Les pDCs répondent aux infections virales par la production d'IFN-α. L'élimination du virus de l'hépatite C (VHC) chez plus de 50% des patients infectés par le traitement à l'IFN-alpha suggère que les pDCs jouent un rôle majeur dans le contrôle de l'infection VHC. Les pDCs exposées aux hépatocytes infectés par VHC, produisent beaucoup d'IFN-α. Néanmoins, en dépit de cette production par TLR7 par les pDCs, VHC continue à se répliquer dans le foie infecté. J'ai approfondi les connaissances des mécanismes moléculaires d'exploration des particules de VHC et des cellules infectées par le VHC par les pDCs. J'ai ciblé ma recherche sur le contact des particules de VHC avec la surface des pDCs, sur la voie de signalisation de déclenchée, sur leur effet sur la production des IFNs et des cytokines proinflammatoires et sur la différenciation cellulaire. Nos résultats suggèrent que le virus associé aux cellules signalise dans les pDCs via un mécanisme dépendant de l'endocytose et d'IRF7 mais pas de la voie NF-κB. En dépit de l'induction d'IFN-α, le VHC associé aux hépatocytes n'induit une réponse pleinement fonctionnelle des pDCs. Les particules virales de VHC inhibent, via la fixation de la glycoprotéine E2 aux CLRs, la production d'IFN-α et d'IFN-λ dans les pDCs exposées aux hépatocytes infectés par VHC et induisent dans les pDCs, une phosphorylation rapide d'Akt et Erk1/2, d'une manière similaire au crosslinking de BDCA-2 ou DCIR. Ainsi, le blocage de BDCA-2 et de DCIR avec des fragments Fab des anticorps monoclonaux préserve la capacité des pDCs à produire des IFNs de type I et III en présence des particules virales. / Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) respond to viral infection by production of alpha interferon (IFN-alpha), proinflammatory cytokines, and cell differentiation. The elimination of hepatitis C virus (HCV) in more than 50% of infected patients by treatment with IFN-alpha suggests that pDCs play an important role in the control of HCV infection. pDCs exposed to HCV infected hepatoma cells produce large amounts of IFN-alpha. However, despite large amounts of Toll-like receptor 7-mediated IFN-α, produced by pDCs, HCV still replicates in infected liver. During my PhD training, I went into in depth to understand the molecular mecanisms used by HCV particles and HCV infected hepatocytes to explore pDCs. I focused my research on the binding of HCV particles with the pDC surface, on the triggered downstream signaling pathway, on the cellular differentiation. Our results suggest that cell-associated HCV signals in pDCs via an endocytosis-dependent mechanism and IRF7 but not via the NF-kappaB pathway. In spite of IFN-alpha induction, cell-associated HCV does not induce a full functional response of pDCs. HCV particles inhibit, via binding of E2 glycoprotein to CLRs, production of IFN-α and IFN-λ in pDCs exposed to HCV-infected hepatocytes, and induce in pDCs a rapid phosphorylation of Akt and Erk1/2, in a manner similar to the crosslinking of BDCA-2 or DCIR. Blocking of BDCA-2 and DCIR with Fab fragments of monoclonal antibodies preserves the capacity of pDCs to produce type I and III IFNs in the presence of HCV particles.

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (PDC) représentent une nouvelle entité distincte de cellules dendritiques. Elles peuvent sécréter de grandes quantités d'interféron de type I après stimulation par un virus ou des produits bactériens tels que les CpG ODN grâce à leur expression sélective des Toll-like récepteurs (TLR)7 et 9.<br />Notre laboratoire a récemment développé une lignée de PDC (GEN2.2) à partir de leucémies à PDC (LPDC), qui résistent aux thérapies conventionnelles. Les GEN2.2 partagent la plupart des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des PDC normales. Nous avons d'abord utilisé cette lignée comme modèle de LPDC et nous montrons qu'elles sont sensibles à l'apoptose induite par TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) via l'expression du récepteur DR5, comme la plupart des LPDC, alors que les PDC normales ne le sont pas, ce qui permettrait la mise en place de thérapies des leucémies à PDC utilisant des agonistes de TRAIL.<br />Les PDC normales sont difficiles à isoler ou générer. Nous avons donc ensuite utilisé la lignée GEN2.2 comme modèle de PDC normales. Nous avons ainsi découvert que ces cellules, une fois activées par des ligands des TLR7 et 9, acquièrent une fonction cytotoxique via l'expression de TRAIL et peuvent tuer des cellules tumorales. Les PDC pourraient donc jouer un rôle crucial dans l'éradication des cancers après activation.<br />Enfin, nous avons cherché à préciser les mécanismes moléculaires d'induction de TRAIL dans les PDC après activation par des ligands des TLR7 et 9.<br />L'ensemble des travaux suggère que les PDC pourraient représenter une cible de choix dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques anti-tumorales.

Afin de se répliquer et de se propager efficacement, les virus ont développé de multiples stratégies leur permettant d’échapper au système de défense innée : le système IFN de type I. Ce travail de thèse a alors consisté à étudier les interactions entre protéines virales et protéines de ce système de défense afin de mieux comprendre les mécanismes de subversion virale et d’identifier d’éventuelles cibles cellulaires thérapeutiques. La reconstruction d’un réseau d’interactions entre ces protéines nous a permis d’identifier des stratégies différentielles de subversion pour 4 familles virales et de montrer un ciblage massif et significatif des protéines du système IFN de type I par les virus. Les protéines en interaction directe avec ces protéines sont également fortement touchées par les virus et sont de potentiels modulateurs du système IFN de type I. Parmi ces modulateurs, le processus biologique sur-représenté est le transport nucléocytoplasmique et la protéine KPNA1 impliquée dans ce processus a retenu notre attention. L’étude fonctionnelle de l’interaction entre la protéine KPNA1 et la protéine NS3 du VHC a montré que la protéine NS3 associée à son cofacteur NS4A inhibe partiellement la réponse IFN de type I en empêchant l’import nucléaire de STAT1. Ce phénotype pourrait résulter de la dégradation de KPNA1 par NS3/4A. Par ailleurs, l’identification de nouveaux inter-acteurs de la protéine NS1 du virus influenza par criblage double-hybride levure a révélé la protéine induite par les IFN de type I, ADAR1, comme partenaire de la protéine NS1 de multiples souches virales et nous avons montré qu'ADAR1 est un facteur pro-viral dont la fonction editing est activée par NS1 / To replicate and propagate efficiently, viruses have developed multiple strategies allowing them to escape the innatedefense system: the type I IFN system, This work of thesis then consisted in studying the interactions between viralproteins and proteins of this defence system in order to understand better the mechanisms of viral subversion andidentifY possible therapeutic cellular tatgets. The reconstruction of a network of interacting proteins involved in the typeI IFN system allowed us to identifY differentiai subversion strategies for 4 viral families and to show a massive andsignificant targeting of proteins of the type I IFN system by viruses. Proteins directly interacting with the type Iinterferon system network are also strongly targeted by viruses and are potential modulators of the type I IFN system.Among these modulators, the most tatgeted function conesponds to the transport of NLS-bearing substrates to thenucleus and the KPNAI protein involved in this process held our attention. The functional study of the interactionbetween KPNA1 and NS3 protein of the HCV showed that NS3 protein associated with its cofactor NS4A inhibitsprutially the type I IFN response by preventing the nuclear translocation of ST A Tl. This phenotype could result fromthe degradation of KPNAI by NS3/4A. Besides, the identification of new cellular prutners ofNS 1 prote in of influenzavirus by yeast two-hybrid screens revealed ADARI, an interferon-stimulated prote in, as partner of NS 1 of ali testedvirus strains and we showed that ADARI is an essential host factor for viral replication and its editing function isactivated by NS 1 protein

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont les productrices majeures d’IFN de type I dans l’organisme humain. Durant les infections virales chroniques, telles que l’infection par le Virus de l’Hépatite C, les pDCs sont fonctionnellement altérées. L’efficacité dans plus de 50% des cas du traitement par IFN-α, utilisé jusqu’à récemment, suggère que la modulation de la fonction des pDCs serait une cible intéressante pour le traitement HCV. Les pDCs reconnaissent l’ARN du HCV par les récepteurs Toll-like, et disposent de plus d’un set de récepteurs dits régulateurs qui régulent la production d’IFN-I. L’activation de ces RR inhibe la production d’IFN-I par les pDCs stimulées par les agonistes de TLR7/9. Nous montrons ici que la glycoprotéine d’enveloppe E2 du HCV est un nouveau ligand des RR BDCA2 et DCIR des pDCs, et que cette liaison est responsable de l’inhibition d’IFN-I via l’activation de la voie de signalisation BCR-like. Nous avons ensuite voulu restaurer la production d’IFN-I dans les pDCs en ciblant les kinases décrites de la voie BCR-like, Syk et Mek. En inhibant Syk, l’IFN-I n’a été que partiellement restauré par les concentrations subliminales de l’inhibiteur; les concentrations élevées de cet inhibiteur ont bloqué la production d’IFN-I, suggérant l’implication de Syk dans la voie TLR7/9 comme montré pour l’activation des TLR dans les macrophages. En inhibant MEK, la restauration d’IFN-I est efficace. Les mécanismes de cette restauration sont explorés. Le ciblage pharmacologique de la signalisation BCR-like constituerait une nouvelle approche intéressante pour étudier les mécanismes de modulation de l’activation des pDCs dans les conditions physiopathologiques. / Plasmacytoid dendritic cells are major producers of type I IFN in human organism. During chronic viral infections, such as Hepatitis C Virus infection, pDCs are functionally impaired. More than 50% efficiency of IFN-α treatment, until recently used, suggested that modulation of pDC function could be an important target for HCV treatment. pDCs recognize HCV RNA by Toll-like receptors, and dispose of a set of so-called regulatory receptors that regulate IFN-I production. Crosslinking of these RR such as BDCA-2 and ILT7 has been shown to inhibit IFN-I production by pDCs stimulated with TLR7/9 agonists. In this work we show that HCV envelope glycoprotein E2 is a novel ligand of pDC RR, BDCA-2 and DCIR, and that this binding is responsible for IFN-I inhibition via the activation of the BCR-like pathway. Then we assayed to restore IFN-I in pDCs with crosslinked RR by targeting well-known kinases of BCR-like pathway, Syk and Mek. When inhibiting Syk, IFN-I was only partially restored by subliminal concentrations of Syk inhibitor; high concentrations of Syk inhibitor effectively blocked IFN-I production, suggesting involvement of Syk in the TLR7/9 pathway as it was already demonstrated in TLR activation in macrophages. When inhibiting MEK, the restoration of type I IFN was effective. The underlying mechanisms leading to the restoration are further explored. Pharmacological targeting of BCR-like signaling may constitute an attractive new approach to study mechanisms of modulation of pDC activation in pathophysiological conditions.

La mucoviscidose est une pathologie pulmonaire causée par un dysfonctionnement du canal CFTR et caractérisée par un mucus visqueux, une susceptibilité accrue aux infections chroniques et une inflammation excessive. Une première partie de ma thèse a eu pour objectif d’étudier les mécanismes inflammatoires impliqués dans le développement de la pathologie. Nous avons plus particulièrement analysé le rôle de l’IL-1β et de l’IL-17 dans la réponse à l’infection par Pseudomonas aeruginosa, dans le modèle murin ΔF508 de mucoviscidose. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de la malaria pulmonaire et cérébrale, une complication létale de l’infection à P. falciparum. Nous avons mis en évidence l’importance de trois voies d’activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques dans le développement de la neuropathologie induite par Plasmodium berghei ANKA chez la souris : la protéine PKC-θ, la sous-unité β2 du récepteur à l’IL-12 et le récepteur des IFN de type I, mais qui ne semblent pas impliquées dans l’inflammation pulmonaire associée. / Cystic fibrosis is a pulmonary pathology, caused by the CFTR channel dysfunction, and characterized by high mucus viscosity, increased sensitivity to chronic infections and excessive inflammation. The aim of my thesis was first to study the inflammatory mechanisms involved in this lung pathology. Indeed, we analyzed the role of IL-1β and IL-17 in response to Pseudomonas aeruginosa infection, in the ΔF508 mouse model of cystic fibrosis. In the second part of my thesis, I studied pulmonary and cerebral malaria, a lethal complication of P. falciparum infection. We showed the importance of three pathways implicated in cytotoxic CD8+ T lymphocytes activation during the Plasmodium berghei ANKA-induced neuropathology development in mice: PKC-θ protein, β2 subunit of IL-12 receptor and type I IFN receptor, which did not seem essential for the associated lung inflammation.