Kyoto University (京都大学) / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第13793号 / 工博第2897号 / 新制||工||1428(附属図書館) / 26009 / UT51-2008-C709 / 京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻 / (主査)教授 今中 忠行, 教授 青山 安宏, 教授 濵地 格 / 学位規則第4条第1項該当

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Les archées hyperthermophiles ont une température optimale de croissance supérieure à 80°C.Les cellules exposées à un stress thermique subissent une augmentation de la sensibilité aux agents induisant des cassures double brin de l’ADN. Les études sur les eucaryotes et bactéries ont démontré que la recombinaison homologue joue un rôle essentiel non seulement dans la réparation de l’ADN, mais aussi dans le redémarrage des arrêts de la fourche de réplication. Les enzymes associées aux étapes initiales de la recombinaison homologue chez les archées sont homologues à celles des eucaryotes, et différentes des analogues bactériens. De plus, plusieurs études ont démontré que les protéines impliquées dans la recombinaison homologue sont essentielles chez les archées hyperthermophiles, soulignant l’importance biologique de cette voie de réparation chez ces organismes particuliers. Le rôle de la recombinaison homologue pour la stabilité génomique a été bien étudié chez les eucaryotes et les bactéries, cependant, peu de ses propriétés fonctionnelles ont été étudiées chez les archées hyperthermophiles. Pour mieux comprendre le mécanisme de recombinaison homologue impliquée au niveau de la maintenance génomique chez les archées, un réseau d’interactions protéine-protéines a été révélé précédemment au laboratoire à partir des protéines de Pyrococcus abyssi. Ces travaux ont démontré de nouvelles interactions où interviennent les protéines de la réplication et les protéines de la recombinaison de l’ADN. L’objet de cette étude de thèse est de présenter deux interactions : PCNA/Mre11-rad50 (MR) complexe et Primase/RadA. Pour la première fois chez P. furiosus, une interaction physique et fonctionnelle a été démontrée entre le PCNA et le complexe MR (l’initiateur de HR). Un motif, situé en position Cterminale de Mre11, permet l’interaction avec PCNA.PCNA stimule l’activité endonucléase du complexe MR à distance proche de l’extrémité 5’ d’une cassure double brin. Cette propriété est en accord avec l’intervention ultérieure des enzymes assurant la suite du mécanisme de réparation par recombinaison homologue. Par ailleurs, les protéines RadA, Primase et P41 ont été produites et purifiées. Leurs fonctions enzymatiques ont été confirmées. Cependant, nous n’avons pas pu caractériser la fonction de l’association de RadA/Primase. / Hyperthermophilic archaea (HA) are found in high-temperature environments and grow optimally above 80°C. Usually, cells exposed to heat stress display an increased sensitivity to agents inducing double-stranded DNA breaks (DSBs). Studies in Eukaryotes and Bacteria have revealed that homologous recombination (HR) plays a crucial role not only in DNA DSBs repair, but also in the collapsed/stalled DNA replication fork restart.Recombinase and various HR-associated enzymes in archaea specifically resemble the eukaryotic homologues, rather than bacterial homologues.Furthermore, several studies have demonstrated the necessity of HR proteins in HA, suggesting that, HR is an important mechanism in HA. HR influencing genome stability has been well studied in Eukaryotes andBacteria, however, few of its functional properties have been studied in HA.To better understand how HR mechanism is involved in the archaeal genome maintenance process, a previous work proposed a protein-protein interaction network based on Pyrococcus abyssi proteins. Through the network, new interactions involving proteins from DNA replication and DNA recombination were highlighted. The targets of the study presented here for two protein interaction are: PCNA/Mre11-rad50 complex (MR complex) and Primase/RadA. For the first time in P. furiosus, we showed both physical and functional interactions between PCNA (Maestro in DNA replication) and MR complex (initiator of HR). We have identified a PCNA-interaction motif (PIP) located in the C-terminal of Mre11, and shown that PCNA stimulated MR complex endonuclease cleavage proximal to the s’ strand of DNA DSBs at physiological ionic strength. For the second interaction, we have purified the proteins PabRadA/PfuRadA, PabPrimase and PabP41, and confirmed its enzymatic functions. However, we were not able to characterize the function of Primase/RadA association.

Les réarrangements permettent une évolution rapide du génome par l’acquisition de séquences codantes exogènes, la perte de fonctions non-essentielles ou la création de nouvelles organisations génomiques. Différents mécanismes de réarrangements impliquant des éléments génétiques mobiles (EGM) ont été identifiés chez les archées, les bactéries et les eucaryotes. En revanche, on ignore l’origine des nombreuses inversions génomiques détectées pour les espèces du genre archéen Thermococcus. Mes travaux de thèse visent à améliorer la compréhension de l’évolution génomique chez les Thermococcales à travers l’étude de deux familles d’EGM : les familles de plasmides pTN3 et pT26-2. Plus précisément, je me suis intéressée aux recombinases à tyrosine (ou intégrases) que ces plasmides encodent et qui permettent leur intégration dans le chromosome de l’hôte. J’ai montré que l’intégrase plasmidique Intᵖᵀᴺ³ est responsable d’inversions dans le chromosome de son hôte Thermococcus nautili grâce à une activité catalytique inédite de recombinaison homologue. J’ai par la suite caractérisé deux autres intégrases de Thermococcales reliés phylogénétiquement à Intᵖᵀᴺ³ dont seulement une présente une activité de recombinaison homologue. La comparaison de leurs séquences primaires et la résolution de la structure de Intᵖᵀᴺ³ vont maintenant éclairer les déterminants génétiques responsables de la spécificité de site et de l’activité de recombinaison homologue. Les trois intégrases appartiennent à une classe de recombinases spécifique des archées qui catalyse une intégration suicidaire. Lors de l’intégration, le gène de l’intégrase est fragmenté et probablement désactivé. L’EGM intégré se retrouve piégé dans le chromosome. Les avantages évolutifs d’une telle activité suicidaire restent pour l’instant mystérieux. J’ai identifié 62 intégrases hyperthermophiles suicidaires et reconstruit leur histoire évolutive. Ces intégrases sont très prévalentes et recrutées par différents EGM. De plus, j’ai montré que l’une de ces intégrases présente in vitro une activité de recombinaison site-spécifique à des températures proches de l’ébullition de l’eau, représentant un avantage dans les environnements hyperthermophiles. / Genomes rapidly evolve through rearrangements that can generate new genome organizations or lead to the acquisition of foreign coding sequences or the loss of non-essential functions. Several mechanisms of rearrangement were uncovered for Archaea, Bacteria and Eukaryotes that involve mobile genetic elements (MGE). Species from the archaeal genera Thermococcus present numerous genomic inversions but none of the previously known inversion drivers. To better understand the genomic evolution of Thermococcales, I investigated two of their MGE families: the pTN3 and pT26-2 plasmid families. Specifically, I focused on the tyrosine recombinases (or integrase) that these plasmids encode and that catalyze their site-specific integration in the host chromosome. I demonstrated that the plasmidic integrase Intᵖᵀᴺ³ is responsible for chromosomal inversions in the host Thermococcus nautili through an unprecedented homologous recombination catalytic activity. I also characterized two other related Thermococcus integrases and only one catalyzes homologous recombination. The structure resolution of Intᵖᵀᴺ³ and primary sequence comparisons will now provide clues about the genetic determinants of site specificity and of the homologous recombination activity. The three integrases all belong to an archaeal-specific class of integrases that catalyzes a suicidal integration. The integrase gene is partitioned and presumably inactivated upon integration. The integrated MGE is then trapped into the chromosome. The evolutionary benefits of this suicide activity are puzzling. I identified 62 related suicidal hyperthermophilic integrases and reconstructed their evolutionary history. They are highly prevalent and recruited by diverse MGE. I also showed that one of these integrases can catalyze in vitro site-specific recombination at near boiling water temperature, representing an advantage in hyperthermophilic environments.