published_or_final_version / Microbiology / Doctoral / Doctor of Philosophy

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Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El presente trabajo consistió en la utilización de un método de evaluación y decisión multicriterio para realizar una jerarquización de 32 humedales de Chile, en base al riesgo de traspaso de influenza aviar altamente patógena, desde las aves migratorias y residentes ubicadas en los humedales, hasta las aves domésticas ubicadas en los predios cercanos a estos humedales. Se utilizó el Proceso Analítico Jerárquico (AHP) a través del programa computacional Expert Choice 2000. En la metodología se requirió la participación de expertos del área pecuaria, los cuales tomaron el problema de riesgo de traspaso del virus, desglosándolo en sus componentes principales; luego, mediante un proceso de priorización y evaluación, asignaron un valor numérico a cada componente del problema. Finalmente, se vinculó cada uno de los 32 humedales con cada componente y, a través de las características propias de estos humedales, se obtuvo un puntaje de riesgo. Como resultado, se logró un ordenamiento, que jerarquiza a los humedales de mayor a menor riesgo de traspaso del virus influenza aviar. Además, la disposición del ranking permitió la formación de cuatro grupos de diferente riesgo, que permiten enfocar de una mejor manera las gestiones y recursos para la prevención y detección temprana de la influenza aviar

A thesis submitted to the Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, Johannesburg, in fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy Johannesburg, October 2014 / Introduction Data on the burden of influenza-associated hospitalisation and mortality in relation to other aetiologies of pneumonia as well as risk groups for severe and complicated disease are important to guide influenza prevention policy. Materials and methods We estimated influenza-related deaths as excess mortality above a model baseline during influenza epidemic periods from monthly age-specific mortality data using Serfling regression models. For individuals aged ≥65 years from South Africa and the United States of America (US) we evaluated influenza-related deaths due to all causes, pneumonia and influenza (P&I) and other influenza-associated diagnoses for 1998-2005. For adults with acquired immune deficiency syndrome (AIDS) aged 25-54 years in South Africa (1998-2005) and the US (pre-highly active antiretroviral therapy (HAART) era: 1987-1994; HAART era: 1997-2005) we estimated deaths due to all-causes and P&I. We prospectively enrolled individuals with severe acute respiratory illness (SARI) at six hospitals in four provinces of South Africa from 2009-2012. Using polymerase chain reaction, respiratory samples were tested for ten respiratory viruses and blood for pneumococcal DNA. Cumulative annual SARI incidence was estimated at one site with available population denominators. Results Age-standardised excess mortality rates amongst seniors were higher in South Africa than in the US (545 vs. 133 per 100,000 for all-causes, p<0.001; 63 vs. 21 for P&I, p=0.03). The mean percent of winter deaths attributable to influenza was 16% in South Africa and 6% in the US, p<0.001. For all respiratory causes, cerebrovascular disease and diabetes age-standardised excess death rates were 4- to 8-fold greater in South Africa than in the US, and the percent increase in winter deaths attributable to influenza was 2- to 4-fold higher. In the US pre-HAART, influenza-related mortality rates in adults with AIDS were 150- (95% confidence interval (CI) 49-460) and 208- (95% CI 74-583) times greater than in the general population for all-cause and P&I respectively and 2.5- (95% CI 0.9-7.2) and 4.1- (95% CI 1.4-13) times higher than in seniors. Following HAART introduction, influenza-related mortality in adults with AIDS dropped 3-6 fold but remained elevated compared to the general population (all cause relative risk (RR) 44, 95% CI 16-12); P&I RR 73, 95% CI 47-113). Influenza-related mortality in South African adults with AIDS was similar to that in the US in the pre-HAART era. From 2009-2012 we enrolled 8723 children age <5 years with SARI. The human immunodeficiency virus (HIV) prevalence among tested children was 12% (705/5964). The overall prevalence of respiratory viruses identified was 78% (6517/8393), which included 26% (n=2216) respiratory syncytial virus (RSV) and 7% (n=613) influenza. The annual incidence of SARI hospitalisation in children age <5 years ranged from 2530-3173 per 100,000 and was 1.1-3-fold greater in HIV-infected than HIV-uninfected children. In multivariable analysis, compared to HIV-uninfected children, HIV-infected children were more likely to be hospitalised >7 days (odds ratio (OR) 3.6, 95% CI 2.8-5.0) and had a 4.2-fold (95% CI 2.6-6.8) higher case-fatality ratio. From 2009-2012, we enrolled 7193 individuals aged ≥5 years with SARI. HIV-prevalence was 74% (4663/6334) and 9% (621/7067) tested influenza positive. The annual incidence of SARI hospitalisation in individuals age ≥5 years ranged from 325-617 per 100,000 population and was 13 to 19-fold greater in HIV-infected individuals (p<0.001). On multivariable analysis, compared to HIV-uninfected individuals, HIV-infected individuals were more likely to be receiving tuberculosis treatment (OR 2.1, 95% CI 1.3-3.2), have pneumococcal infection (OR 2.2, 95% CI 1.6-2.9), be hospitalised for longer (>7 days rather than <2 days OR 2.4, 95% CI 1.8-3.2) and had a higher case-fatality ratio (8% vs. 5%; OR 1.6, 95% CI 1.2-2.2), but were less likely to be infected with influenza (OR 0.6, 95% CI 0.5-0.8). Influenza was identified in 9% (1056/11925) of patients of all ages enrolled in SARI surveillance from 2009-2011. Among influenza case-patients, 44% (358/819) were HIV-infected. Age-adjusted influenza-associated SARI incidence was 4-8 times greater in HIV-infected (186-228 per 100,000 population) than HIV-uninfected (26-54 per 100,000 population). On multivariable analysis, compared to HIV-uninfected individuals, HIV-infected individuals with influenza-associated SARI were more likely to have pneumococcal co-infection (OR 2.3, 95% CI 1.0-5.0), influenza type B than type A (OR 1.6, 95% CI 1.0-2.4), be hospitalised for 2-7 days (OR 2.8 95% CI 1.5-5.5) or >7 days (OR 4.5, 95% CI 2.1-9.5) and more likely to die (OR 3.9, 95% CI 1.1-14.1). Discussion and conclusions The mortality impact of seasonal influenza in the South African elderly may be substantially higher in an African setting compared to the US. Adults with AIDS in South Africa and the US experience substantially elevated influenza-associated mortality rates, which although lessened by widespread HAART treatment does not completely abrogate the heightened risk for influenza illness. HIV-infected children and adults also experience substantially elevated incidence of hospitalisation for influenza-associated SARI and have higher case-fatality ratios. Influenza is commonly detected amongst children (7%) and adults (9%) with SARI. Less frequent identification of influenza amongst HIV-infected than -uninfected individuals aged ≥5 years likely reflects increased relative burden and role of other opportunistic pathogens such as pnuemococcus and Pneumocystis jirovecii. Improved access to HAART for HIV-infected individuals and vaccination against influenza virus amongst HIV-infected individuals, young children and the elderly, where the influenza burden is great may reduce the high burden of hospitalisations and mortality associated with influenza.

Influenza, também conhecida como gripe, é uma doença infecciosa viral que acomete um grande número de indivíduos anualmente, sendo responsável por um elevado número de internações e óbitos. O agente etiológico é o Myxovirus influenzae, vírus envelopado, de RNA de fita simples e polaridade negativa. A vacinação é a forma mais eficaz de se prevenir a infecção pelo vírus, no entanto, a capacidade produtiva dessa vacina não é suficiente para a vacinação da totalidade da população mundial, principalmente em casos de pandemia. Esse projeto teve por objetivo desenvolver uma vacina influenza (fragmentada e inativada) adjuvada, visando aumentar a capacidade produtiva dessa vacina no Instituto Butantan, que hoje é estimada em aproximadamente 40 milhões de doses por campanha. A utilização de adjuvantes na formulação da vacina influenza é capaz de produzir a mesma resposta imunológica protetora contra esse vírus, utilizando uma quantidade menor dos antígenos vacinais, aumentando a capacidade de produção da vacina em até quatro vezes. Foram estudadas 23 formulações adjuvantes utilizando o esqualeno como referência (formulação similar ao MF59®, adjuvante desenvolvido pela Novartis), vitaminas lipossolúveis (vitaminas A, D e E), vitamina B2 (vitamina hidrossolúvel), MPLA (monofosforil lipídio A, produzido pelo Instituto Butantan como subproduto da vacina pertussis low) e gel de hidróxido de alumínio. Para tanto, foram avaliadas a resposta imune conferida a camundongos BALB/c após imunização com diferentes formulações de vacina influenza (fragmentada e inativada) adjuvada e a existência, ou não, de toxicidade induzida pelas formulações vacinais estudadas. As formulações vacinais mais promissoras farão parte das formulações candidatas para realizações de ensaios clínicos. Os animais foram imunizados por via intraperitoneal com as formulações vacinais e foram colhidas amostras de sangue para ensaios sorológicos (inibição de hemaglutinação e ELISA) e células esplênicas para avaliação celular (dosagem de citocinas por citometria de fluxo: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17 TNF-&#945; e INF-&#947;). Além disso, em um dos experimentos avaliou-se a formação de memória imunológica contra influenza, parâmetro importante em se pensando em uma vacina. Os três primeiros experimentos foram uma triagem a partir da qual selecionaram-se as melhores formulações que foram testadas no último experimento. Nele foram avaliados além da indução de resposta imune a toxicidade e a memória imunológica. Todas as 23 formulações estudadas induziram resposta minimamente protetora nos animais, com exceção da formulação contendo apenas MPLA como adjuvante. As formulações que se mostraram mais promissoras continham além do gel de AI(OH)3 MPLA de B. pertussis ou vitamina B2. Isso sem considerar o tocoferol (vitamina E), que embora tenha apresentado bons resultados acabou preterido em decorrência de sua potencial relação com casos de narcolepsia descritos na literatura. O teste de memória foi capaz de demonstrar que essas formulações produzem resposta de memória imunológica duradoura. Assim, tem-se resultados promissores para novos estudos pré-clínicos e clínicos com a vacina influenza (fragmentada e inativada) sazonal (trivalente). / Influenza, also known as flu, is a viral infectious disease that infects a large number of people annually, being responsible by large morbidity and mortality rates. The etiologic agent is the Myxovirus influenzae, an enveloped virus with single-stranded RNA and negative polarity. Vaccination is the best way to prevent the virus infection; however, the production capacity of this vaccine is not sufficient to vaccinate the entire world population, especially in cases of pandemics. This project aimed to develop an adjuvanted influenza vaccine (split and inactivated), increasing the productive capacity of this vaccine in Instituto Butantan, which is estimated in approximately 40 million of doses by campaign. Influenza vaccines formulated with adjuvants can produce the same protective immunological response against the virus using less amount of antigen increasing the production capacity of this vaccine up to four times. Twenty-three adjuvants containing fat-soluble vitamins (vitamins A, D and E), vitamin B2 (water-soluble vitamin), MPLA (monophosphoryl lipid A, produced by Instituto Butantan as a byproduct of pertussis low vaccine production) and aluminum hydroxide gel were studied. An adjuvant similar to MF59® (Novartis adjuvant) containing squalene was used as control. The immune response elicited in BALB/c mice after immunization with the different formulations of the influenza vaccine and the existence or not of toxicity induced by the vaccines formulations were studied. The most promising formulation will be part of the candidate formulations of clinicai trials. The animais received the vaccine formulations intraperitoneally and at specific days blood samples were taken to serological tests (hemagglutination inhibition and ELISA). At the end, they were euthanized to collect the spleens and splenic cells were cultivated to evaluate cytokines by flow cytometry: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17 TNF-&#945; and INF-&#947;. Furthermore, in one experiment the immunological memory against influenza was evaluated, an important parameter to vaccines. The most promising formulations contained besides to alum either B. pertussis MPLA or B2 vitamin. Tocopherol (vitamin E) presented good results too, however it has a potential relationship with reported cases of narcolepsy. The memory test was able to demonstrate that these formulations induced long lasting immune memory response. Thus, these are promising results for new pre-clinical and clinical trials with seasonal trivalent influenza vaccine (split and inactivated).

A gripe é causada pelo vírus Influenza e é um problema de saúde pública mundial, que pode levar a problemas sérios em idosos e crianças. O Brasil implantou a vacinação anual contra influenza a partir de 1999, como ação preventiva contra a doença. A vacina é produzida pelo Instituto Butantan e contém três cepas diferentes do vírus Influenza fragmentado para induzir resposta imune adaptativa, com produção de anticorpos específicos e neutralizantes. A literatura tem mostrado que a exposição à xenobióticos com potencial imunossupressor pode comprometer a eficácia de imunizações ativas, como a imunização contra a gripe. Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que a exposição à hidroquinona (HQ), um composto tóxico presente em altas concentrações na fumaça do cigarro, prejudica a resposta imune inata e adquirida. Assim, este trabalho avaliou o efeito da exposição à HQ sobre a resposta imune à vacinação contra influenza. Camundongos machos da linhagem C57BL/6 foram diariamente expostos à HQ (2500 ppm) ou PBS, por 1 hora, por nebulização, por um período de 8 semanas. Durante este período, foram imunizados nas semanas 6 e 8 do início das exposições, pela injeção i.m. de 100&#181;L da vacina. Os parâmetros tóxicos e imunológicos foram avaliados 7, 35 e 70 dias após a segunda dose da vacina. A exposição à HQ não alterou o peso corpóreo dos animais e nem causou alterações morfológicas no pulmão, fígado e rins (histologia por H&E); reduziu a frequência de hemácias (11%), hematócrito (14%), hemoglobina (14%) e volume celular (4%); causou estresse oxidativo no baço (citometria de fluxo); aumentou a área dos folículos de células B no baço e linfonodomegalia (histologia por H&E). Em conjunto, os dados aqui obtidos mostram que a exposição à HQ afetou mecanismos envolvidos na gênese da imunidade ativa contra influenza. Assim, os dados deste trabalho mostram mecanismos tóxicos ainda não descritos para a HQ, e ressalta a HQ como um poluente ambiental que deve ser considerado nas avaliações de risco. / The flu is a health problem worldwide which is caused by the Influenza virus and may result in severe illness in infants and the elderly. The annually vaccination against influenza was implemented in Brazil in 1999 as a preventive measure. The vaccine is produced by Butantan Institute and contains three different strains of the inactivated Influenza virus which induce the adaptive immune response along with production of specific and neutralizing antibodies. The literature has shown that exposure to immunosuppressive xenobiotics may compromise the efficacy of active immunizations, such as influenza. Our research group has shown that exposure to hydroquinone (HQ), a toxic constituent of cigarette smoke, impairs both innate and adaptive immune response. Thus, the aim of this work was to evaluate the effects of HQ on the immune response induced by the influenza vaccine. Male C57BL/6 mice were daily exposed to HQ (2500 ppm) or PBS by nebulization, for 1 hour, for 8 weeks. During the exposure period, the animals were vaccinated on weeks 6 and 8 with 100&#181;L of the vaccine. Toxicologic and immunological parameters were assessed 7, 35 and 70 days after boost administration. HQ exposure did not alter body weight and did not cause morphological alterations in the lungs, liver and kidneys (H&E staining); reduced the frequency of erythrocytes (11%), hematocrit (14%), hemoglobin (14%) and cellular volume (4%) and caused oxidative stress on the spleen (Flow Cytometry); increased the area of B cell follicles in the spleen and increased the size of draining lymph nodes (H&E staining). Altogether, these data show that HQ exposure affected mechanisms involved in the genesis of the adaptive immune response. Thus, the data presented in this work show toxic mechanisms of HQ that have not yet been described, and it also points out HQ as an environmental pollutant which should be considered on risk assessments.

Introdução: Desde 1999, o serviço público de saúde tem promovido a vacinação anual de idosos contra a gripe no país. Poucos estudos avaliaram a efetividade da intervenção focalizando especificamente sua contribuição para a redução da mortalidade atribuível aos surtos de gripe. Objetivos: O presente estudo teve como propósito comparar a mortalidade por gripe e pneumonia de idosos (65 anos ou mais) antes e depois do início da vacinação nas regiões Nordeste e Sul do Brasil, e comparar os resultados obtidos para cada região, procurando referenciar hipóteses relativas às diferentes condições climáticas e condições socioeconômicas. Métodos: Dados oficiais de população e de mortalidade por gripe e pneumonia foram levantados junto às agências governamentais (Fundação IBGE e DATASUS) responsáveis pelo gerenciamento dessas informações. Foram estimados coeficientes semanais de mortalidade com ajuste por diferenças na distribuição por sexo e por idade. Para a identificação de surtos de gripe e a estimação da mortalidade especificamente atribuível a esses surtos, foi utilizado o modelo de Serfling. As taxas foram estudadas para os períodos 1999-2009 (em que a vacinação foi realizada) e 1996-1998 (em que a vacinação não foi realizada). Foram descritas e analisadas a magnitude das taxas em cada período, sua possível redução associada à vacinação e a ocorrência de variação sazonal. Os indicadores resultantes da comparação entre os dois períodos foram objeto de análise comparativa entre as regiões Nordeste e Sul. Resultados: Durante o período de vacinação, a média anual do número de períodos com excesso de mortalidade foi reduzida em 32,8 por cento na região Sul; em 4,5 por cento na região Nordeste. Na região Sul, a duração média de tais períodos foi reduzida em 66,2 por cento e a mortalidade por semana foi reduzida em 43,9 por cento . Na região Nordeste; a duração média de tais períodos aumentou 22,2 por cento e a mortalidade atribuível à influenza por semanaaumentou 140,2 por cento . Conclusão: O presente estudo reforça a hipótese de quea vacinação contra gripe em idosos foi efetiva para a região Sul, mas nãopara a região Nordeste do Brasil. A inadequação entre o período do ano em que a vacinação é realizada e a variação sazonal da mortalidade por gripe epneumonia na região Nordeste são apontadas como possíveis fatores que teriam contribuído para esse achado / Introdução: Desde 1999, o serviço público de saúde tem promovido a vacinação anual de idosos contra a gripe no país. Poucos estudos avaliaram a efetividade da intervenção focalizando especificamente sua contribuição para a redução da mortalidade atribuível aos surtos de gripe. Objetivos: O presente estudo teve como propósito comparar a mortalidade por gripe e pneumonia de idosos (65 anos ou mais) antes e depois do início da vacinação nas regiões Nordeste e Sul do Brasil, e comparar os resultados obtidos para cada região, procurando referenciar hipóteses relativas às diferentes condições climáticas e condições socioeconômicas. Métodos: Dados oficiais de população e de mortalidade por gripe e pneumonia foram levantados junto às agências governamentais (Fundação IBGE e DATASUS) responsáveis pelo gerenciamento dessas informações. Foram estimados coeficientes semanais de mortalidade com ajuste por diferenças na distribuição por sexo e por idade. Para a identificação de surtos de gripe e a estimação da mortalidade especificamente atribuível a esses surtos, foi utilizado o modelo de Serfling. As taxas foram estudadas para os períodos 1999-2009 (em que a vacinação foi realizada) e 1996-1998 (em que a vacinação não foi realizada). Foram descritas e analisadas a magnitude das taxas em cada período, sua possível redução associada à vacinação e a ocorrência de variação sazonal. Os indicadores resultantes da comparação entre os dois períodos foram objeto de análise comparativa entre as regiões Nordeste e Sul. Resultados: Durante o período de vacinação, a média anual do número de períodos com excesso de mortalidade foi reduzida em 32,8 por cento na região Sul; em 4,5 por cento na região Nordeste. Na região Sul, a duração média de tais períodos foi reduzida em 66,2 por cento e a mortalidade por semana foi reduzida em 43,9 por cento . Na região Nordeste; a duração média de tais períodos aumentou 22,2 por cento e a mortalidade atribuível à influenza por semanaaumentou 140,2 por cento . Conclusão: O presente estudo reforça a hipótese de quea vacinação contra gripe em idosos foi efetiva para a região Sul, mas nãopara a região Nordeste do Brasil. A inadequação entre o período do ano em que a vacinação é realizada e a variação sazonal da mortalidade por gripe epneumonia na região Nordeste são apontadas como possíveis fatores que teriam contribuído para esse achado

Resumo Introdução: A Vigilância Sanitária se constitui como campo de intervenção da Saúde Pública tendo como uma de suas responsabilidades, garantir o controle sanitário de aeroportos e a proteção da saúde dos viajantes. Objetivo: Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo conhecer, descrever e analisar a prática sanitária adotada frente à Pandemia de Influenza A (H1N1) 2009, pela Vigilância Sanitária no Terminal de Passageiros do Aeroporto de Guarulhos. Metodologia: A pesquisa qualitativa foi adotada, tendo como referencial teórico as representações sociais. Utilizou-se o referencial metodológico da hermenêutica dialética, fazendo uso de uma abordagem interpretativa reconstrutiva das falas dos entrevistados. A construção das três categorias empíricas Trabalho, Comunicação, Intersetorialidade - permitiu resgatar junto às falas dos profissionais pesquisados a prática vivenciada pela Vigilância Sanitária durante a pandemia. Resultados: Pôde-se apreender que as dificuldades evidenciadas durante a Pandemia de H1N1 estiveram relacionadas aos recursos humanos, à estrutura física e de material, ao fluxo de procedimentos e de informações. Conclusões: Os resultados evidenciaram a prática da VISA associada diretamente a sua estrutura organizacional; a uma atuação coadunada com o desenvolvimento atual do país; e uma experiência que serviu como o mais importante e único teste de enfrentamento para uma pandemia de influenza / Abstract Introduction: The Health Surveillance is a field of Public Health with the one of its responsibilities to ensure the sanitary control of airports and heath protection of travelers. Objective: In this sense, the present study aimed to understand, describe and analyze the sanitary practice adopted on the face of Influenza A (H1N1) Pandemic in 2009, by the Health Surveillance Agency in the passengers arrival gates of Guarulhos Airport. Methodology: The qualitative research was adopted in this study, using as a theoretical reference the social representations. In this document it was used the referral method of Hermeneutic Dialectic, using the interpretation of the interviews. It was built three empirics categories, which allowed retrieving in the interviews the practical experience of the employees of the Health Surveillance during the Pandemic period. Outcomes: It could be learnt that the difficulties during the A H1N1 Pandemic was related to the human resources, physical and material infrastructure and the process and information flows. Conclusion: The outcomes emphasized the way the Health Surveillance works directly linked to its organizational structure; its behavior, aligned with the current Brazil situation; and the experience which was a unique test of how they face the Influenza pandemic