In dieser Arbeit wurde die Methode der breitbandigen fs-zeitaufgelösten Fluoreszenzaufkonversionsspektroskopie (FLUPS) weiterentwickelt und vollständig theoretisch beschrieben, was anhand des Vergleichs von vorhergesagten und experimentell bestimmten photometrischen Korrekturfunktionen gezeigt werden konnte. Die Methode wurde verwendet, um lokale Fluoreszenzspektren von solvatochromen Sonden in der Nähe bestimmter Matrizes in wässrigen Lösungen zu messen. Aus der Dynamik der Stokes-Verschiebung konnte die Solvatations- bzw. Umgebungsdynamik bestimmt werden. Es wurden mittlere Solvatationszeiten τsolv von 0.57±0.06 für reines Wasser, 2.8±0.2 ps für DNA, 480±30 ps für Phospholipid-Kopfgruppen, 0.71±0.03 ps für ein Peptid (α-Helix) und 0.76±0.03 ps für eine t-Butyl-Gruppe erhalten. Hervorzuheben sind dabei die überraschend schnelle Relaxation nahe des Peptids und die sehr langsame Dynamik nahe der Lipid-Kopfgruppen, welche über 5 Größenordnungen der Zeit beobachtet wurde. Um den Einfluss einer hydrophoben Gruppe auf die Solvatationsdynamik erstmals zu aufzuzeigen, wurden präzise Messungen bei verschiedenen Temperaturen vor-genommen. Zuordnungen dieser Dynamiken zu molekularen Prozessen konnten durch Vergleiche zu MD-Simulationen durchgeführt werden. / The method of broadband fs time-resolved fluorescence upconversion spectroscopy (FLUPS) was further developed and completely theoretically described in this work. This was shown by comparing predicted and measured photometric correction functions. This method was used to obtain local fluorescence spectra of solvatochromic dyes near certain matrices in aqueous solution. From the dynamics of the Stokes-Shift the solvation or environmental dynamics respectively were obtained. Average solvation times τsolv of 0.57±0.06 for bulk water, 2.8±0.2 ps for DNA, 480±30 ps for phospholipid head groups, 0.71±0.03 ps for a peptide (α-helix) and 0.76±0.03 ps for a t-butyl group were obtained. Emphasized are the surprisingly fast dynamics near the peptide and the slow dynamics of the lipid head group region. The latter was observed over 5 orders of magnitude in time. To distinguish the influence a hydrophobic group for the first time, precise measurements at different temperatures were performed. Molecular processes were assigned to the obtained dynamics by comparisons to MD studies.

Unter den Techniken der chemischen Proteomik hat Capture Compound – Massenspektrometrie (CCMS) den Vorteil, Interaktionen von Molekülen mit geringer Affinität zueinander effektiv untersuchen zu können. CCMS beruht auf kleinen molekularen Sonden (Capture Compounds, CCs), die aus drei funktionalen Bestandteilen bestehen: die Selektivitätsfunktion, ist ein kleines Molekül, das mit einem Zielprotein eine schwache Wechselwirkung eingeht. Die zweite Funktionalität erlaubt kovalente Anhaftung der molekularen Sonde an Proteine. Der dritte Anteil erlaubt Detektion mit sehr guten Sensitivität; allerdings ist die Quantifizierung weiterhin ein Schwachpunkt dieser Technik. Ziel dieses Projektes ist, eine in CCMS verwendbare Quantifizierungsmethode zu entwickeln. Heutzutage gibt es zahlreiche MS-basierte Quantifizierungsstrategien; unsere beruht auf der Einführung von Lanthanoid-haltigen Labels – Metal Coded Affinity Tagging (MeCAT). In dieser Arbeit wurde erstmalig die erfolgreiche Verwendung mit Metall- Markern chemoproteomischer Sonden (CCs) zur Detektion und absoluten Quantifizierung von Zielproteinen mit schwacher Wechselwirkung etabliert. Mit den Experimenten an isolierten Enzymen und an lebenden Zellen wurde nachgewiesen, dass Metall-Marker keinen negativen Einfluss auf andere funktionelle Teile chemoproteomischer Sonden haben. CCs, die mit Lanthanoid-Chelaten funktionalisiert sind, zeigen ähnliche Affinität zu ihren Zielproteinen wie die Referenz-Sonden. Zudem erlauben Metall-Marker, die für diese Art molekularer Sonden verwendet werden, die Entwicklung einer element-basierten Technik zur Bilderzeugung. Der herausragende Vorteil der Metall-funktionalisierten CCs kombiniert mit ICP-MS ist, dass diese eine absolute Quantifizierung der Ausbeute der Quervernetzungen ermöglichen. / Capture compound mass spectrometry (CCMS) is a chemical proteomics technique that has the advantage of addressing low abundant target proteins in lysates as well as in living cells. The CCMS is based on small molecule probes (capture compounds) that consist of three functionalities: a small molecule (quite often it is a drug), which interacts with the target protein; the moiety that allows covalent attachment of the molecular probe to the protein; the one that allows detection. The detection moiety utilized for CCMS can offer high sensitivity; however, the challenge of absolute quantification is still a bottleneck of this technique. Metal Coded Affinity Tagging (MeCAT) is a quantitative approach based on the chemical labeling with lanthanide; it allows obtaining both the structural and quantitative information. In this work for the first time the successful utilization of chemoproteomic probes functionalized with a metal tag for the detection and absolute quantification of target proteins was established. With the experiments both on isolated enzymes and living cells it was determined that MeCAT does not negatively influence other functional parts of the probes; therefore, capture compounds functionalized with lanthanide chelates demonstrate similar affinity to the target as the reference probes. Moreover, metal tags utilized for this type of molecular probes can offer a promising elemental imaging technique. However, to achieve the sufficient resolution multiple metal tags per molecular probe are needed. The striking advantage of the approach of utilization metal functionalized capture compound combined with ICP-MS detection is that it allows absolute quantification of crosslink yield, what cannot be performed with other detection methods applied for this technology.

In dieser Arbeit konnte ein humaner IgG1-Antikörper mittels verschiedener massenspektrometrischer Methoden erfolgreich untersucht und charakterisiert werden. Neben der Bestimmung der molekularen Massen des betrachteten Anti-Interleukin-8-Antikörpers und dessen Fragmenten konnte auch die Bildung von Oligomeren untersucht werden. Es wurden verschiedene Oligomere, bis hin zum Pentamer, massenspektrometrisch gemessen und es konnten auch Erkenntnisse gewonnen werden, dass Konzentrationseffekte maßgeblich zur Oligomerbildung bei diesem Antikörper beitragen. Die Antikörperglykosylierung, eine sehr prominente und hoch diverse Modifikation, wurde bei diesem Antikörper ebenfalls gefunden und neben dem intakten Antikörper auch in dessen Fragmenten und im Dimer gemessen. Neben dieser natürlichen Modifikation wurden auch Derivatisierungen des Antikörpers analysiert, dabei wurden unterschiedliche Metallmarkierungen analysiert. Es konnten verschiedene Markierungsgrade bestimmt werden, auch wenn diese nebeneinander als Mischung vorlagen. Der Nachweis, dass der Antikörper auch weiterhin intakt und bindungsfähig ist, konnte erbracht werden. Die Bildung von Komplexen des Antikörpers mit verschiedenen Proteinen konnte ebenfalls mittels Massenspektrometrie gezeigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es möglich war, eine Quantifizierungsstrategie für Antikörper zu entwickeln. Mit dieser können absolute Quantifizierungen durchgeführt werden, während diese gleichzeitig unabhängig von Art und Struktur des einzusetzenden Standards sind. Damit ist es möglich, die Probleme des Bradford-Assays zu umgehen. Des Weiteren sind nur minimale Kenntnisse über den zu analysierenden Antikörper notwendig, sodass dieses Verfahren auch hervorragend auf bisher nicht charakterisierte Antikörper angewendet werden kann. / The aim of this work is the characterization of an antibody. The used human IgG1-antibody was successfully investigated with various mass spectrometric methods. In addition to the determination of the molecular masses of the analyzed Anti-Interleukin-8 antibody itself and its fragments the formation of oligomers was examined. Different oligomers up to pentamers could be mass spectromatrically measured. Resulting from this, it was possible to find that concentration effects are the main factors for the oligomer formation of this particular antibody. The glycosylation of antibodies, a prominent and high diverse modification, was also found in this antibody and was measured in the intact molecule, in its fragments and also the dimer. Next to this native modification, also a derivatization of the antibody was investigated. Different metal containing modifications were analyzed. Thereby it was possible to determine various tagging degrees, even in a mixture of these metal containing modifications. The important question, whether the tagged antibody is still active and capable for binding, can be answered positively. Furthermore the formation of antibody-protein complexes could be shown via mass spectrometry. It was also successful to develop a quantification strategy for this antibody. With this an absolute quantification was possible, which was independent from the type and the structure of the used standard. With this method it is possible to overcome the problems of the Bradford assay. In addition to this only very little information about the antibody is needed for the quantification, which allows to use this method for non characterized antibodies.

In der hier vorgestellten Arbeit werden neuartige Festkörper-NMR (Nuclear Magnetic Resonance) Experimente vorgestellt, die eine direkte Detektion von Protonen einbeziehen. Die Technik basiert auf einer weitgehenden Verdünnung der Protonen durch Deuteronen in vollständig isotopenmarkierten, rekombinant exprimierten Proteinen und ermöglicht Festkörper-NMR mit sehr schmalen Linienbreiten aller standardmäßig erfassbaren Kerne (Protonen, Stickstoff, Kohlenstoff) ohne Hochleistungsentkopplung. Zusätzlich werden Methoden für ein besonders hohes Signal-zu-Rausch durch Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE) entwickelt. Die so präparierten Proteine erweisen sich tauglich für eine stark verbesserte NMR-Charakterisierung durch eine Vielzahl neuer Struktur- und Zuordnungsexperimente, in denen Techniken aus Festkörper- und Lösungs-NMR vereint werden. Dabei können hier erstmals auch Bereiche im Protein mit einbezogen werden, die langsame Dynamik vollziehen. Die Experimente finden Anwendung auf die SH3-Domäne von alpha-Spektrin, das Alzheimer-Peptid Abeta1-40 und das Membranprotein Omp G. / In this work, novel solid-state NMR (Nuclear Magnetic Resonance) experiments are presented that imply direct detection of protons. The technique is based on extensive dilution of protons with deuterons in uniformly labelled, recombinantly expressed proteins and allows for solid-state NMR providing very narrow lines of all commonly accessible nuclei (protons, nitrogen, carbon) without high-power decoupling. In addition, methods are developed that yield a particularly high signal-to-noise through Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE). The accordingly prepared proteins are shown to be applicable for a significantly improved NMR-characterization by manifold new experiments for assignment and structure elucidation, in which techniques from solid-state and solution NMR are united. For the first time, also those regions in a protein can be accessed that undergo slow dynamics. The experiments are employed on the SH3-domain of alpha-spectrin, Alzheimer’s peptide Abeta1‑40, and the membrane protein Omp G.

Im Unterschied zu anderen RNA Viren vervielfältigen Influenzaviren ihr Genom im Zellkern infizierter Zellen. Für die erfolgreiche Vermehrung müssen neu gebildete Genomsegmente (virale Ribonukleoproteine, vRNPs) wieder aus dem Zellkern exportiert werden. Dafür nutzt Influenza einen Exportkomplex, der sich aus dem viralen Matrixprotein 1 (M1) und Nukleusexportprotein (NEP) zusammensetzt und vRNPs unter Verwendung des zellulären Exportproteins CRM1 aus dem Zellkern transportiert. Zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit dem Exportkomplex sind noch unbeantwortet: Wie viele Exportkomplexe werden pro vRNP gebunden? Wie interagieren die Proteine innerhalb des Komplexes mit vRNPs? Wie wird die zeitliche und räumliche Präsenz der beteiligten Proteine im Verlauf der Infektion reguliert? Um zu einem besseren Verständnis beizutragen, wurden in der vorliegenden Arbeit Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie und molecular brightness-Analysen genutzt, um die Oligomerisierung der beteiligten Exportkomplexproteine zu quantifizieren. Werden Fluoreszenzproteine für solche Untersuchungen verwendet, treten häufig nicht-fluoreszente Zustände auf, die die Bestimmung des Oligomerzustandes beeinflussen. Daher wurde in dieser Arbeit ein einfaches Korrekturmodel vorgestellt, das die Population an nicht-fluoreszenten Zuständen berücksichtigt, und somit die genaue Bestimmung des Oligomerzustandes erlaubt. Dadurch konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass NEP Homodimere im Zytoplasma ausbildet, wohingegen eine um das 2,5-fach geringere Homodimerpopulation im Zellkern vorhanden war. Durch die Integration von Informationen über den Lokalisationsphänotyp und den Oligomerzustand von NEP sowie mehrerer Mutanten, konnte ein Modell abgeleitet werden, dass den Regulationsmechanismus beschreibt: Durch vorrübergehendes Maskieren und Demaskieren der beiden Nukleusexportsignale wird der Transport von NEP reguliert. Die Dimerisierung im Zytoplasma und Monomerisierung im Zellkern unterstützen diesen Mechanismus. / Influenza viruses are the causative agent of severe epidemics and pandemics, causing up to 650,000 deaths annually. Unlike other RNA viruses, Influenza viruses replicate their genome within the nucleus of cells. Hence, progeny genome segments - viral ribonucleoproteins (vRNPs) - need to be exported from the nucleus to complete the replication cycle. To fulfil this task, Influenza relies on a viral nuclear export complex built from M1 and NEP, that mediates export by hijacking the cellular CRM1-dependent export machinery. In this context a number of questions remain unanswered, such as how many export complexes bind to a single vRNP, what is the exact interaction pattern of vRNPs with export complex proteins, and how translocation of nuclear export relevant proteins such as NEP are regulated and optimally timed during the course of infection? In the present study, the potential of NEP to form homo-dimers in situ was shown for the first time by applying fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) and molecular brightness analysis, that allows determination of protein oligomerization in living cells. However, when using fluorescent proteins in FFS studies non-fluorescent states are observed, which strongly affect molecular brightness analysis. Therefore, in this study a simple correction model was described, taking into account quantified non-fluorescent state fractions, to finally allow accurate and unbiased determination of oligomerization. This way it was shown, that NEP forms homo-dimers within the cytoplasm of cells, whereas a 2.5-fold lower homo-dimer population was observed in the nucleus. Combining the subcellular localization dependent oligomeric state of NEP and several NEP mutants with their localization phenotypes, a regulation mechanism was proposed in which the translocation of NEP is regulated by transient masking and unmasking of its two NESs, which is supported by dimerization in the cytoplasm and monomerization in the nucleus of cells, respectively.

Diese Dissertation konzentriert sich auf die Untersuchung multivalenter Wechselwirkungen zwischen Hämagglutinin (HA) sowie Neuraminidase (NA) zweier Stämme des Influenzavirus (H1N1 und H3N2) und dem zellulären Liganden Sialinsäure (SA) unter Verwendung von Rasterkraftmikroskopie und Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS). Bindungskräfte sowie Dissoziations- und Assoziationskinetiken, zusammen mit den intermolekularen Potentiallandschaften wurden, nach bestem Wissen erstmalig, auf Einzelmolekülebene mittels SMFS quantifiziert. Zu diesem Zweck wurden mono- und multivalente SA-Liganden (SAPEGLA und dPGSA) eingesetzt. Abweichungen der experimentellen Kraftspektren vom klassischen Kramers-Bell-Evans-Modell vorhergesagten Verhalten wurden durch das Friddle-Noy-De Yoreo-Model berücksichtigt. NA beider Virusstämme zeigte trotz ähnlicher Bindungskräfte eine stabilere Bindung mit SA als HA und dissoziierte 3 – 7 mal langsamer. Es wird vermutet, dass die höhere Stabilität die geringere Oberflächendichte von NA auf der Virushülle im Vergleich zu HA ausgleicht. Die Bindungskräfte eines SAPEGLA-Clusters nehmen mit der Anzahl der Bindungen und die Dissoziationskinetik folgt dem theoretisch vorhergesagten Trend. Die Dissoziationsrate von NA ist etwa 6-mal höher ist als ihre katalytische Rate, weshalb Mehrfachbindungen zur Spaltung von SA erforderlich sind. Die Dissoziationsrate von N1 in der gleichen Größenordnung wie die von H3 und es wird vermutet, dass derartige Ähnlichkeiten die Übertragbarkeit des Virus begünstigen. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die thermische Stabilität von HA-dPGSA höher ist als von HA-SAPEGLA und im Bereich von 3 - 4 Einzelbindungen liegt, was für NA-dPGSA nicht beobachtet werden konnte. Daher bindet dPGSA spezifisch und kooperativ multivalent an HA. Kompetitive Bindungstests zeigen, dass SMFS zum Screening von antiviralen Inhibitoren verwendet werden und Zugang zu deren Design auf Einzelmolekülebene liefern könnte. / This thesis focuses on studying multivalent interactions between influenza virus hemagglutinin (HA) as well as neuraminidase (NA) of two viral strains (H1N1 and H3N2) and the cellular ligand sialic acid (SA) by using scanning force microscopy and single molecule force spectroscopy (SMFS). Unbinding forces as well as dissociation and association kinetics together with the free energy landscapes were, to the best knowledge for the first time, individually quantified on the single molecule level using SMFS. To this extent, designed synthetic monovalent (SAPEGLA) and multivalent (dPGSA) SA displaying ligands were employed. Surprisingly, the experimental force spectra did not show the log-linear trend predicted by the classical Kramers-Bell-Evans model, but rather follow the more recent Friddle-Noy-De Yoreo model. NA of both viral strains forms a more stable bond with SA than HA, and dissociates 3 to 7 times slower. It is reasoned that the higher stability compensates for the lesser amount of NA compared to HA that is typically found on the viral envelope. The unbinding forces of the cluster of SAPEGLA increased gradually with the number of bonds in the cluster and the dissociation kinetics follow the theoretically predicted trend. The dissociation rate of NA was found to be about 6 times higher than its catalytic rate, indicating that multiple bonds are needed for cleavage of SA. The dissociation rate of N1 is on the same order as that of H3, suggesting that these similarities between the two strains favor transmissibility. The thermal stability of the HA-dPGSA bond is higher than the HA-SAPEGLA reaching that of three to four single bonds, proving specificity and cooperativity. Such an enhancement could not be observed for the binding of NA. This thesis also shows that SMFS could be used as a tool to screen antiviral inhibitors in competitive binding assays, which may contribute insight into the design of antiviral inhibitors on the single molecule level.

Der erste Teil der Arbeit beschreibt die Etablierung einer modifizierten Form des klassichen SILAC-Verfahrens, das in der quantitativen Massenspektrometrie zur Bestimmung von relativen Änderungen in Proteinmengen benutzt wird. Im sog. „pulsed SILAC (pSILAC)“ Verfahren werden Zellen im Zuge einer differentiellen Behandlung in Kulturmedien transferiert, die unterschiedlich Isotop-markierte Aminosäuren enthalten. Da hier die Quantifizierung auf dem Verhältnis der neusynthetisierten Proteinmengen beruht, können gezielt Unterschiede in der Proteinproduktion bestimmt werden. Mit Hilfe von pSILAC konnte im zweiten Teil der Arbeit erstmals quantitativ erfasst werden, welchen Einfluss microRNAs auf die Proteinsynthese ausüben. So konnte gezeigt werden, dass sowohl die Überexpression als auch die Repression einzelner microRNAs die Produktion hunderter Proteine beeinflussen kann. Außerdem konnten Genprodukte identifiziert werden, die ausschließlich translational reguliert werden. Die Messung von Proteinneusynthese ermöglichte auch die Bestimmung von Proteinumsatzraten, dargestellt im dritten Teil der Arbeit. Zusammen mit mRNA-Umsatzraten sowie Protein- und mRNA-Mengen bilden sie die Grundlage für eine dynamische Beschreibung zelluärer Genexpression. Durch den gleichzeitigen Einsatz des Nukleosidanalogons 4-Thiouridin (4sU) und von schweren Aminosäuren (SILAC) konnte eine metabolische Markierung neusynthetiserter mRNAs und Proteine in murinen Fibroblasten erreicht und damit eine Berechnung von Protein- und mRNA-Halbwertszeiten und absoluten Mengen für ca. 5,000 Gene ermöglicht werden. Während mRNA- und Proteinenmengen deutlich korrelierten, war zwischen mRNA- und Proteinhalbwertszeiten nur eine äußerste schwache Korrelation zu erkennen. Dennoch stehen mRNA- und Proteinumsatzraten nicht einem willkürlichen Zusammhang zu einander, da bestimmte Kombinationen von mRNA- und Proteinhalbwertszeiten eine Optimierung von Genen hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen erkennen ließen. / The first part of the thesis describes the establishment of a modified version of the classic SILAC approach routinely used in quantitative mass spectrometry (MS) to assay relative changes in protein levels. In the newly-devised approach termed pulsed SILAC (pSILAC) differentially treated cells are transferred to culture medium supplemented with different versions of stable-isotope labeled heavy amino acids. As MS-based relative quantification is exclusively based on the newly-synthesized heavy protein amounts the method enables the detection of differences in protein production resulting from the treatment. The second part of the thesis shows the use of pSILAC to globally quantify the impact of microRNAs onto the proteome. Ectopic over-expression or knock-down of a single microRNA both affected protein production of hundreds of proteins. pSILAC identified several target genes as exclusively translationally regulated as changes in corresponding transcript levels were virtually absent. Measuring newly-synthesized protein amounts with heavy amino acids in a pulsed-labeling fashion has also been used to determine turnover rates of individual proteins, described in the third part of the present work. Along with transcript turnover as well as mRNA and protein levels they are essential for a dynamic description of gene expression. Simultaneous application of the nucleoside analogue 4-thiouridine (4sU) and heavy amino acids (SILAC) to metabolically label newly-produced mRNAs and proteins in mouse fibroblasts resulted in the calculation of mRNA and protein lifetimes and absolute levels for approximately 5,000 genes. While mRNA and protein levels were overall well correlated, a correlation between mRNA and protein half-lives was virtually absent. Yet this seemingly chaotic distribution of mRNA and protein half-lives was highly instructive since specific gene subsets have obviously evolved distinct combinations of half-lives that relate to their biological functions.

Die Strukturen in Lösung dreier unterschiedlich modifizierter DNA Doppelstränge wurden mittels NMR Spektroskopie gelöst. Sie alle besitzen polare Sonden im Zentrum der Helix, welche sensitiv für die nähere Umgebung sind. Ihr Schmelzverhalten wurde mit Hilfe einer neuen Methode charakterisiert, welche komplette Absorptionsspektren in Kombination mit Singularwertzerlegung (SVD) nutzt. Letztere erlaubt die Analyse der Spektren als Ganzes, die notwendig ist um der Blauverschiebung des Sondensignals zu folgen, welche durch die zuvor genannte Sensitivität zur Umgebung verursacht wird. Auf diese Weise kann der Schmelzprozess des Duplex lokal und global beschrieben werden. Die erste Modifikation, 2-Hydroxy-7-Carboxyfluoren (HCF), wurde gegenüber einer abasischen Seite platziert, um sterische Spannungen zu vermeiden. Die NMR Spektroskopie deckte zwei gleichverteilte Konformationen auf, da die Rotation des HCF Chromophors nur durch die Stapelwechselwirkung innerhalb der Helix unterbunden wird. Der zweite Doppelstrang enthält ein über R-Glycerol gebundenes 6-Hydroxychinolinium (6HQ) gegenüber Cytosin. Der Einbau von 6HQ als Mononukleotid einer Glykolnukleinsäure (GNA) ist ein strukturelles Alleinstellungsmerkmal. Bisher sind nur Kristallstrukturen von vollständiger GNA bekannt, daher ist die Struktur in Lösung dieses Doppelstranges von generellem Interesse. Die geringe Größe von R-Glycerol stört das Rückgrat des 6HQ-Stranges, welche eine von der helikalen Achse abweichende Stapelachse für die drei zentralen Basen verursacht. Die letzte Modifikation ist ein künstliches Basenpaar bestehend aus 4-Aminophthalimid (4AP) und 2,4-Diaminopyrimidin (DAP). Anstatt der gewünschten drei Wasserstoffbrücken wurden zwei Strukturen, die entweder eine oder zwei Wasserstoffbrücken beinhalten, beobachtet, welche durch die Verbindung von 4AP zur 2’-Deoxyribofuranose erklärt werden können. / The solution structures of three differently modified DNA double strands were solved by NMR spectroscopy. They all incorporate polarity probes in the center of the helix that are sensitive to the immediate environment. Their melting behavior was characterized by a new method that utilizes complete absorption spectra in combination with Singular Value Decomposition (SVD). The latter allows to analyze the spectra in their entirety, which is required to follow the blue shift of the probe signal that is caused by the aforementioned sensitivity to the environment. In this way the duplex melting process is characterized in local and global terms.The first modification, 2-hydroxy-7-carboxyfluorene (HCF), is placed opposite an abasic site to avoid steric strain. NMR spectroscopy revealed two equally distributed conformations, since rotation of the HCF chromophore is only hindered by stacking interactions inside the helix. The second double strand comprises R-glycerol linked 6-hydroxyquinolinium (6HQ) opposite cytosine. The incorporation of 6HQ as glycol nucleic acid (GNA) mononucleotide is a unique structural feature. Until now, only crystal structures of full GNA backbone duplexes are known, so the solution structure of this double strand is of general interest. The small size of R-glycerol disturbs the backbone of the 6HQ strand, which causes a stacking axis that differs from the helical long axis for the three central bases. The last modification is an artificial base pair made of 4-aminophthalimide (4AP) and 2,4-diaminopyrimidine (DAP). Instead of the desired three hydrogen bonds, two structures containing either a single or two hydrogen bonds are observed that can be explained by the linkage of 4AP to 2’-deoxyribofuranose.

Die Reprogrammierung somatischer Zellen hat sich kürlich als leistungsfähige Technik für die Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) aus terminal differenzierten Zellen bewährt. Trotz der großen Hoffnung, die sie speziell im Bezug auf patientenspezifische Stammzelltherapie darstellt, gibt es viele Hindernisse auf dem Weg zur Anwendung in der Humanmedizin, die sich von niedrigen Effizienzen bei der technischen Umsetzung bis hin zur unerwünschten Integration von Onkogenen in das menschliche Genom erstrecken. Aus diesem Grund ist es unabdingbar, unser Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse und Mechanismen zu vertiefen. Durch neue Datengewinnungsmethoden und stetig wachsende biologische Komplexität hat sich der Denkansatz der Systembiologie in den letzten Jahrzehnten stark etabliert und erfährt eine fortwährende Entwicklung seiner Anwendbarkeit auf komplexe biologische und biochemische Zusammenhänge. Verschiedene mathematische Modellierungsmethoden werden auf den Reprogrammierungsprozess angewendet um Engpässe und mögliche Effizienz-Optimierungen zu erforschen. Es werden topologische Merkmale eines Pluripotenznetzwerkes untersucht, um Unterschiede zu zufällig generierten Netzen und so topologische Einschränkungen des biologisch relevanten Netzwerkes zu finden. Die Optimierung eines Booleschen Modells aus einem selbst kuratierten Netzwerk in Bezug auf Genexpressionsdaten aus Reprogrammierungsexperimenten gewährt tiefgreifende Einblicke in die ersten Schritte und wichtigsten Faktoren des Prozesses. Der Transkriptionsfaktor SP1 spielt hierbei eine wichtige Rolle zur Induktion eines intermediären, transkriptionell inaktiven Zustands. Ein probabilistisches Boole''sches Modell verdeutlicht das Zusammenspiel epigenetischer und transkriptioneller Kontrollprozesse zusammen, um Pluripotenz- und Zelllinien-Entscheidungen in Reprogrammierung und Differenzierung zu treffen. Erklärungen für die geringe Effizienz werden versucht. / Somatic Cell Reprogramming has emerged as a powerful technique for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from terminally differentiated cells in recent years. Although holding great promises for future clinical development, especially in patient specific stem cell therapy, the barriers on the way to a human application are manifold ranging from low technical efficiencies to undesirable integration of oncogenes into the genome. It is thus indispensable to further our understanding of the underlying processes involved in this technique. With the advent of new data acquisition technologies and an ever-growing complexity of biological knowledge, the Systems Biology approach has seen an evolution of its applicability to the elaborate questions and problems of researchers. Using different mathematical modeling approaches the process of somatic cell reprogramming is examined to find out bottlenecks and possible enhancements of its efficiency. I analyze the topological characteristics of a pluripotency network in order to find differences to randomly generated networks and thus deduce constraints of the biologically relevant network. The optimization of a Boolean model from a curated network against early reprogramming gene expression profiles reveals profound insights into the first steps and most important factors of the process. The transcription factor SP1 emerges to play an important role in the induction of an intermediate, transcriptionally inactive state. A probabilistic Boolean network (PBN) illustrates the interplay of transcriptional and epigenetic regulatory processes in order to explain pluripotency and cell lineage decisions in reprogramming and differentiation. Explanations for the low reprogramming efficiencies are tried.

Zahlreiche pathogene „missense“-Mutation, die verhindern, dass Proteine korrekt gefaltet werden, befinden sich in geordneten Regionen von Proteinen. Andere krankheitsrelevante Mutationen befinden sich in ungeordneten Regionen und beeinflussen somit nur begrenzt die Funktionalität, zum Beispiel durch Veränderungen kurzer linearer Sequenzmotive, die Protein-Protein Interaktionen vermitteln. In dieser Arbeit wird ein peptidbasierter Interaktionsscreen präsentiert mit dem sich Veränderungen im Interaktom identifizieren lassen. Synthetische Peptide von wild-typ und zugehörigen mutierten Proteinregionen ermöglichen die gleichzeitige Untersuchung von mehr als hundert Mutationen mittels Massenspektrometrie. Mehr als ein Drittel aller getesteten Mutationen hatten veränderte Interaktionen zur Folge. Darunter befanden sich auch drei Prolin zu Leucin Mutationen in zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen, die zusammen mit dem benachbarten Leucin einem Dileucinmotiv ergeben und dadurch verstärkt mit Clathrin interagieren. Dieses Motiv wurde bereits mit Clathrin-vermittelter Endozytose in Verbindung gebracht. Die hinzugewonnene Endozytose könnte Krankheitsmechanismen erklären, da die Mislokalisation der betroffenen Transmembranproteine zum effektiven Verlust derer Funktion führen würde. Diese Hypothese wurde hier von verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten bezüglich der P485L Mutation im Glukose Transporter-1 (GLUT1), die das GLUT1-Defizit-Syndrom hervorruft, bestätigt. Weitere Evidenz wurde außerdem für die Funktionalität anderer mutationsbedingter Dileucinmotive gewonnen. Die systematische Analyse von pathogenen Mutationen hat gezeigt, dass Dileucinmotive signifikant und spezifisch in ungeordneten zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen überrepräsentiert sind. Dieser Peptidescreen macht das Potenzial unvoreingenommener Analysen zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen deutlich, die von Veränderungen in Protein-Protein Interaktionen hervorgerufen werden. / Many disease-associated missense mutations prevent proteins from folding correctly and lead to loss-of-function. These mutations are often found in ordered regions of proteins. Another class of disease-related missense mutations can be found in disordered regions. These are thought to impair only specific parts of a protein’s functions. Those mutations could modify short linear motifs that mediate protein-protein interactions. Here, we designed a peptide-based interaction screen to identify interactions that are affected by mutations in disordered regions. We used synthetic peptides corresponding to the wild type and mutated protein regions spotted on cellulose membrane to pull-down interaction partners. This setup allows for the screening of more than hundred mutations at a time via mass spectrometry. Here, we focused on mutations implicated in neurological diseases. More than one-third of tested variant pairs show differential interactions. Three disease-related proline to leucine mutations in cytosolic tails of transmembrane proteins lead to gain of a dileucine sequence. Several dileucine-containing peptide motifs are involved in clathrin-mediated endocytosis (CME). Also in the presented screen, the newly created motifs mediate interaction with the CME machinery. This could explain the disease mechanisms since mislocalization of the affected transmembrane proteins would lead to their loss of function. This hypothesis has been corroborated for glucose transporter-1 (GLUT1) P485L, causing GLUT1 deficiency syndrome. We were able to provide functional evidence also for additional gained dileucine motifs. A systematic analysis of pathogenic mutations revealed dileucine motifs to be overrepresented in structurally disordered cytosolic regions of transmembrane proteins. The data gained with the peptide screen highlights the power of differential interactome mapping as a generic approach to unravel disease mechanisms caused by changes in protein-protein interactions.