berichtet. Es ist bekannt, dass das Ansprechen auf eine Arzneimitteltherapie bei Patienten sehr unterschiedlich ausfällt. Die gleiche Dosierung kann bei einigen Patienten wirksam, bei anderen dagegen unwirksam oder toxisch sein. Interindividuelle Schwankungen in der Serum- oder Plasmakonzentration und folglich sub- oder supratherapeutischen Serumkonzentrationen können die Ursache sein. Faktoren wie Interaktionen zwischen Enzymen des Metabolismus und Arzneimitteln oder Nahrungsmitteln, und der Lebensstil (beispielsweise Raucherstatus und Gewicht) können zu interindividuellen Unterschieden in der Arzneimittelexposition führen. Im Allgemeinen ist bei oraler Verabreichung eine große interindividuelle Variabilität der Arzneimittelexposition zu erwarten, da die Absorption im Gastrointestinaltrakt von der Nahrungsaufnahme und dem pH-Wert im Magen abhängt. Für die kürzlich zugelassenen Kinase-Inhibitoren Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Dabrafenib, Lenvatinib, Nilotinib, Osimertinib, Ruxolitinib und Trametinib wurde eine Variabilität der Serumspiegel zwischen Patienten bei gleicher Dosierung beschrieben. Bislang gibt es nur wenige Erkenntnisse über die Serumexposition und die therapeutisch relevanten Serumkonzentrationen aus der klinischen Routine. Es ist unklar, ob Nebenwirkungen mit den erreichten Serumkonzentrationen korrelieren, und ob ein Therapieversagen mit subtherapeutischen Serumkonzentrationen zusammenhängt. Innovation und Paradigmenwechsel sind nicht nur in der Krebstherapie zu beobachten, sondern auch bei der Behandlung von Komplikationen nach einer Krebstherapie. Bei Patienten, die sich einer allogenen Stammzelltransplantation (allo-HSCT) unterziehen, sind die Reaktivierung des Cytomegalievirus (CMV) und die Erkrankung mit einer erhöhten transplantationsbedingten Sterblichkeit verbunden. Letermovir ist ein neues Anti-CMV-Medikament, das zur Prophylaxe bei erwachsenen CMV-seropositiven allo-HSCT-Empfängern eingesetzt wird. Letermovir stellt einen wissenschaftlichen Durchbruch dar, da das Nebenwirkungsprofil im Vergleich zu den bekannten hochtoxischen Anti-CMV-Wirkstoffen günstig ist. Letermovir ist jedoch Opfer und Verursacher vieler klinisch relevanten Arzneimittelwechselwirkungen. Wie von anderen antiviralen Arzneimitteln bekannt, können inter- oder intraindividuelle Schwankungen der systemischen Exposition zu Therapieversagen oder der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen führen. In-vitro- und klinische Beobachtungen deuten darauf hin, dass Letermovir eine niedrige genetische Barriere für Resistenzen aufweist. Bislang gibt es jedoch nur wenige Daten zur Serumexposition und die therapeutisch relevanten Serumkonzentrationen von Letermovir aus der klinischen Routine. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bioanalytische Methoden entwickelt, die dann zur Quantifizierung der systemischen Exposition der zehn genannten Kinase-Inhibitoren und des Anti-CMV-Wirkstoffes Letermovir in der klinischen Routine eingesetzt wurden. Ziel war es, erste Erkenntnisse über die erreichten Serumkonzentrationen und das Ausmaß der interindividuellen Variabilität bei behandelten Patienten in einer realen Umgebung zu gewinnen. Zunächst wurde eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Methode (HPLC) gekoppelt mit einem Tandem-Massenspektrometer (LC-MS/MS) zur Quantifizierung der zehn Kinase-Inhibitoren entwickelt und gemäß den einschlägigen Richtlinien der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittelagentur (EMA) validiert. Die erwarteten Cabozantinib-, Dabrafenib-, Nilotinib- und Osimertinib-Serumkonzentrationen waren mit dem weniger empfindlichen, aber weit verbreiteten Diodenarray-Detektor (DAD) quantifizierbar. Daher wurde eine kosteneffiziente, alternative Methode unter Verwendung von HPLC gekoppelt mit DAD entwickelt und entsprechend validiert. Die HPLC-DAD-Methode wurde mit dem Goldstandard LC-MS/MS und Patientenproben kreuzvalidiert. Bei allen vier Kinase-Inhibitoren erfüllten pro Substanz mehr als 67 % der Patientenproben die FDA- und EMA-Grenzwerte für die Reanalyse und die EMA-Grenzwerte für die Kreuzvalidierung. Die Ergebnisse zeigen, dass die gemessenen Konzentrationen mithilfe der unterschiedlichen Detektoren vergleichbar sind. Mit der LC-MS/MS-Methode wurden Serumproben von Patienten gemessen. Patienten, die mit den häufig verwendeten Kinase-Inhibitoren Cabozantinib, Dabrafenib, Nilotinib, Osimertinib, Ruxolitinib und Trametinib behandelt wurden, zeigten bei gleicher Dosierung eine hohe interindividuelle Variabilität der Serumkonzentrationen. Die Anzahl der Patienten, die Afatinib (einer) und Osimertinib (zwei) erhielten, reichte nicht aus, um eindeutige Schlussfolgerungen zu ziehen. Im Rahmen der Arbeit wurden detailliertere Untersuchungen bei Patienten mit Melanom, die mit Dabrafenib und Trametinib behandelt wurden, sowie bei Patienten, die Ruxolitinib nach einer allo-HSCT im Rahmen Behandlung der Graft-versus-Host-Disease (GvHD) erhielten, durchgeführt. Bei Melanompatienten lag der Median der individuellen mittleren Talspiegel für Dabrafenib bei 45,0 ng/mL (Spannweite: 20-155 ng/mL, Dosierung: 150 mg zweimal täglich). Für Trametinib lag der Median der mittleren Talspiegel bei 11,2 ng/mL (Spannweite: 6,22-15,9 ng/mL, Dosierung: 2 mg einmal täglich). Dosisanpassungen aufgrund von unerwünschten Nebenwirkungen in der klinischen Routine waren häufig. Die beobachteten Daten sprechen nicht für eine generelle Überwachung der Dabrafenib- und Trametinib-Spiegel in der klinischen Routine. Sie weisen jedoch darauf hin, dass es zwischen Toxizität und Exposition einen Zusammenhang gibt, und stützen damit die bestehende Literatur. Daher kann die Messung der Exposition bei Entscheidungen in Bezug auf die Dosisanpassung hilfreich sein. Bei GvHD-Patienten wurde ein hohes Maß an interindividueller Variabilität der mittleren Serum-Talspiegel beobachtet: 39,9 ng/mL (Spannweite: 5,6-99,8 ng/mL, Dosierung: zweimal täglich 10 mg). Bei Patienten, die keine Dosisreduzierung aufgrund von Nebenwirkungen benötigten, war der Median der individuellen mittleren Serum-Talspiegel bei gleicher Tagesdosis signifikant höher (39,8 ng/mL versus 60,6 ng/mL). Eine Serumkonzentration von 21,1 ng/mL vor der nächsten Dosiseinnahme konnte mit dem Auftreten von mindestens drei Nebenwirkungen jeglichen Grades assoziiert werden. Dieser Wert sollte in zukünftigen Studien evaluiert werden. Die Studie an GvHD-Patienten zeigte, dass Ruxolitinib, ein vorwiegend über Cytochrome P450 (CYP) 3A4 verstoffwechseltes Substrat, häufig zusammen mit Posaconazol, einem CYP3A4-Inhibitor, verabreicht wird. Je nach Zulassungsbehörde waren die Empfehlungen zur Dosisanpassung unterschiedlich (keine laut FDA bzw. 50 % Dosisanpassung laut EMA). Das Ausmaß der Arzneimittelwechselwirkung, in der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten klinischen Studie, wurde durch die Entwicklung eines physiologisch basierten pharmakokinetischen Modells mit PK-Sim untersucht. Mithilfe des Modells wurde ein Anstieg der maximalen Plasmakonzentration von Ruxolitinib und der Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve um 20,5 % bzw. 59 % aufgrund der gleichzeitigen Verabreichung von Posaconazol vorausgesagt. Die Daten sprechen nicht für eine allgemeine Dosisreduktion um 50 %, wie von der EMA vorgeschlagen. Angesichts der beobachteten großen Variabilität der Ruxolitinib-Exposition besteht jedoch bei einigen Patienten, aufgrund der beschriebenen Wechselwirkung, möglicherweise ein Risiko für eine Ruxolitinib-Überdosierung. Daher sollte die Standarddosierung mit Vorsicht angewendet und die Ruxolitinib-Exposition überwacht werden, um Patienten zu identifizieren, bei denen ein Risiko für eine Überexposition und eine damit verbundene Toxizität besteht. Zur Quantifizierung der Letermovir-Serumkonzentrationen wurde eine HPLC-DAD-Methode entwickelt, entsprechend den Richtlinien der EMA und FDA validiert und auf Patientenproben angewendet. Es wurde ein hohes Maß an interindividueller Variabilität beobachtet. Die Analyse des Talspiegel ergab eine mediane Letermovir-Konzentration von 2.603 ng/mL (Spannweite: 175-12.281 ng/mL). Die Daten stellen erste Erkenntnisse zur Letermovir-Exposition in der klinischen Routine dar und bleiben in den klinischen Kontext einzuordnen. Die entwickelten Methoden und die Ergebnisse dieser Arbeit bilden die Grundlage für zukünftige klinische Untersuchungen zur Dosisindividualisierung für die untersuchten Kinase-Inhibitoren und Letermovir. Angesichts der beobachteten Variabilität zwischen den Patienten bei gleicher Dosierung, sind die hier beschriebenen Methoden hilfreich, um Patienten mit dem Risiko für eine Über- oder Unterdosierung frühzeitig zu erkennen. Die Messung der Serumkonzentration und die Festlegung sicherer und wirksamer therapeutischer Bereiche können die Entscheidungsfindung in Bezug auf die Dosisanpassung in der klinischen Routine unterstützen.

En marge d'expériences actuelles visant à développer une méthodologie analytique sur la pharmacocinétique-pharmacodynamique de la N-acétyl-cystéine (NAC) en prévention de la néphropathie liée à l'exposition aux substances de contraste (NESC), une mesure de la clairance des substances de contraste a été mise au point comme marqueur de filtration glomérulaire (FG) étant donné que celles-ci sont totalement éliminées par FG. Ainsi, la mesure de la FG a été déterminée par la clairance de l'iohexol, substance de contraste utilisée en imagerie médicale. L'originalité de ce projet est triple: (1) mesurer la clairance de l'iohexol (Omnipaque) chez des patients recevant également de l'iodixanol (Visipaque), substance de contraste de plus en plus utilisée; (2) explorer la mesure de la clairance d'iodixanol et (3) utiliser la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide, qui depuis les dernières années s'est taillée une place de plus en plus importante, pour le dosage de l'iohexol et de l'iodixanol. Le projet actuel s'est déroulé chez 17 sujets avec divers niveaux de fonction rénale devant subir des examens d'imagerie avec des substances de contraste. Une dose-traceur d'iohexol (5 ml) a été co-administrée avec l'iodixanol (environ 95 ml). Des spécimens sanguins ont été obtenus 0, 1, 2, 3, 4, 8 et 24 heures post-imagerie pour mesurer les clairances de l'iohexol et de l'iodixanol. Le comportement des autres marqueurs conventionnels de FG, soit le taux créatinine plasmatique et la clairance de la créatinine, ainsi que la clairance de la cystatine C et la clairance d'iodixanol ont été comparés à la clairance d'iohexol. Par conséquent, un protocole scientifique par HPLC-MSD Tof a été développé afin de séparer et de quantifier les molécules iohexol et iodixanol co-administrées dans le plasma des sujets. Les mesures des taux plasmatiques de ces deux molécules ont permis de déterminer par des calculs pharmacocinétiques que la clairance de l'iohexol discrimine bien la fonction rénale des sujets avec une fonction rénale normale de ceux avec une fonction rénale diminuée. De plus, il a été démontré qu'une seule mesure post-4 heures est suffisante pour diagnostiquer l'état de la fonction rénale d'un patient qui a subi une intervention demandant une exposition aux substances de contraste. Les corrélations entre la clairance de l'iohexol et d'autres marqueurs conventionnels de FG ainsi que celle de l'iodixanol ont illustré que la clairance de la créatinine calculée soit par l'équation MDRD (r = 0,714 et p = 0,001) ou par Cockcroft et Gault (r = 0,518 et p = 0,033) et la clairance de la cystatine C (r = 0,671 et p = 0,003) corrèlaient de manière significative avec l'étalon d'or, soit la clairance de l'iohexol. C'est pourquoi, il pourrait être possible de se fier à la mesure de la clairance de l'iohexol comme meilleur marqueur de FG afin de prévenir, de diagnostiquer et de traiter la NESC. De plus, des expériences scientifiques en recherche fondamentale pourront enfin être menées pour déterminer la relation pharmacodynamique- pharmacocinétique de la N-acétylcystéine dans la prévention de la NESC à l'aide de la mesure de la clairance de l'iohexol comme marqueur fiable de la FG. Enfin, les mécanismes d'action qui interviennent dans la NESC pourront être mieux évalués.

As micotoxinas são compostos produzidos por fungos, sendo potencialmente perigosos à saúde humana e animal. A Ocratoxina A (OTA) é uma das micotoxinas mais amplamente estudadas, sendo encontrada em várias matrizes alimentícias. A concentração dessa micotoxina nos alimentos é geralmente muito baixa (da ordem de ng g-1), sendo, portanto, necessário o emprego de técnicas de preparo de amostras que realizem a purificação e pré-concentração no analito. Os métodos de separação e detecção empregados na análise de OTA também devem oferecer sensibilidade adequada para a quantificação do analito. Logo, os objetivos do trabalho foram desenvolver uma metodologia utilizando a técnica in-tube SPME no modo de extração única (flow through extraction) com partículas de C18 como fase extratora e separação e detecção por HPLC-MS/MS. Além disso, otimizar e validar a metodologia proposta e detectar e quantificar a OTA em amostras de vinho. Para isso, a técnica in-tube SPME foi configurada e um tubo de PEEK foi empacotado com partículas de C18, o qual foi utilizado na extração. A otimização do método foi realizada utilizando-se um planejamento experimental composto central 22 + 3 pontos centrais, tendo como fatores a porcentagem de ACN e o tempo durante o carregamento da amostra. A validação da metodologia empregada foi realizada conforme o guia de validação da ANVISA e, posteriormente, amostras de vinho tinto seco e vinho branco seco foram analisadas. O método proposto foi desenvolvido, tendo sua funcionalidade atestada e suas condições de análise melhoradas, sendo utilizado 22 % de ACN e 6 minutos no carregamento da amostra. O método foi validado, mostrando sensibilidade adequada, com limites de detecção e quantificação iguais à 0,02 e 0,05 µg L-1, respectivamente. A linearidade e precisão da metodologia foram avaliadas, apresentando coeficiente de correlação igual a 0,996 e DPR menor que 6%, respectivamente. O método mostrou-se exato nos níveis de concentração médio e alto e a recuperação máxima obtida para o nível alto foi próximo 73%. Amostras brasileiras e estrangeiras de vinho tinto seco e vinho tinto seco branco foram analisadas e a OTA não foi detectada em nenhuma delas. Entretanto, a OTA pode essa estar presente nas amostras analisadas em concentrações mais baixas que as determinadas pelos limites de detecção e quantificação, não sendo potencialmente perigosos à saúde. / Mycotoxins are compounds produced by fungus, being a potential danger to human and animal health. Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin widely studied, being found in a varied of food matrices. OTA concentration in food is generally low (the order of ng g-1), being, therefore, necessary the use of sample preparation techniques to perform the analyte purification and preconcentration in the sample. The separation and detection methods used in OTA analysis also should offer proper sensibility in order to quantify the analyte adequately. In short, the goals of the present work were to develop a methodology using in-tube SPME in flow through extraction mode with C18 particles as extraction phase and separation and detection by HPLC-MS/MS. Further, optimize and validate the proposed methodology and detect and quantify OTA in wine samples. For this, in-tube SPME was configured and a PEEK tube was packed with C18 particles, which was used in the extraction step. The method optimization was achieved using a central composite 22 + 3 central points experimental design, having as factors the percentage of ACN and time during sample loading step. Validation method was done following ANVISA validation guide after which red dry wine and white dry wine samples were analyzed. The proposed method was developed, having its functionalities attested and its analysis conditions enhanced, using 22% of ACN and 6 minutes in sample loading. The method was validated, demonstrating proper sensitivity, with detection and quantification limits equal to 0.02 and 0.05 µg L-1, respectively. Linearity and precision were evaluated, exhibiting correlation coefficient equal to 0,996 e RSD under 6%, respectively. The method was accurate in medium and high concentration levels and maximum recovery was 73% in high concentration level. Brazilian and foreign red dry wine and white dry wine samples were analyzed and OTA was not detected in any of them. However, OTA may be present in samples analyzed in lower concentrations than that ones determined by detection and quantification limits, not being a potential danger to human health.

As micotoxinas são compostos produzidos por fungos, sendo potencialmente perigosos à saúde humana e animal. A Ocratoxina A (OTA) é uma das micotoxinas mais amplamente estudadas, sendo encontrada em várias matrizes alimentícias. A concentração dessa micotoxina nos alimentos é geralmente muito baixa (da ordem de ng g-1), sendo, portanto, necessário o emprego de técnicas de preparo de amostras que realizem a purificação e pré-concentração no analito. Os métodos de separação e detecção empregados na análise de OTA também devem oferecer sensibilidade adequada para a quantificação do analito. Logo, os objetivos do trabalho foram desenvolver uma metodologia utilizando a técnica in-tube SPME no modo de extração única (flow through extraction) com partículas de C18 como fase extratora e separação e detecção por HPLC-MS/MS. Além disso, otimizar e validar a metodologia proposta e detectar e quantificar a OTA em amostras de vinho. Para isso, a técnica in-tube SPME foi configurada e um tubo de PEEK foi empacotado com partículas de C18, o qual foi utilizado na extração. A otimização do método foi realizada utilizando-se um planejamento experimental composto central 22 + 3 pontos centrais, tendo como fatores a porcentagem de ACN e o tempo durante o carregamento da amostra. A validação da metodologia empregada foi realizada conforme o guia de validação da ANVISA e, posteriormente, amostras de vinho tinto seco e vinho branco seco foram analisadas. O método proposto foi desenvolvido, tendo sua funcionalidade atestada e suas condições de análise melhoradas, sendo utilizado 22 % de ACN e 6 minutos no carregamento da amostra. O método foi validado, mostrando sensibilidade adequada, com limites de detecção e quantificação iguais à 0,02 e 0,05 µg L-1, respectivamente. A linearidade e precisão da metodologia foram avaliadas, apresentando coeficiente de correlação igual a 0,996 e DPR menor que 6%, respectivamente. O método mostrou-se exato nos níveis de concentração médio e alto e a recuperação máxima obtida para o nível alto foi próximo 73%. Amostras brasileiras e estrangeiras de vinho tinto seco e vinho tinto seco branco foram analisadas e a OTA não foi detectada em nenhuma delas. Entretanto, a OTA pode essa estar presente nas amostras analisadas em concentrações mais baixas que as determinadas pelos limites de detecção e quantificação, não sendo potencialmente perigosos à saúde. / Mycotoxins are compounds produced by fungus, being a potential danger to human and animal health. Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin widely studied, being found in a varied of food matrices. OTA concentration in food is generally low (the order of ng g-1), being, therefore, necessary the use of sample preparation techniques to perform the analyte purification and preconcentration in the sample. The separation and detection methods used in OTA analysis also should offer proper sensibility in order to quantify the analyte adequately. In short, the goals of the present work were to develop a methodology using in-tube SPME in flow through extraction mode with C18 particles as extraction phase and separation and detection by HPLC-MS/MS. Further, optimize and validate the proposed methodology and detect and quantify OTA in wine samples. For this, in-tube SPME was configured and a PEEK tube was packed with C18 particles, which was used in the extraction step. The method optimization was achieved using a central composite 22 + 3 central points experimental design, having as factors the percentage of ACN and time during sample loading step. Validation method was done following ANVISA validation guide after which red dry wine and white dry wine samples were analyzed. The proposed method was developed, having its functionalities attested and its analysis conditions enhanced, using 22% of ACN and 6 minutes in sample loading. The method was validated, demonstrating proper sensitivity, with detection and quantification limits equal to 0.02 and 0.05 µg L-1, respectively. Linearity and precision were evaluated, exhibiting correlation coefficient equal to 0,996 e RSD under 6%, respectively. The method was accurate in medium and high concentration levels and maximum recovery was 73% in high concentration level. Brazilian and foreign red dry wine and white dry wine samples were analyzed and OTA was not detected in any of them. However, OTA may be present in samples analyzed in lower concentrations than that ones determined by detection and quantification limits, not being a potential danger to human health.