Metabolism is a subset of chemistry that allows cells to defy thermodynamic equilibrium, a fundamental process that must have been in place from the very beginning of biology. Before evolution produced efficient catalysts in the form of complex protein machinery, short metal binding peptides might have preceded modern metalloproteins. Such prebiotic, metal-binding motifs have been hypothesized to have existed through analyses of extant protein sequences. However, it is unclear how metal-binding motifs might have evolved in the harsh prebiotic environment. Here, we show how certain environments, in particular seawater-like environments rich in divalent cations and especially Mg2+, support the survival of short peptides upon extreme temperatures as high as 150 °C. Moreover, while Mg2+ does not offer the same protection from UV light, peptides are protected from both heat and irradiation when bound to a metal ion. The results suggest that specific environments rich in metal ions may be better suited for the emergence of complex systems in the path toward life. Additionally, the conditional degradation of peptides depending on their ability of binding metals might have enabled a selection mechanism that would favor the survival of metal-binding motifs which resemble the motifs found in modern proteins. These short sequences could have acted as early, simple catalysts able to facilitate a restricted set of chemical reactions, which would shape the emergence and biology of the Last Universal Common Ancestor.

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Many bacteria use inorganic nitrogen and sulfur compounds for energy metabolism. These compounds are often toxic and so bacteria must adapt to survive their deleterious effects. Bacteria use specific proteins in order to metabolise, sense and detoxify these compounds. In this thesis protein interactions with inorganic nitrogen and sulfur compounds are examined at the mechanistic level. Intermediates in the Sox sulfur oxidation pathway are covalently attached to a cysteine on the swinging arm of the substrate carrier protein SoxYZ. An interaction between the Sox pathway enzyme SoxB and the carrier protein SoxYZ is demonstrated. A crystal structure of a trapped SoxB-SoxYZ complex at 3.3 Å resolution identifies two sites of interaction, one between the SoxYZ carrier arm and the SoxB active site channel and the other at a patch distal to the active site. The presence of a distal interaction site suggests a mechanism for promiscuous specificity in the protein-protein interactions of the Sox pathway. Using biophysical methods it is shown that SoxB distinguishes between the substrate and product forms of the carrier protein through differences in interaction kinetics and that the carrier arm-bound substrate group is able to out-compete the adjacent C-terminal carboxylate for binding to the SoxB active site. The thiosulfate dehydrogenase TsdA has an unusual His/Cys coordinated heme. TsdA catalyses oxidative conjugation of two thiosulfate molecules to form tetrathionate. Mass spectrometry and UV/visible spectroscopy are used to identify an S-thiosulfonate reaction intermediate which is covalently attached to the cysteine heme ligand. A catalytic mechanism for TsdA is proposed using a crystal structure of TsdA at 1.3 Å resolution alongside site-directed mutagenesis of active site residues. Nitric oxide is produced by the mammalian immune response to kill bacterial pathogens. Part of the killing mechanism occurs through the reaction of nitric oxide with protein-bound iron-sulfur clusters. However, the same type of reaction is also exploited by nitric oxide-sensing bacterial proteins. An infrared spectroscopy approach is developed to detect the products of iron-sulfur protein nitrosylation. Using this methodology it is shown that the presence of trace O2 strongly impacts which products are formed in these nitrosylation reactions. These observations are of physiological relevance because bacteria are often exposed to NO under aerobic conditions during an immune response.

Hydrogenasen sind essentielle Enzyme im mikrobiellen H2-Kreislauf und werden als vielversprechende Katalysatoren in biologisch basierten H2-Technologien angesehen. Ein entscheidender Nachteil vieler Hydrogenasen ist ihre hohe O2-Sensitivität. Die membrangebundene Hydrogenase (MBH) aus Ralstonia eutropha ist eines der wenigen Beispiele für Hydrogenasen, die in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv sind. Die molekularen Ursachen dieser O2 Toleranz sind bislang ungeklärt. In bisherigen Studien wurde lediglich das [NiFe]-Zentrum und dessen Umgebung auf Faktoren untersucht, die die O2-Toleranz des Enzyms hervorrufen könnten. In dieser Arbeit wurde daher der Fokus auf die kleine Untereinheit der MBH gelegt, in der sich drei elektronentransferierende Fe-S Cluster befinden. Die ligandierenden Aminosäuren dieser Fe-S Cluster wurden mittels ortsspezifischer Mutagenese verändert und die resultierenden MBH-Varianten physiologisch, biochemisch, spektroskopisch und elektrochemisch charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass die O2-Toleranz der MBH maßgeblich auf einer Modifikation eines dieser drei Fe-S Cluster beruht. In der direkten Umgebung des zum aktiven Zentrum nächstgelegenen Fe-S Clusters befinden sich sechs statt vier Cysteine, wie in O2 sensitiven [NiFe]-Hydrogenasen. Die beiden zusätzlichen Cysteine um dieses proximale Cluster wurden gegen Glycine ausgetauscht, die an der entsprechenden Position in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden sind. Der Austausch der zusätzlichen Cysteine führte in vivo und in vitro zu einer erhöhten O2 Sensitivität der MBH. In EPR-spektroskopischen Untersuchungen wurde beobachtet, dass diese MBH-Variante veränderte elektronische Eigenschaften aufweist. Statt des für O2-tolerante Hydrogenasen typischen EPR-Spektrums wurde ein Signal detektiert, welches in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden ist. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell erstellt, das erklärt, wie eine modifizierte Fe-S Clusterkette zur O2-Toleranz von Hydrogenasen beiträgt. / Hydrogenases are essential for H2 cycling in microbial metabolism and serve as valuable blueprints for H2-based biotechnological application. Like many metalloproteins, most hydrogenases are extremely oxygen-sensitive and prone to inactivation by even traces of O2. The O2-tolerant membrane-bound [NiFe]-hydrogenase of Ralstonia eutropha is one of the few examples that have established a mechanism enabling H2 uptake in the presence of ambient O2. The molecular mechanisms of this O2 tolerance are not yet unravelled. However, up to date, only the large subunit harbouring the [NiFe] active site has been in the focus of studies on O2 tolerance. In the present study, the role of the small subunit with its electron relay, consisting of three Fe-S clusters, was investigated. Amino acid residues involved in coordination of all three clusters were exchanged, and the resulting MBH variants were investigated with physiological, biochemical, electrochemical and spectroscopic methods. It is shown that the rare feature of O2 tolerance is crucially related to a modification of the electron transfer chain. The Fe-S cluster proximal to the catalytic centre is surrounded by six instead of the four conserved coordinating cysteines. Removal of the two additional cysteines renders the protein O2-sensitive in vivo and in vitro. Electron paramagnetic resonance spectroscopy of this MBH variant revealed a signal resembling the spectrum usually detected in O2-sensitive [NiFe]-hydrogenases. The data imply that the major mechanism of O2 tolerance is based on the reductive removal of oxygenic species guided by the unique architecture of the electron transport chain rather than a restricted access of O2 to the active site.

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L'oxydation des résidus cystéines est une modification biochimique très répandue survenant dans tous les compartiments des cellules eucaryotes. Ce phénomène sert le repliement oxydatif des protéines dans le réticulum endoplasmique (RE), l'importation de protéines dans l'espace intermembranaire de la mitochondrie (IMS). De plus, il a un rôle régulateur dans la matrice mitochondriale et dans le cytosol où il contrôle l’activité des enzymes et des protéines de signalisation et de régulation. Dans tous ces procédés, la réversibilité de l'oxydation des résidus Cys est une caractéristique essentielle. Deux systèmes oxydoréductase puissants existent : les voies de glutathion (GSH) et la thiorédoxine ; ils catalysent la réduction des ponts disulfure, et contrôlent la plupart des processus cellulaires thiol-redox dépendant. Cependant, en dépit d'énormes connaissances portant sur leur enzymologie, peu est connu sur les caractéristiques physiologiques de ces systèmes chez les eucaryotes. Pour déterminer l'importance physiologique de ces systèmes et indiquer lequel est à la base de l'exigence du GSH pour la viabilité, nous avons effectué une analyse complète des cellules de levure épuisée ou contenant des niveaux toxiques de GSH. Les deux conditions déclenchent une réponse « iron-starvation-like » et une altération de l'activité des enzymes d’assemblage des centres fer-soufre (Iron sulfure cluster : ISC) extra-mitochondriales. Cependant, elles n’ont pas d'impact sur l’entretien thiol redox, à l’exception des niveaux élevés de glutathion qui ont altéré le repliement oxydatif des protéines dans le reticulum endoplasmique. Alors que le fer sauve partiellement la maturation des ISC et les défauts de croissance des cellules appauvries eh GSH, des expériences génétiques ont indiqué que, contrairement à la thiorédoxine, le glutathion ne peut pas assurer par lui-même les fonctions thiol-redox de la cellule. Nous proposons que le glutathion soit essentiel par son exigence dans l’assemblage des centres fer-soufre, mais ne serve comme backup que pour maintenir l’état thiol-redox de la cellule. Des niveaux physiologiques élevés de GSH sont ainsi destinés à isoler sa fonction dans le métabolisme du fer des variations de sa concentration pendant le stress redox, ce qui constitue un modèle contestant la vision traditionnelle du GSH comme acteur primordial du contrôle thiol-redox cytosolique.Nos données préliminaires sur la distribution de GSH dans les cellules recueillies par lasurveillance de l'état redox de rxYFP ciblée pour différents compartiments cellulaires (RE,Matrice, cytosol et IMS) dans les cellules HGT1 indiquent un transport spécifique du GSH vers le RE et l'exportation de GSSG de ce compartiment. Nous avons pu caractériser deuxtransporteurs ABC dont la suppression modifie le RE plus oxydant et entraîne une accumulation de GSSG par rapport aux cellules sauvages. Ces données ont été confirmées par le suivi de l'état redox de PDI1 et ERO1 (WT et hyper active). Elles suggèrent un rôle de ces transporteurs dans l'exportation du GSSG du la RE, et que le flux de GSH entre les différents compartiments est très régulé. / Cys residue oxidation is a widespread biochemical modification occurring in all eukaryotic cells compartments. It serves oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum (ER), protein import in the intermembrane space of mitochondria (IMS), and it has a regulatory role in the mitochondrial matrix and in the cytosol where it controls enzymes and signaling regulatory proteins activity. In all these processes, reversibility of Cys residue oxidation is a crucial feature. Two potent oxidoreductase systems, the glutathione (GSH) and thioredoxin pathways, catalyze disulfide bond reduction, and presumably control most thiol-redox-dependent cellular processes. However, despite tremendous knowledge of their enzymology, little is known about the physiological features of these systems in eukaryotes. To determine the physiologic importance of these functions and sort out which of them accounts for the GSH requirement for viability, we performed a comprehensive analysis of yeast cells depleted of or containing toxic levels of GSH. Both conditions triggered an intense iron-starvation-like response and impaired the activity of extra-mitochondrial ISC enzymes, but did not impact thiol-redox maintenance, except high glutathione levels that altered oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. While iron partially rescued the ISC maturation and growth defects of GSH-depleted cells, genetic experiments indicated that unlike thioredoxin, glutathione could not support by itself the thiolredox duties of the cell. We propose that glutathione is essential by its requirement in ISC assembly but only serves as a thioredoxin back up in cytosolic thiol-redox maintenance. Glutathione high physiologic levels are thus meant to insulate its function in iron metabolism from variations of its concentration during redox stresses, a model challenging the traditional view of it as prime actor in cytosolic thiol-redox control.Our preliminary data on the distribution of GSH inside cells collected by monitoring the redox state of rxYFP targeted to different cell compartments (ER, Matrix, Cytosol and IMS) in HGT1 cells indicate a specific transport of GSH into the ER and export of GSSG out of it. We were able to characterize two ABC transporters on which their deletion modify the redox state of the ER to more oxidizing and result in accumulation of higher GSSG content compared to WT. These data were confirmed by looking to the redox state of the PDI1 and ERO1 (WT and hyper active), all together suggest a role of these transporters in GSSG export from the ER, and that GSH flux between the different compartments is highly regulated.

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Le développement d’une économie basée sur l’hydrogène implique l’utilisation de catalyseurs efficaces et peu chers. Pour cela on peut s’inspirer de la nature qui a produit des métalloenzymes, les hydrogénases. On considère que la maturation est réalisée en deux étapes. Dans un premier temps, les clusters [4Fe–4S] sont assemblés par les systèmes ISC/SUF. Puis trois maturases, HydE/F/G réalisent la biosynthèse du 2Fe sous-cluster pour synthétiser le cluster-H. Seules quelques hydrogénases à [FeFe] ont été caractérisées montrant une grande diversité alors qu’elles possèdent le même centre catalytique, le cluster-H. Ainsi, une partie de cette thèse a porté sur l’utilisation de la «maturation chimique» pour activer de nouvelles enzymes apo-HydA. L’hydrogénase provenant de Megasphaera elsdenii, et sa version tronquée, MeH-HydA, contenant seulement le domaine du cluster-H ont été étudiées grâce à cette technique. La stratégie mise en œuvre a été la reconstitution des cofacteurs métalliques par l’assemblage des clusters [4Fe–4S] et la maturation des enzymes par le complexe biomimétique [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2–. Les hybrides HydF synthétisés en incubant la protéine contenant le cluster [4Fe–4S] avec les complexes biomimétiques [Fe2(xdt)(CO)4(CN)2]2– possèdent un centre à 6 fers similaire au cluster-H. Cette grande similarité amène au dernier point traité dans cette thèse: la possible activité catalytique d’HydF en tant que «hydrogénase artificielle». Les hybrides de HydF ont été caractérisés et leur activité d’hydrogénase a été évaluée. De plus, une structure RX de la protéine contenant son cluster [4Fe-4S] a été obtenue. / There is a general agreement that the building of a sustainable H2 economy relies on the availability of cheap, abundant and efficient catalysts. Nature has provided attractive solutions, hydrogenases. However, these enzymes are difficult to produce and so far only few HydAs have been completely characterized showing diversity despite the same active site. This core, H-cluster, is composed of a [4Fe–4S] cluster bound via a Cys to a diiron complex which has 3 CO, 2 CN and an azadithiolate ligands. Recently, it has been showed that hydrogenases can be easily produced through the insertion of a biomimetic [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2– complex inside the heterologously produced apo-enzyme, resulting in a full activation. Part of the PhD has been focused on the chemical maturation of new HydA from Megasphaera elsdenii and its truncated version, MeH-HydA, containing only the H-cluster. The assembly of all metal cofactors via the chemical reconstitution of the [Fe–S] clusters and the maturation through the [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2–complex has been carried out. Interestingly, HydF hybrids synthesized incorporating biomimetic [Fe2(xdt)(CO)4(CN)2]2– complexes onto the [4Fe–4S] cluster HydF protein, have a 6Fe core reminiscent of the H-cluster. HydFs from different organisms were purified and subsequently the [4Fe–4S] cluster has been reconstituted. For the first time, an X-ray structure of HydF with its [4Fe-4S] cluster has been obtained. The 6Fe cluster of HydF has been also prepared chemically with diiron complexes mimicking the active site of HydA. The metallo-cofactors have been spectroscopically characterized (EPR, FTIR, HYSCORE), hydrogenase activities evaluated.

Les interactions intermoléculaires au sein des êtres vivants sont complexes et permettent de véhiculer l’information nécessaire à la survie de l’organisme à un moment donné. Il arrive même que certains intervenants soient impliqués à différents stades d’un même processus. Parmi les très nombreux processus biologiques présents au sein des cellules, la biogénèse des centres fer-soufre apparaît être très complexe. Cette complexité est probablement reliée à la toxicité cellulaire du fer libre et du soufre libre. Ainsi les différentes étapes de la création des centres fer-soufre doivent être étroitement régulées. Des études récentes montrent que les protéines BolA et les glutarédoxines de classe II sont impliquées dans l’homéostasie du fer en intervenant seules ou de manière concertée. Cependant, la fonction réelle de ces protéines notamment aux différents stades de la biogénèse des centres fer-soufre reste encore que très peu connue. Afin de mieux comprendre la capacité des protéines BolA et glutarédoxines à jouer leur fonction biologique, nous avons étudié à travers ce travail de thèse la capacité des protéines BolA et glutarédoxines d’Arabidopsis thaliana, à former des homodimères et des hétérodimères. Pour ce faire, la cristallographie des rayons X, la résonance magnétique nucléaire et d’autres méthodes spectroscopiques ont été utilisées pour caractériser structuralement les différents états oligomériques de ces deux protéines / Intermolecular interactions in living cells are complex and help convey the information indispensable to the survival of the organism at a given time. It even happens that various stakeholders are involved at different stages of the same process. Among many biological processes present within living cells, the biogenesis of iron-sulfur clusters appears to be very complex. This complexity is probably related to cellular toxicity of both free iron and free sulfur. Thus the different stages of iron-sulfur clusters biosynthesis must be tightly regulated. Recent studies highlight that BolA proteins and class II glutaredoxins are involved in iron homeostasis probably by acting alone or in a concerted manner. However, the current function of these proteins in the various steps of the iron-sulfur clusters biogenesis is yet unidentified. To better understand how BolA proteins and glutaredoxins fulfill their biological function, we studied throughout this PhD work the ability of Arabidopsis thaliana proteins to form homodimers and heterodimers. To do this, X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance and other spectroscopic methods were used to structurally characterize the different oligomeric states of these two proteins

Ces vingt dernières années, les réactions d'insertion d'atomes ou de fragments moléculaires dans des liaisons C-H peu réactives ont fait l'objet de nombreuses études sans que les mécanismes de ces réactions aient pu être établis. Les enzymes de la superfamille « Radical-SAM » catalysent l'activation de leur substrat en utilisant un centre [4Fe-4S] et le co-substrat S-adénosylméthionine (SAM). Les enzymes d'insertion radicalaire constituent un sous-groupe de cette famille et contiennent un second centre fer-soufre impliqué, lui, dans l'activation du deuxième substrat rendant ainsi possible la réaction d'insertion par couplage radicalaire. Le travail présenté dans cette thèse concerne deux de ces enzymes, la première, RimO, est une méthylthiotransférase (MTTase) qui catalyse l'insertion d'un groupement thiométhyle en beta du résidu D89 de la protéine ribosomale S12 (β-ms-D89-S12). La seconde TYW1 ou 4-demethylwyosine synthase catalyse l'insertion d'un groupement acétyle dérivé du pyruvate dans une liaison C-H d'un groupement N-CH3 appartenant à une guanine spécifique de certains ARNt eucaryotes. Cette réaction d'insertion est suivie d'une cyclisation conduisant en plusieurs étapes à la wybutosine (yW), une base tricyclique importante pour la fidélité traductionnelle de la cellule. Dans ce travail il a été montré que les deux centres de cette famille d'enzyme coopèrent pour ces réactions et contrôlent l'utilisation des différents acteurs par des mécanismes redox originaux. / Over the last twenty years, the insertion reactions of atoms or molecular fragments into poorly reactive C-H bonds have been actively investigated but the details of their mechanisms remain largely unknown. Enzymes belonging to the "Radical-SAM" superfamily catalyze the activation of their substrate using a [4Fe-4S] in conjunction with the co-substrate S-adenosylmethionine (SAM). Radical insertion enzymes are a subgroup of this family and contain a second iron-sulfur cluster involved in the activation of the second substrate allowing the insertion reaction by radical coupling to take place. The work presented in this thesis is focusing on two enzymes, the first one, RimO is a methylthiotransferase (MTTase) that catalyzes the insertion of a thiomethyl group on the beta position of D89 residue of the ribosomal protein S12 (β-ms-D89-S12). The second one, TYW1, or 4-demethylwyosine synthase, catalyzes the insertion of the acetyl moiety of pyruvate into a C-H bond of a N-methyl group of a guanine derivative in some eukaryotic and archeal tRNAs. This insertion reaction leads to the formation of a tricyclic ring and through several steps to wybutosine (yW), a hypermodified nucleotide important for the translational fidelity of the cell. In this work we demonstrate that these radical inserting enzymes utilize the two iron-sulfur clusters to cooperate and that they control the different partners of the reaction by original redox mechanisms.