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Die Infektiöse Bursitis ist eine Virusinfektion 3-6 Wochen alter Hühner, die bei Überlebenden mit einer schweren Immunsuppression verbunden ist. Sie verursacht weltweit große wirtschaftliche Schäden. Seit dem Auftreten hoch virulenter (hv) Stämme des Virus der infektiösen Bursits (infectious bursal disease virus, IBDV) Ende der 80-er Jahre blieben viele Fragen zu den biologischen Eigenschaften dieser Virusstämme und einer effektiven Bekämpfung der von ihnen ausgelösten Erkrankung ungeklärt. Unter anderem gelingt es zumeist nicht, hv-Stämme in der Zellkultur zu isolieren. Von besonderem Interesse ist es daher, solche Zellkulturen zu erhalten, die es erlauben, hv-Stämme in vitro zu züchten, ohne dass zuvor deren Genom verändert werden muss. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Zellkulturen für die Vermehrung von hv-IBDV-Stämmen zu etablieren und dann einige von deren biologischen Eigenschaften näher zu untersuchen.

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Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 427044 bytes, checksum: 5c1651c701a5ae2b53e04e42782f989e (MD5) Previous issue date: 2007-09-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Infectious bursal disease (IBD) has been the major preoccupation for the poultry industry, especially in the past decade with the emergency of high virulent strains. Mutations in the gene that code the VP2 viral protein of pathogenic strains and the amiss use of attenuate vaccines by few passages have been responsible for the springing of new outbreaks. The purpose of this work was to analyze phylogenetically two different isolates of IBDV in Minas Gerais State by the comparison of the nucleotide sequence of the gene that code VP2 viral capside protein. In order to study the pathogen-host interaction, a subtractive library was constructed from VERO cells infected by IBDV (8 hours post-infection) aiming the identification of differential gene expression during this interaction. For the phylogenic analysis of the isolates, fragments of 251 bp amplified by RT-PCR were cloned and sequenced. The comparison of the sequences revealed that these isolates have 98-100% identity with classical vaccinal IBDV strains indicating that these outbreaks might have been caused by the vaccinal virus. To construct the subtractive library, two cDNA populations were hibridizated: one derived by IBDV infected VERO cells and other by non infected VERO cells. The hibridizated products were amplified for the posterior cloning and evaluation of the differential express products. Understanding of the replication characteristics of the IBDV associated to the study of the virus infection effects in the gene expression of the host cell, shown in this work, will allow the elucidation of the mechanisms involved in the pathogen-host interaction contributing, therefore, for the development of methods more effectives in the control and prevention of the IBDV. / A doença infecciosa bursal (IBD) tem sido, há muitos anos, uma grande preocupação para a indústria avícola, especialmente na década passada devido a emergência de cepas virais hipervirulentas. Mutações no gene responsável pela codificação da proteína viral VP2 de linhagens patogênicas e a má utilização de vacinas atenuadas por poucas passagens têm sido responsáveis pelo aparecimento de novos surtos. A proposta deste trabalho foi analisar filogeneticamente dois diferentes isolados de IBDV de Minas Gerais por meio da comparação da seqüência nucleotídica do gene que codifica a proteína do capsídeo viral VP2. Em razão da necessidade de se estudar melhor a interação patógeno-hospedeiro, objetivou-se ainda a construção de uma biblioteca subtrativa a partir de células VERO infectadas pelo IBDV, 8 horas após a infecção, com a finalidade de identificar genes diferencialmente expressos durante essa interação vírus-célula hospedeira. Para a análise filogenética dos isolados, fragmentos de 251 pb amplificados por RT-PCR foram clonados e seqüenciados. A comparação das seqüências revelou que os isolados possuem identidade de 98-100% com linhagens clássicas vacinais de IBDV, indicando que os surtos analisados podem ter sido causados pelo vírus vacinal. Para a construção da biblioteca subtrativa, duas populações de cDNA foram hibridizadas: uma derivada de células VERO infectadas por IBDV e a outra de células VERO não infectadas. Os produtos hibridizados foram amplificados para posterior clonagem e avaliação dos produtos diferencialmente expressos. O conhecimento das características replicativas do IBDV associado ao estudo das conseqüências da infecção pelo vírus na expressão gênica da célula hospedeira, iniciado neste trabalho, permitirá a elucidação dos mecanismos envolvidos na interação patógeno-hospedeiro, contribuindo assim para o desenvolvimento de métodos mais eficazes no controle e prevenção da IBD.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Poultry production is a very important economic activity in Brazil once the country is among the highest world avian producers. The knowledge of the pathogens epidemiology is essential to the control of infectious diseases and such control is very strict in chickens and turkeys on the avian industry. However, the avian population of the country shows a big diversity of domestic and wild birds and the chicken backyard population is out of this control. To investigate the presence of antibodies against specific viruses in the backyard chicken population, blood was collected of 867 non-vaccinated birds, from 60 farms and 22 counties from the Rio Grande do Sul State, Brazil. Neutralizing antibodies against infectious bronchitis virus (IBV) were detected in 65% (564/867) of the individuals, against avian reovirus (ARV) in 21.6% (187/867) and, against infectious bursal disease virus (IBDV) in 80.2% (695/867). The results presented on the first chapter indicated that the tested viruses are circulating among this population. Among the wild species there is a group of Galliformes, classified at the Cracidae family and commonly known as guans, chachalacas and curassows which deserved a special attention in the present study. To determine the microbiota, the bacterial resistance and the presence of antibodies against specific viruses in these birds, fifty one serum and cloacal swab samples were collected from 10 different cracid species captive in the Rio Grande do Sul State during 2007. Serum samples were submitted to serum-neutralization test and specific antibodies were detected against IBV in 5.9% (3/51) of the cracids, against ARV in 15.7% (8/51) and, against IBDV in 35.3% (18/51). All the samples were found to be negative to fowlpox virus by the AGID test. Bacterial isolation and identification were performed from the cloacal swabs. After that, the isolates were tested for antimicrobial susceptibility. Ninety three bacterial isolates were obtained from 10 different genera. Escherichia spp., Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. are among the most prevalent genera. Antimicrobial resistance was observed in several isolates, with Serratia marcescens presenting the highest level of resistance to multi drugs followed by Streptococcus spp., Staphylococcus aureus and Escherichia coli, among others. The results from the second chapter of this dissertation allowed us to conclude that bacterial resistance is spread in the captive cracid microbiota and, most importantly, these species are susceptible to the infection by IBV, IBDV and ARV. / A avicultura é uma das principais atividades econômicas do Brasil, que ocupa posição de destaque entre os exportadores de frango e subprodutos. O conhecimento da epidemiologia de patógenos que podem gerar prejuízos a essa atividade é essencial para o controle das enfermidades infecciosas. Este controle é realizado em larga escala em galinhas e perus criados no sistema industrial. Entretanto a população avícola do país consiste de uma grande diversidade de aves domésticas e selvagens, sendo o grupo conhecido como galinhas de terreiro formado por indivíduos desta espécie criados fora do sistema industrial. Com o objetivo de investigar a presença de anticorpos contra alguns vírus específicos na população de galinhas de terreiro, foram coletadas amostras de sangue de 867 galinhas não vacinadas, em 60 propriedades de 22 municípios do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil, que foram testadas pela técnica de soroneutralização. Anticorpos contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) foram detectados em 65% (564/867) destas aves, contra o reovírus aviário (ARV) em 21,6% (187/867) e contra o vírus da doença infecciosa da bolsa (IBDV) em 80,2% (695/867). Os descritos no primeiro capítulo desta dissertação permitiram demostrar a circulação dos vírus testados na população descrita. No segundo capítulo trabalhou-se com aves da ordem Galliformes, pertencentes à família Cracidae e conhecidos popularmente como jacus, jacutingas, araquãs e mutuns, com o intuito de conhecer a microbiota, resistência bacteriana e a presença de anticorpos contra vírus de aves, 51 amostras de soro e swab cloacal de 10 diferentes espécies de cracídeos cativos do Estado do Rio Grande do Sul foram coletadas durante o ano de 2007. As amostras de soro foram utilizadas para a detecção de anticorpos neutralizantes contra o IBV, ARV e IBDV, onde obteve os seguintes resultados: contra o IBV em 5,9% (3/51) das amostras positivas, contra o ARV em 15,7% (8/51) e contra o IBDV em 35,3% (18/51). Através do teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) determinou-se que todas as amostras de soro eram negativas para o vírus da bouba aviária. Para o isolamento e identificação bacteriana foram realizados dos swabs cloacais e, posteriormente, foi testada a susceptibilidade antimicrobiana. Foram obtidos 93 isolados bacterianos, divididos em 10 diferentes gêneros. Entre os gêneros bacterianos mais prevalentes estavam Escherichia spp., Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. Foi observada em grande número de isolados resistência à antimicrobianos, sendo que a bactéria Serratia marcescens apresentou o maior índice de resistência múltipla antimicrobiana. Os altos índices de resistência também foram detectados para Streptococcus spp., Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Os resultados apresentados permitem concluir que a resistência bacteriana está disseminada na microbiota de cracídeos cativos e que indivíduos destas espécies são suscetíveis à infecção pelo IBV, IBDV e ARV, assim como as galinhas de terreiro.

The very virulent (vv) pathotype of infectious bursal disease virus (IBDV) has spread rapidly throughout Europe, Asia, and the Middle East. Although Australia is currently unaffected, there remains the potential for incursion of an exotic isolate. The aim of this study was to identify putative virulence determinants of IBDV to facilitate the development of improved diagnostic assays for detection and characterisation of vvIBDV isolates. Sequencing of Indonesian vvIBDV Tasik94 revealed a unique substitution [ A¨S222] in the hypervariable region (HVR) of viral protein (VP) VP2, which did not appear to impinge on virulence or antigenicity. Phylogenetic analyses indicated that Tasik94 was closely related to Asian and European vvIBDV strains. Extensive alignment of deduced protein sequences across the HVR of VP2 identified residuesI242 I256 and I294 as putative markers of the vv phcnotype. Comparison of the pathology induced by mildly-virulent Australian IBDV 002/73 and Indonesian vvIBDV Tasik94, revealed that histological lesions in the spleen, thymus and bone marrow were restricted to Tasik94-infected birds, suggesting the enhanced pathogenicity of vvIBDV might be attributed to replication in non-bursal lymphoid organs. The biological significance of the VP2 HVR in virulence was assessed using recombinant viruses generated by reverse genetics. Both genomic segments of Australian IBDV 002/73, and recombinant segment A constructs in which the HVR of 002/73 was replaced with the corresponding region of either tissue culture-adapted virus or vvIBDV (Tasik94), were cloned behind T7 RNA polymerase promoter sequences. In vitro transcription/translation of each construct resulted in expression of viral proteins. Co-transfection of synthetic RNA transcripts initiated replication of both tissue culture-adapted parental and recombinant viruses, however attempts to rescue non-adapted viruses in specific-pathogen-free (SPF) chickens were unsuccessful. Nucleotide sequence variation in the HVR of VP2 was exploited for the development of a new diagnostic assay to rapidly detect exotic IBDV isolates, including vvIBDV, using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification and Bmrl restriction enzyme digestion. The assay was capable of differentiating between endemic and exotic IBDV in 96% of 105 isolates sequenced to date.

Die aerogene Übertragung von Infektionskrankheiten stellt ein sehr wichtiges Thema in der Medizin dar. Für genaue Untersuchungen dazu, sind geeignete Sammel- und Nachweismetho-den essentiell. Die Untersuchung verschiedener Sammelgeräte sowie unterschiedlicher Nach-weismethoden zur Virusquantifizierung aus der Luft war daher die zentrale Aufgabenstellung in dieser Arbeit. Als Sammelgeräte wurden der Impinger AGI 30 und der Gelatinefilter ausge-wählt. Alle grundlegenden Untersuchungen zur Ermittlung der Eignung und Effizienzen der Geräte bezüglich der Virusisolierung aus Luftproben wurden an experimentell erzeugten Virus-aerosolen durchgeführt. Dabei wurden zwei Geflügelviren verwendet, das Newcastle-Disease-Virus Stamm LaSota (NDV) und das Infektiöse-Bursitis-Virus Stamm Cu-1M (IBDV). Die quan-titative Bestimmung der Viren aus den Luftproben erfolgte durch Titration im Zellkultursystem bzw. in embryonierten Hühnereiern. Parallel dazu wurde eine Titerbestimmung mittels einer in dieser Arbeit etablierten quantitativen Real-Time-PCR durchgeführt. Zusätzlich wurden die Sammelgeräte unter praktischen Bedingungen getestet und verglichen. Dazu erfolgten lufthy-gienische Messungen nach Vakzinierung von Geflügel mit Lebendimpfstoffen (NDV LaSota und IBDV Cu-1M). Es wurden umfangreiche Untersuchungen unter experimentellen Beding¬ungen und später exemplarische Untersuchungen in konventionellen Geflügelhaltungen durch-geführt. Die Evaluierung der Sammelgeräte mit Hilfe der experimentell erzeugten Virusaerosole er-gab, dass mit beiden Geräten sowohl infektionsfähiges Virus als auch Virusgenom nachgewie-sen und quantifiziert werden kann. Die Effizienzen unterschieden sich jedoch z.T. deutlich. So stellte sich der Gelatinefilter zur Sammlung in Kombination mit dem quantitativen Virusnach-weis mittels Real-Time-PCR als die Methode mit der höchsten Virusnachweisrate (angegeben als geometrischer Mittelwert mit geometrischer Standardabweichung) von 22,3 % ×/ 3,1 für NDV und 36,1 % ×/ 3,4 für IBDV heraus. Der Nachweis von infektionsfähigen Viren jedoch, war für beide Testkeime aus den Proben des Impingers erfolgreicher (NDV 4,0 % ×/ 1,7 und IBDV 31,8 % ×/ 1,8). Die signifikant niedrigere Nachweisrate des Newcastle-Disease-Virus ist auf die höhere Empfindlichkeit dieses behüllten Virus beim Sammelprozess und daraus folgen-der Inaktivierung zurückzuführen. Die Quantifizierung mit Hilfe der Real-Time-PCR erfolgte mit Normalisierung aller Proben. Diese bisher zur Analyse von Luftproben noch nicht ange-wandte Methode erwies sich als sehr gut. Durch die Normalisierung werden nicht nur die ab-weichenden Effizienzen der Nukleinsäureisolierung sowie der reversen Transkription ausgegli-chen, sondern auch die unterschiedliche Inhibition der PCR der Proben verschiedener Luftkeimsammler. Damit sind die Proben untereinander besser vergleichbar und die Quantifi-zierung exakter. Erstmals wurden auch systematische Untersuchungen zu Geräteeffizienzen in Kombination mit verschiedenen Virusnachweismethoden durchgeführt. Bei den lufthygienischen Untersuchungen nach Vakzinierung von ca. 50 Hühnern gegen Newcastle Disease (ND) bzw. Infektiöse Bursitis (IBD) unter experimentellen Bedingungen, waren drei Luftproben nach der Impfung gegen ND viruspositiv, jedoch keine nach der gegen IBD. Diese positiven Nachweise gelangen mit dem Gelatinefilter und nachfolgender Analyse mittels quantitativer Real-Time-PCR. Schlussfolgernd ist zumindest bei dem NDV eine aeroge-ne Ausscheidung des Impfvirus anzunehmen. Wahrscheinlich liegt die Viruskonzentration in der Luft jedoch meist unter der Nachweisgrenze der eingesetzten Geräte. Auch die Auswertung von Luftproben nach Vakzinierung gegen oben genannte Krankheiten in konventionellen Tierhal-tungen mit mehreren Tausend Tieren Besatz pro Stall führte zu keinen viruspositiven Ergebnis-sen. Anscheinend wurden die Viren auch trotz der großen Tierzahl in der Luft so stark verdünnt oder in so geringem Maße ausgeschieden, dass sie mit den in dieser Arbeit entnommenen Luft-probenvolumina von 1000 l nicht detektiert werden konnten. Für weiterführende Untersuchun-gen müsste daher ein Sammelgerät verwandt werden, mit welchem schnell große Probenvolu-mina entnommen werden können und das Endvolumen der Probenflüssigkeit dennoch gering ist, um die luftgetragenen Viren optimal zu konzentrieren. Schlussfolgernd erwies sich die Filtration in Kombination mit der normalisierten quantitati-ven Real-Time-PCR dennoch insgesamt als eine sehr valide und praktikable Methode zum Nachweis luftgetragener Viren aus Tierhaltungen.

Die Infektiöse Bursitis ist eine Virusinfektion 3-6 Wochen alter Hühner, die bei Überlebenden mit einer schweren Immunsuppression verbunden ist. Sie verursacht weltweit große wirtschaftliche Schäden. Seit dem Auftreten hoch virulenter (hv) Stämme des Virus der infektiösen Bursits (infectious bursal disease virus, IBDV) Ende der 80-er Jahre blieben viele Fragen zu den biologischen Eigenschaften dieser Virusstämme und einer effektiven Bekämpfung der von ihnen ausgelösten Erkrankung ungeklärt. Unter anderem gelingt es zumeist nicht, hv-Stämme in der Zellkultur zu isolieren. Von besonderem Interesse ist es daher, solche Zellkulturen zu erhalten, die es erlauben, hv-Stämme in vitro zu züchten, ohne dass zuvor deren Genom verändert werden muss. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Zellkulturen für die Vermehrung von hv-IBDV-Stämmen zu etablieren und dann einige von deren biologischen Eigenschaften näher zu untersuchen.

Die aerogene Übertragung von Infektionskrankheiten stellt ein sehr wichtiges Thema in der Medizin dar. Für genaue Untersuchungen dazu, sind geeignete Sammel- und Nachweismetho-den essentiell. Die Untersuchung verschiedener Sammelgeräte sowie unterschiedlicher Nach-weismethoden zur Virusquantifizierung aus der Luft war daher die zentrale Aufgabenstellung in dieser Arbeit. Als Sammelgeräte wurden der Impinger AGI 30 und der Gelatinefilter ausge-wählt. Alle grundlegenden Untersuchungen zur Ermittlung der Eignung und Effizienzen der Geräte bezüglich der Virusisolierung aus Luftproben wurden an experimentell erzeugten Virus-aerosolen durchgeführt. Dabei wurden zwei Geflügelviren verwendet, das Newcastle-Disease-Virus Stamm LaSota (NDV) und das Infektiöse-Bursitis-Virus Stamm Cu-1M (IBDV). Die quan-titative Bestimmung der Viren aus den Luftproben erfolgte durch Titration im Zellkultursystem bzw. in embryonierten Hühnereiern. Parallel dazu wurde eine Titerbestimmung mittels einer in dieser Arbeit etablierten quantitativen Real-Time-PCR durchgeführt. Zusätzlich wurden die Sammelgeräte unter praktischen Bedingungen getestet und verglichen. Dazu erfolgten lufthy-gienische Messungen nach Vakzinierung von Geflügel mit Lebendimpfstoffen (NDV LaSota und IBDV Cu-1M). Es wurden umfangreiche Untersuchungen unter experimentellen Beding¬ungen und später exemplarische Untersuchungen in konventionellen Geflügelhaltungen durch-geführt. Die Evaluierung der Sammelgeräte mit Hilfe der experimentell erzeugten Virusaerosole er-gab, dass mit beiden Geräten sowohl infektionsfähiges Virus als auch Virusgenom nachgewie-sen und quantifiziert werden kann. Die Effizienzen unterschieden sich jedoch z.T. deutlich. So stellte sich der Gelatinefilter zur Sammlung in Kombination mit dem quantitativen Virusnach-weis mittels Real-Time-PCR als die Methode mit der höchsten Virusnachweisrate (angegeben als geometrischer Mittelwert mit geometrischer Standardabweichung) von 22,3 % ×/ 3,1 für NDV und 36,1 % ×/ 3,4 für IBDV heraus. Der Nachweis von infektionsfähigen Viren jedoch, war für beide Testkeime aus den Proben des Impingers erfolgreicher (NDV 4,0 % ×/ 1,7 und IBDV 31,8 % ×/ 1,8). Die signifikant niedrigere Nachweisrate des Newcastle-Disease-Virus ist auf die höhere Empfindlichkeit dieses behüllten Virus beim Sammelprozess und daraus folgen-der Inaktivierung zurückzuführen. Die Quantifizierung mit Hilfe der Real-Time-PCR erfolgte mit Normalisierung aller Proben. Diese bisher zur Analyse von Luftproben noch nicht ange-wandte Methode erwies sich als sehr gut. Durch die Normalisierung werden nicht nur die ab-weichenden Effizienzen der Nukleinsäureisolierung sowie der reversen Transkription ausgegli-chen, sondern auch die unterschiedliche Inhibition der PCR der Proben verschiedener Luftkeimsammler. Damit sind die Proben untereinander besser vergleichbar und die Quantifi-zierung exakter. Erstmals wurden auch systematische Untersuchungen zu Geräteeffizienzen in Kombination mit verschiedenen Virusnachweismethoden durchgeführt. Bei den lufthygienischen Untersuchungen nach Vakzinierung von ca. 50 Hühnern gegen Newcastle Disease (ND) bzw. Infektiöse Bursitis (IBD) unter experimentellen Bedingungen, waren drei Luftproben nach der Impfung gegen ND viruspositiv, jedoch keine nach der gegen IBD. Diese positiven Nachweise gelangen mit dem Gelatinefilter und nachfolgender Analyse mittels quantitativer Real-Time-PCR. Schlussfolgernd ist zumindest bei dem NDV eine aeroge-ne Ausscheidung des Impfvirus anzunehmen. Wahrscheinlich liegt die Viruskonzentration in der Luft jedoch meist unter der Nachweisgrenze der eingesetzten Geräte. Auch die Auswertung von Luftproben nach Vakzinierung gegen oben genannte Krankheiten in konventionellen Tierhal-tungen mit mehreren Tausend Tieren Besatz pro Stall führte zu keinen viruspositiven Ergebnis-sen. Anscheinend wurden die Viren auch trotz der großen Tierzahl in der Luft so stark verdünnt oder in so geringem Maße ausgeschieden, dass sie mit den in dieser Arbeit entnommenen Luft-probenvolumina von 1000 l nicht detektiert werden konnten. Für weiterführende Untersuchun-gen müsste daher ein Sammelgerät verwandt werden, mit welchem schnell große Probenvolu-mina entnommen werden können und das Endvolumen der Probenflüssigkeit dennoch gering ist, um die luftgetragenen Viren optimal zu konzentrieren. Schlussfolgernd erwies sich die Filtration in Kombination mit der normalisierten quantitati-ven Real-Time-PCR dennoch insgesamt als eine sehr valide und praktikable Methode zum Nachweis luftgetragener Viren aus Tierhaltungen.