Mutations in the gene encoding the bone morphogenetic protein type 2 receptor (BMPR2) are the most common genetic cause of heritable pulmonary arterial hypertension (PAH). However, given the reduced penetrance of BMPR2 mutations in affected families, a major outstanding question is the identity of additional factors or pathways that are responsible for the manifestation of clinical disease. Furthermore, limited human tissue is available for study and usually only from patients with end-stage disease, making it difficult to understand how PAH is established and progresses. Alternative human models of PAH are therefore required. This thesis describes the characterisation of the first human iPSC-derived smooth muscle cell (iPSC-SMC) model of PAH and elucidates the role of BMPR2 deficiency in establishing PAH-associated phenotypes in iPSC-derived SMCs. To achieve this, I used CRISPR-Cas9 gene editing to generate wild-type and BMPR2+/- iPSC lines with isogenic backgrounds which were subsequently differentiated into lineage-specific iPSC-SMCs that displayed a gene expression profile and responses to BMP signalling akin to those present in distal pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs). Using these cells, I found that the introduction of a single BMPR2 mutation in iPSC-SMCs was sufficient to recapitulate the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype of patient-derived BMPR2+/- PASMCs. However, acquisition of the mitochondrial hyperpolarisation phenotype was enhanced by inflammatory signalling and required an interaction between BMPR2 mutations and environmental stimuli provided by exposure to serum over time. Furthermore, I showed that BMPR2+/- iPSC-SMCs had an altered differentiation state and were less contractile compared to wild-type iPSC-SMCs, phenotypes which have not been observed previously in PAH-derived PASMCs. Finally, RNA sequencing analysis identified genes that were differentially expressed between wild-type and BMPR2+/- iPSC-SMCs and may hence provide further insights into PAH pathobiology. The iPSC-SMC model described in this study will be useful for identifying additional factors involved in disease penetrance and for validating therapeutic approaches that target BMPR2.

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Die Reprogrammierung somatischer Zellen hat sich kürlich als leistungsfähige Technik für die Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) aus terminal differenzierten Zellen bewährt. Trotz der großen Hoffnung, die sie speziell im Bezug auf patientenspezifische Stammzelltherapie darstellt, gibt es viele Hindernisse auf dem Weg zur Anwendung in der Humanmedizin, die sich von niedrigen Effizienzen bei der technischen Umsetzung bis hin zur unerwünschten Integration von Onkogenen in das menschliche Genom erstrecken. Aus diesem Grund ist es unabdingbar, unser Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse und Mechanismen zu vertiefen. Durch neue Datengewinnungsmethoden und stetig wachsende biologische Komplexität hat sich der Denkansatz der Systembiologie in den letzten Jahrzehnten stark etabliert und erfährt eine fortwährende Entwicklung seiner Anwendbarkeit auf komplexe biologische und biochemische Zusammenhänge. Verschiedene mathematische Modellierungsmethoden werden auf den Reprogrammierungsprozess angewendet um Engpässe und mögliche Effizienz-Optimierungen zu erforschen. Es werden topologische Merkmale eines Pluripotenznetzwerkes untersucht, um Unterschiede zu zufällig generierten Netzen und so topologische Einschränkungen des biologisch relevanten Netzwerkes zu finden. Die Optimierung eines Booleschen Modells aus einem selbst kuratierten Netzwerk in Bezug auf Genexpressionsdaten aus Reprogrammierungsexperimenten gewährt tiefgreifende Einblicke in die ersten Schritte und wichtigsten Faktoren des Prozesses. Der Transkriptionsfaktor SP1 spielt hierbei eine wichtige Rolle zur Induktion eines intermediären, transkriptionell inaktiven Zustands. Ein probabilistisches Boole''sches Modell verdeutlicht das Zusammenspiel epigenetischer und transkriptioneller Kontrollprozesse zusammen, um Pluripotenz- und Zelllinien-Entscheidungen in Reprogrammierung und Differenzierung zu treffen. Erklärungen für die geringe Effizienz werden versucht. / Somatic Cell Reprogramming has emerged as a powerful technique for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from terminally differentiated cells in recent years. Although holding great promises for future clinical development, especially in patient specific stem cell therapy, the barriers on the way to a human application are manifold ranging from low technical efficiencies to undesirable integration of oncogenes into the genome. It is thus indispensable to further our understanding of the underlying processes involved in this technique. With the advent of new data acquisition technologies and an ever-growing complexity of biological knowledge, the Systems Biology approach has seen an evolution of its applicability to the elaborate questions and problems of researchers. Using different mathematical modeling approaches the process of somatic cell reprogramming is examined to find out bottlenecks and possible enhancements of its efficiency. I analyze the topological characteristics of a pluripotency network in order to find differences to randomly generated networks and thus deduce constraints of the biologically relevant network. The optimization of a Boolean model from a curated network against early reprogramming gene expression profiles reveals profound insights into the first steps and most important factors of the process. The transcription factor SP1 emerges to play an important role in the induction of an intermediate, transcriptionally inactive state. A probabilistic Boolean network (PBN) illustrates the interplay of transcriptional and epigenetic regulatory processes in order to explain pluripotency and cell lineage decisions in reprogramming and differentiation. Explanations for the low reprogramming efficiencies are tried.

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Les mécanismes de type prion sont désormais reconnus comme sous-tendant la plupart des maladies neurodégénératives humaines, avec en premier lieu la maladie d’Alzheimer (MA) au niveau de ses 2 marqueurs spécifiques, l’amyloïde β (Aβ à l’origine de l’hypothèse étiopathogénique de la cascade amyloïde) et la protéine Tau phosphorylée. Par ailleurs la protéine du prion (PrPC) est décrite comme interagissant à de multiples niveaux avec le métabolisme de l’Aβ sans que les mécanismes physiopathologiques sous-jacents n’aient pu être expliqués. Pour sortir de l’impasse actuelle concernant le développement d’approches thérapeutiques efficaces pour la MA, l’industrie pharmaceutique a besoin de modèles expérimentaux innovants. En effet, à ce jour aucun modèle in vivo, en dépit des progrès réalisés avec les souris transgéniques, n’arrive à refléter la complexité cérébrale humaine ni à mimer une MA clinique. Les cultures in vitro en 2D sont quant à elles très éloignées des situations conduisant à l’accumulation d’agrégats protéiques pathologiques. Le but de notre thèse a été d’utiliser dans le domaine des neurosciences les nouvelles perspectives de recherche ouvertes par les technologies des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) en développant un modèle de différentiation en 3D pour obtenir des organoïdes cérébraux humains (OC) (mini cerveaux). Leur capacité d’auto-organisation en 3D de tissu neuroectodermique nous a permis de recréer un système complexe mimant différentes structures cérébrales humaines dans lesquelles nous avons pu caractériser les marqueurs attendus. L’étude de l’expression des protéines d’intérêt APP et PrPC pendant la différentiation neurale a permis de caractériser la modulation des niveaux des deux protéines en fonction du temps de culture. Afin d’orienter le modèle vers des mécanismes d’accumulation protéique de type MA, nous avons testé différents inducteurs chimiques dont l’Aftin-5 qui est capable de moduler les voies post-traductionnelles de l’APP. Plusieurs stratégies de traitement ont été adoptées pour induire le clivage de l’APP et la génération d’Aβ. La production des fragments solubles Aβ38, Aβ40, Aβ42 a été mise en évidence par ELISA. Les niveaux générés sont reproductibles et l’augmentation du ratio Aβ42/Aβ40 est cohérente avec les données extrapolées des modèles murins et humains, ce qui a permis de valider notre modèle. Les niveaux d’expression génique et protéique de PrPC et de APP suite au traitement ont été analysés afin de mieux déterminer le rôle de l’interaction entre ces deux facteurs. L’objectif à long terme consiste à améliorer ce modèle, dont les limites actuelles sont notamment l’absence de vascularisation et le niveau de maturation du tissu neural. Le défi majeur dans le cadre de la culture des OC consiste donc à favoriser l’intégration du système vasculaire, et par ailleurs à accélérer le vieillissement in vitro pour l’étude de maladies neurodégénératives. La perspective de pouvoir automatiser le système de culture des OC permet d’envisager l’utilisation de ce modèle à plus grande échelle dans le cadre de test de cytotoxicité et/ou de criblage pharmacologique à haut débit pour identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour la MA. / Prion-like mechanisms are known to underlie most of human neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD), which is characterized by two important pathological markers, β amyloid (or Aβ at the origin of the etiopathogenic amyloid cascade hypothesis) and phosphorylated tau protein. Furthermore, the prion protein (PrPC) interacts at multiple levels with the metabolism of Aβ, by mechanisms which are not well understood. To overcome the current limits in the development of efficient strategies to treat AD, the pharmaceutical industry requires innovative experimental models. However, even if a lot of progress has been achieved by using transgenic mouse models, to date no in vivo model can reflect the complexity of human brain or reproduce a clinical context. 2D in vitro cell culture models are unable to allow the aggregation and accumulation of pathological proteins as observed in vivo. The aim of this study consists in taking advantage of the research prospects offered by induced pluripotent stem cell (iPSCs) in the field of neurosciences. iPSCs can be used to generate 3D models of differentiation also called human cerebral organoids or mini-brains (MBs). Their ability to self-organise in 3D neuroectodermic tissue leds to a complex system that mimics different human cerebral structures in which we were able to characterize the expected markers. The study of the two proteins of interest (APP and PrPC) during neural differentiation has allowed us to follow the modulation of protein expression level occurring during the in vitro development of the human MBs. In order to use this model to reproduce the protein accumulation mechanisms seen in AD, we have tested chemical inductors such as Aftin-5 in order to modulate the APP post-transcriptional pathway towards a pathological outcome. Many strategies of treatment are adopted to lead APP cleavage and Aβ generation. The production of soluble fragments Aβ38, Aβ40, Aβ42 in the supernatant of organoids has been showed using ELISA technique. The levels generated are reproducible and the increase of Aβ42/Aβ40 ratio is consistent with extrapolated data from mouse and human models thus validating our model. Analysis at the gene and protein level has been assessed in order to understand the interaction between PrPC and APP after treatment. The long-term goal consists in improving this model which is notably hampered by the absence of vascularization and the low level of maturation of the neural tissue. The main challenge in MB culture thus consists in the integration of the vascular system, and also in increasing the speed of ageing process in vitro for the study of neurodegenerative diseases. In the long term, the prospect of automating the culture of MBs would allow the use of the system for cytotoxicity testing and/or high throughput screening for the discovery of new drugs for AD.

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Al?m disso, fatores do NER j? tiveram fun??es descritas em outros processos biol?gicos, sendo importante que se busque novas fun??es biol?gicas que possam ser associadas aos fen?tipos das s?ndromes causadas por muta??es nos genes da via NER, dentre elas a Xeroderma pigmentoso grupo de complementa??o A, associada a muta??es em XPA, al?m da s?ndrome de Cockayne, ocasionada por muta??es no gene CSB. Nesse contexto, c?lulas deficientes em XPA (XP12RO) ou CSB (CS1AN) foram submetidas ao estresse oxidativo com per?xido de hidrog?nio (H2O2) e apresentaram um perfil de sensibilidade ao agente, indicando que a aus?ncia dessas prote?nas sensibilizou as linhagens a essa condi??o. A an?lise do transcriptoma de c?lulas XP12RO indicou a diminui??o na express?o de genes com papel na resposta ao dano no DNA e que promovem a sobreviv?ncia celular em resposta ao estresse oxidativo. Nesse cen?rio, os resultados indicaram que XPA pode atuar na regula??o da express?o de genes essenciais ? resposta ao dano no DNA e na sobreviv?ncia ao estresse oxidativo (EGR1, GADD45A, GADD45B e XPC). Por outro lado, a an?lise do transcriptoma de c?lulas CS1AN indicaram a diminui??o na express?o de genes-chave nos processos biol?gicos como transcri??o, processamento de mRNA, prote?lise via ubiquitina-proteassoma ou respira??o celular, indicando um poss?vel papel central da prote?na CSB na regula??o desses processos, em resposta ao estresse oxidativo. Al?m disso, dado o fen?tipo de neurodegenera??o associada a s?ndrome de Cockayne, c?lulas progenitoras neurais (NPCs) e neur?nios derivados de c?lulas-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) deficientes em CSB foram utilizados como modelos de estudo de altera??es neuronais in vitro, de modo que os resultados indicaram que assim como observado nos fibroblastos, c?lulas NPCs deficientes em CSB tamb?m apresentaram sensibilidade a agentes oxidantes. Ainda, os resultados mostraram que assim como observado no transcriptoma de fibroblastos CS1AN, dada a diminui??o na express?o de genes com papel na respira??o celular, as an?lises do consumo de oxig?nio em neur?nios deficientes em CSB indicaram uma poss?vel disfun??o mitocondrial, caracterizada pelo decr?scimo na taxa de consumo de oxig?nio basal e pela diminui??o das capacidades respirat?rias m?xima ou de reserva dessas c?lulas, sugerindo o papel de CSB no metabolismo mitocondrial em ambos os modelos celulares utilizados neste estudo. / In oxidative stress response, the base excision repair (BER) is considered the major pathway for repair of oxidative lesions. However, an increasing number of studies have indicated the role of nucleotide excision (NER) in the repair of these lesions. In addition, some NER factors had functions beyond the role in repair already described and it is important to search for new molecular functions that can be associated to the classical phenotypes of the syndromes caused by mutations in NER genes: Xeroderma pigmentosum complementation group A, caused by mutations in XPA and Cockayne syndrome, caused by mutations in CSB. In this context, XPA (XP12RO) or CSB (CS1AN) deficient cells were submitted to oxidative stress induced by Hydrogen peroxide (H2O2) and the results indicated that both cell lines showed sensitivity to this agent. Furthermore, the transcriptome of XP12RO cells revealed the downregulation of genes that play a role in DNA damage response and promote cell survival in response to oxidative stress. In this scenario, the results indicated that XPA regulates the expression of genes that play a key role in DNA damage response and promote survival in response to stress (EGR1, GADD45A, GADD45B and XPC). On the other hand, the transcriptome analysis of CS1AN cells showed the downregulation of genes that play a key role in biological processes such as transcription, mRNA processing, protein degradation by the ubiquitin?proteasome pathway proteolysis or cellular respiration, indicating a possible role for CSB protein in the regulation of these processes, in response to oxidative stress. In adittion, given the neurodegeneration phenotype associated to Cockayne syndrome, neural progenitor cells (NPCs) and neurons derived from CSB deficient induced pluripotent stem cells (iPSCs) were used as cellular models to analyse neuronal changes in vitro. The results showed that, as observed in fibroblasts CS1AN, NPCs also presented sensitivity to oxidizing agents. Furthermore, as indicated in the transcriptome data from CS1AN fibroblasts, given the downregulation of genes that play a pivotal role in cellular respiration, the analysis of oxygen consumption rates in CSB deficient neurons also indicated a mitochondrial dysfunction characterized by the decrease in oxygen consumption basal rate and a lower maximum respiratory and reserve capacities, suggesting that the lack of functional CSB leads to a mitochondrial dysfunction in both cellular models used in this study. / 2017-12-09

Hintergrund: Das Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziale-Syndrom (BWCFF-S) gehört mit einer Prävalenz von 1:1.000.000 zu den sehr seltenen genetischen Krankheiten und wird durch Missense-Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1, die die zytoplasmatischen Aktin-Isoformen βCYA und γCYA kodieren, verursacht. Neben multiplen fazialen Dysmorphien und Skelettfehlbildungen weisen bis zu 70 % der Patient*innen kortikale Malformationen wie Mikrozephalie und Lissenzephalie auf, deren ursächlichen Pathomechanismen bisher noch nicht erforscht wurden. Ebenso wenig ist über das Expressionsmuster von βCYA und γCYA im humanen Gehirn während der embryonalen Entwicklung bekannt. Die Generierung von zerebralen Organoiden durch Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPS-Zellen), die aus primären Zellen von Patient*innen reprogrammiert werden können, eröffnet neue Möglichkeiten, die Neurogenese und Kortikogenese zu studieren sowie zelluläre Krankheitsmodelle zu entwickeln. Material und Methoden: Das Expressionsmuster von βCYA und γCYA wurde mittels Immunfluoreszenz in humanem fetalem Gehirngewebe sowie zerebralen Organoiden charakterisiert. Aus den iPS-Zelllinien der BWCFF-S-Patientinnen mit Mutationen in jeweils einem Aktin-Gen (ACTB p.Thr120Ile und ACTG1 p.Thr203Met) sowie gesunden Kontrollen wurden unter der Verwendung von zwei Protokollen nach gerichteter und ungerichteter Differenzierung zerebrale Organoide generiert und diese charakterisiert. Mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems wurden die gleichen Mutationen in ACTB und ACTG1 in iPS-Zellen der Kontroll-Zelllinien CRTDi011-A und SC102A-1 editiert. Zerebrale Organoide, die nach dem ungerichteten Protokoll differenziert wurden, wurden durch Immunfluoreszenz- und TEM-Analysen hinsichtlich ihrer Zytoarchitektur, Zelltypen und Aktin-Verteilung untersucht. Außerdem wurden Apoptose, Proliferation und Ausrichtung der Zellteilungsebenen der apikalen Progenitorzellen analysiert. Unter Verwendung der RNA-Einzelzell-Sequenzierung wurden die Zellpopulationen von zerebralen BWCFF-S- und Kontroll-Organoiden an zwei unterschiedlichen Kultivierungs-Zeitpunkten analysiert. Zudem wurden Kontroll-iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) differenziert, um die intrazelluläre Lokalisierung der Aktin-Isoformen mit Immunfluoreszenz-Analysen zu bestimmen. Unter Durchführung von Migrationsassays mit Neurospäroiden und zerebralen Organoiden wurden die Migrationseigenschaften der neuralen BWCFF-S-Zellen untersucht. Ergebnisse: In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster der Aktin-Isoformen βCYA und γCYA im humanen fetalen Gewebe, in zerebralen Organoiden sowie in NPCs und Neuronen analysiert. Im humanen fetalen Gewebe und in den zerebralen Organoiden zeigte sich ein überlappendes Expressionsmuster von beiden Isoformen in allen Schichten des Neokortex. Im Gegensatz dazu wiesen Immunfluoreszenz-Färbungen in kultivierten NPCs und Neuronen eine Isoform-spezifische Lokalisierung von βCYA und γCYA auf, mit einer Anreicherung von βCYA im Zellkortex und in den Zellfortsätzen der NPCs, wohingegen γCYA im Zytosol angereichert war. In Neuronen wurde eine stärkere Lokalisierung von βCYA im Wachstumskegel und von γCYA in den Neuriten festgestellt. Zudem wurde die Kultur zerebraler Organoide für die Modellierung des BWCFF-S erfolgreich etabliert. BWCFF-S-Organoide waren im Vergleich zur Kontrolle in ihrer Gesamtgröße signifikant reduziert und zeigten auch kleinere ventrikulären Zonen (VZs) in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Als Ursache für diese Größenunterschiede konnte die veränderte Ausrichtung der Teilungsebene der apikalen Progenitorzellen (APs) in der Anaphase von vertikal zu horizontal und damit der Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung festgestellt werden, im Zusammenspiel mit einer abnormalen Anreicherung von Mikrotubuli an der ventrikulären Oberfläche in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung der zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoide zeigte eine Veränderung der Zellpopulation mit einer reduzierten Anzahl von radialen Gliazellen (RGs) und Neuronen in den BWCFF-S-Organoiden. Die BWCFF-S-ähnlichen Organoide mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile, die durch Gen-Editierung der Kontroll-Zelllinie CRTDi011-A generiert wurden, zeigten nahezu in allen Analysen vergleichbare Ergebnisse wie die Patientinnen-eigenen BWCFF-S-Organoide mit derselben Mutation und belegten somit, dass sich durch Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems isogene Kontrollen herstellen lassen. Durch Migrationsassays mit Neurosphäroiden und Organoiden konnte eine gravierend veränderte Migration der neuralen BWCFF-S-Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt werden. Schlussfolgerung: Die Modellierung des BWCFF-S in den zerebralen Organoiden entschlüsselte den zellulären Pathomechanismus der mikrozephalen kortikalen Malformation. Die Veränderung der Ausrichtung der mitotischen Spindel in den APs und dem dadurch entstehenden Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung führt zu einer Reduktion des Progenitorzellpools und einer verfrühten Neurogenese. Die verringerte Anzahl der Progenitorzellen in der VZ der zerebralen Organoide spiegelt sich in der verminderten Größe der VZs wider. Beide BWCFF-S-assoziierten Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1 führten zu einer veränderten Ausrichtung der Teilungsebene in den APs. Die deutliche Einschränkung der neuralen Migration wurde jedoch nur bei Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt, was einen ersten Hinweis auf die Isoform-spezifische Funktion der beiden Aktinproteine liefert.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V Abbildungsverzeichnis X Tabellenverzeichnis XIII 1. Einleitung 1 1.1. Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziales-Syndrom 1 1.1.1. Das klinische Bild und genetische Ursachen 1 1.1.2. Neurologische Symptome und kortikale Malformationen beim BWCFF-S 3 1.2. Aktin 5 1.2.1. Die sechs Aktin-Isoformen 5 1.2.2. Das Aktin-Zytoskelett 5 1.2.3. Die Funktionen des Aktin-Zytoskeletts 8 1.2.4. Das Aktin-Zytoskelett im zentralen Nervensystem (ZNS) 10 1.3. Neuro- und Kortikogenese des humanen Gehirns 12 1.4. Zerebrale Organoide als Modellsysteme für neurologische Entwicklungsstörungen 15 1.5. Ziele dieser Arbeit 20 2. Material 21 2.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien 21 2.2. Chemikalien und Kits 23 2.3. Lösungen für die Molekularbiologie 25 2.4. Medien für die Zellkultur 25 2.5. Puffer und Lösungen für Immunfluoreszenz-Analysen 27 2.6. Primer 28 2.7. Guide RNAs (gRNAs), Templates und Cas9 28 2.8. Primäre Antikörper 29 2.9. Sekundäre Antikörper und DNA-Fluoreszenzfarbstoff 30 2.10. Zelllinien 30 2.11. Humanes fetales Gehirngewebe 32 2.12. Software 33 3. Methoden 34 3.1. Molekularbiologische Methoden 34 3.1.1. DNA-Isolierung 34 3.1.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 34 3.1.3. Gelelektrophorese 35 3.1.4. Aufreinigung der PCR-Produkte 35 3.1.5. Sanger-Sequenzierung 36 3.2. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 36 3.2.1. Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in iPS-Zellen 36 3.2.2. Kultivierung der iPS-Zellen 37 3.2.3. Gen-Editierung der iPS-Zellen mit CRISPR/Cas9 37 3.3. Differenzierung von iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neurone 39 3.3.1. Kultivierung von Neuronen im XonaChip® 39 3.4. Differenzierung von iPS-Zellen in Vorderhirn-Organoide (forebrain organoids) 40 3.5. Differenzierung von iPS-Zellen in zerebrale Organoide (whole brain organoids) 42 3.6. Migrationsassay mit Neurosphäroiden 43 3.7. Migrationsassay mit zerebralen Organoiden (radiale Migration) 44 3.8. Immunfluoreszenz-Analysen 44 3.8.1. Färbeprotokoll für βCYA und γCYA in Einzelzellen, Organoiden und humanem fetalem Gewebe 45 3.8.2. Protokoll für Immunfluoreszenz-Färbungen mit Antigen-Demaskierung durch Sieden 45 3.9. Mikroskopie 46 3.10. Bildanalyse und Datenerhebung 46 3.10.1. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen für die Analyse der Verteilung von βCYA und γCYA in Einzelzellen, zerebralen Organoiden und humanem fetalen Gehirngewebe 46 3.10.2. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen von Einzelzellen und zerebralen Organoide 47 3.10.3. Quantifizierungen verschiedener Größen der zerebralen Organoide 47 3.10.4. Bildbearbeitung der Aufnahmen der zerebralen Organoide nach dem Migrationsassay 49 3.11. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) 49 3.12. RNA-Einzelzell-Sequenzierung von zerebralen Organoiden 50 3.13. Analyse der RNA-Einzelzell-Sequenzierdaten der zerebralen Organoide 50 3.14. Statistik 51 4. Ergebnisse 53 4.1. Bestätigung der pathogenen Aktin-Varianten in den Patientinnen-spezifischen iPS- und editierten iPS-Zelllinien 53 4.2. Die beiden Aktin-Isoformen βCYA und γCYA zeigen ein überlappendes Expressionsmuster im humanen fetalen Gewebe des Neokortex 55 4.3. Isoform-spezifische intrazelluläre Anreicherung von βCYA und γCYA in neuralen Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neuronen 58 4.4. Gehirn-Organoide als Krankheitsmodell für die BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 62 4.4.1. Das Vorderhirn-Protokoll konnte nicht reproduziert werden 62 4.4.2. Differenzierung von Kontroll- und BWCFF-S-iPS-Zelllinien in zerebrale Organoide nach dem Lancaster-Protokoll und erfolgreiche Etablierung des Organoidmodells für Analysen des zellulären Pathomechanismus des BWCFF-S 63 4.5. Zerebrale BWCFF-S-Organoide rekapitulieren die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 64 4.5.1. Die Analyse der Lokalisierung von βCYA und γCYA zeigt keine Unterschiede zwischen zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoiden und ist ähnlich der Verteilung im humanen fetalen Neokortex 67 4.5.2. Zerebrale BWCFF-S-Organoide sind signifikant kleiner im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 70 4.5.3. BWCFF-S-Organoide zeigen eine signifikant verminderte Größe der Ventrikel-ähnlichen Strukturen mit reduzierter Anzahl der Progenitorzellen 75 4.5.4. BWCFF-S-Organoide zeigen keine Unterschiede in Proliferation und Apoptose im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 78 4.5.5. Apikale Progenitorzellen (APs) von BWCFF-S-Organoiden teilen sich vermehrt horizontal statt vertikal 81 4.5.6. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine Veränderung in der Ausrichtung der Zellteilungsebene im Vergleich zur Kontrolle 82 4.5.7. BWCFF-S-Organoide zeigen eine veränderte Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit apikaler Anreicherung von Mikrotubuli in Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)- und Immunfluoreszenz-Analysen 85 4.5.8. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine abnormale Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit einer Anreicherung von Mikrotubuli an der apikalen Oberfläche der VZ 89 4.6. BWCFF-S-NPCs zeigen ein abnormales Migrationsver-halten im Neurosphäroid-Migrationsassay 91 4.7. Zerebrale BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile zeigen kaum Migration von neuralen Zellen 93 4.8. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung zeigt Veränderungen in den Zellpopulationen von BWCFF-S-Organoiden und eine reduzierte Anzahl der RGs und Neurone 96 5. Diskussion 106 5.1. βCYA und γCYA zeigen in Gewebeschnitten des humanen fetalen Neokortex sowie zerebralen Organoiden ein überlappendes Expressionsprofil, weisen aber intrazellulär eine Isoform-spezifische Anreicherung auf 107 5.2. Zerebrale Organoide eignen sich für die Modellierung der mit dem BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 108 5.3. Die asymmetrische, horizontale Zellteilung von APs in BWCFF-S-Organoiden führt zu einer vorzeitigen Neurogenese und erklärt die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 110 5.4. Die Änderung der Orientierung der mitotischen Spindel in den apikalen Progenitorzellen weist auf eine gestörte Interaktion zwischen Mikrotubuli und dem Aktin-Zytoskelett hin 113 5.5. Die BWCFF-S-Organoide zeigen keine grundlegenden strukturellen Veränderungen der AJ 114 5.6. Editierte BWCFF-S-ähnliche Organoide mit cr. ACTB p.Thr120Ile zeigen eine ähnliche Pathologie wie BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile 115 5.7. Limitationen des zerebralen Organoidmodells müssen bei der Krankheitsmodellierung berücksichtig werden 117 5.8. Die BWCFF-S-Mutation ACTB p.Thr120Ile führt zu Migrationsstörungen von neuralen Zellen 119 5.9. BWCFF-S-Organoide haben eine reduzierte Anzahl von RGs und Neuronen 120 6. Ausblick 123 7. Zusammenfassung 125 8. Summary 128 9. Literaturverzeichnis 130 10. Anhang 142 10.1. Charakterisierung der reprogrammierten und editierten iPS-Zellklone 142 10.2. Auswertungsstrategie für die intrazelluläre Verteilung von βCYA und γCYA in NPCs und Neuronen 146 10.3. Werte der Winkel der Zellteilungsebenen der APs in der Anaphase 146 10.4. Immunfluoreszenz-Analysen des Adhäsions-Verbindungs-gürtels 148 10.5. Zusätzliche Daten der RNA-Einzelzell-Sequenzierung 149 11. Danksagung i 12. Veröffentlichungen iv 13. Erklärung zum Antrag auf Eröffnung des Promotionsverfahrens vi 14. Eidesstattliche Versicherung vii