Le but de cette thèse est d’étudier les modifications biochimiques mitochondriales liées à un défaut de lipoylation des protéines dans les fibroblastes de 14 patients. Ces patients sont porteurs d’une mutation dans un gène codant une des protéines impliquées soit dans la synthèse de l’acide lipoïque (LIPT1, LIPT2) soit dans la voie de biogenèse des centres Fe-S mitochondriale (FDX1L, ISCA1, ISCA2, IBA57, NFU1, BOLA3). La voie de biogenèse des centres Fe-S est nécessaire à la maturation des protéines Fe-S mitochondriales, dont la lipoic acid synthase (LIAS).Ces travaux ont permis d’étudier notamment un deuxième cas de déficit en FDX1L ainsi qu’un patient porteur d’une nouvelle mutation dans ISCA1. Les déficits dans la voie de la biogenèse des centres Fe-S observés chez les patients étudiés affectent principalement la maturation des protéines mitochondriales à centre [4Fe-4S] dont l’aconitase mitochondriale, les complexes I et II de la chaîne respiratoire et la LIAS, induisant ainsi un défaut de lipoylation d’enzymes clés du métabolisme énergétique (PDHc, KGDHc). Aucune atteinte du réseau mitochondrial ni de variations du stress oxydatif n’ont pu être mises en évidence. Finalement, l’ajout d’acide lipoïque exogène n’améliore pas les déficits observés.Les profils d’expression des protéines dans les fibroblastes des patients suggèrent que les protéines NFU1, BOLA3 et IBA57 ainsi que ISCA1, ISCA2 et IBA57 coopèrent entre elles de manière complexe. / The aim of this work is to study mitochondrial dysfunctions related to a defect of protein lipoylation in fibroblasts of 14 patients. These patients carry a point mutation in a gene encoding for a protein involved either in lipoic acid biosynthesis (LIPT1 or LIPT2) or in the mitochondrial pathway devoted to iron-sulfur cluster biogenesis (FDX1L, ISCA1, ISCA2, IBA57, NFU1, BOLA3) essential for maturation of mitochondrial Fe-S proteins such as lipoic acid synthase (LIAS). This work describes the second case of FDX1L deficiency and a patient with a new mutation in ISCA1 gene.We found that mitochondrial [4Fe-4S] proteins (mitochondrial aconitase, complexes I and II of the respiratory chain and LIAS) are mainly affected in fibroblasts of patients with defect in the mitochondrial Fe-S maturation pathway. Secondary, LIAS dysfunction leads to decreased lipoylation of PDHc and KGDHc, complexes involved in energy metabolism. Neither mitochondrial network nor oxidative stress biomarkers was modified in our study. Addition of exogenous lipoic acid did not rescue the mitochondrial deficiency.Protein expression profiles obtained in fibroblasts of patients suggest that NFU1, BOLA3 and IBA57 and also ISCA1, ISCA2 and IBA57 could function and interact together to form protein complexes.

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Hydrogenasen sind essentielle Enzyme im mikrobiellen H2-Kreislauf und werden als vielversprechende Katalysatoren in biologisch basierten H2-Technologien angesehen. Ein entscheidender Nachteil vieler Hydrogenasen ist ihre hohe O2-Sensitivität. Die membrangebundene Hydrogenase (MBH) aus Ralstonia eutropha ist eines der wenigen Beispiele für Hydrogenasen, die in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv sind. Die molekularen Ursachen dieser O2 Toleranz sind bislang ungeklärt. In bisherigen Studien wurde lediglich das [NiFe]-Zentrum und dessen Umgebung auf Faktoren untersucht, die die O2-Toleranz des Enzyms hervorrufen könnten. In dieser Arbeit wurde daher der Fokus auf die kleine Untereinheit der MBH gelegt, in der sich drei elektronentransferierende Fe-S Cluster befinden. Die ligandierenden Aminosäuren dieser Fe-S Cluster wurden mittels ortsspezifischer Mutagenese verändert und die resultierenden MBH-Varianten physiologisch, biochemisch, spektroskopisch und elektrochemisch charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass die O2-Toleranz der MBH maßgeblich auf einer Modifikation eines dieser drei Fe-S Cluster beruht. In der direkten Umgebung des zum aktiven Zentrum nächstgelegenen Fe-S Clusters befinden sich sechs statt vier Cysteine, wie in O2 sensitiven [NiFe]-Hydrogenasen. Die beiden zusätzlichen Cysteine um dieses proximale Cluster wurden gegen Glycine ausgetauscht, die an der entsprechenden Position in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden sind. Der Austausch der zusätzlichen Cysteine führte in vivo und in vitro zu einer erhöhten O2 Sensitivität der MBH. In EPR-spektroskopischen Untersuchungen wurde beobachtet, dass diese MBH-Variante veränderte elektronische Eigenschaften aufweist. Statt des für O2-tolerante Hydrogenasen typischen EPR-Spektrums wurde ein Signal detektiert, welches in O2-sensitiven Hydrogenasen zu finden ist. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell erstellt, das erklärt, wie eine modifizierte Fe-S Clusterkette zur O2-Toleranz von Hydrogenasen beiträgt. / Hydrogenases are essential for H2 cycling in microbial metabolism and serve as valuable blueprints for H2-based biotechnological application. Like many metalloproteins, most hydrogenases are extremely oxygen-sensitive and prone to inactivation by even traces of O2. The O2-tolerant membrane-bound [NiFe]-hydrogenase of Ralstonia eutropha is one of the few examples that have established a mechanism enabling H2 uptake in the presence of ambient O2. The molecular mechanisms of this O2 tolerance are not yet unravelled. However, up to date, only the large subunit harbouring the [NiFe] active site has been in the focus of studies on O2 tolerance. In the present study, the role of the small subunit with its electron relay, consisting of three Fe-S clusters, was investigated. Amino acid residues involved in coordination of all three clusters were exchanged, and the resulting MBH variants were investigated with physiological, biochemical, electrochemical and spectroscopic methods. It is shown that the rare feature of O2 tolerance is crucially related to a modification of the electron transfer chain. The Fe-S cluster proximal to the catalytic centre is surrounded by six instead of the four conserved coordinating cysteines. Removal of the two additional cysteines renders the protein O2-sensitive in vivo and in vitro. Electron paramagnetic resonance spectroscopy of this MBH variant revealed a signal resembling the spectrum usually detected in O2-sensitive [NiFe]-hydrogenases. The data imply that the major mechanism of O2 tolerance is based on the reductive removal of oxygenic species guided by the unique architecture of the electron transport chain rather than a restricted access of O2 to the active site.

Im biogeochemischen Wasserstoffkreislauf erfolgt der überwiegende Teil der H2-Aufnahme aus der Atmosphäre durch die Böden. Erst seit kurzem ist bekannt, dass die Oxidation von Wasserstoff in Böden mutmaßlich durch eine Reihe von Bodenbakterien vermittelt wird, die zur Aufnahme von Wasserstoff in atmosphärischen Konzentrationen befähigt sind. Diese Bakterien codieren [NiFe]-Hydrogenasen einer neuen Gruppe, die als Gruppe 5 der [NiFe]-Hydrogenasen klassifiziert wurde. Auch das beta Proteobakterium Ralstonia eutropha besitzt die Gene einer derartigen Hydrogenase, die aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu den sonst überwiegend in Actinobakterien gefundenen Vertretern der Gruppe 5 als „Actinobakterielle Hydrogenase“ (AH) benannt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde die AH aus R. eutropha als erste Gruppe 5-[NiFe]-Hydrogenase in reiner Form isoliert und eingehend durch unterschiedliche biochemische, spektroskopische und röntgenkristallographische Verfahren untersucht. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse unterstützen die für Gruppe-5-[NiFe]-Hydrogenasen postulierte Funktion im Erhaltungsstoffwechsel der Organismen unter besonderen Bedingungen, schließen jedoch eine Beteiligung der AH an der hochaffinen Oxidation von Wasserstoff in Böden aus. Jedoch zeigt das Enzym die neuartige Eigenschaft der sauerstoffinsensitiven Wasserstoff-Oxidation, was auf die Anwesenheit eines ungewöhnlichen, durch 1 Aspartat und 3 Cysteine koordinierten [4Fe4S]-Clusters und der vermuteten Kopplung der Elektronentransportketten in der mutmaßlich physiologischen doppeldimeren Form des Enzyms zurückzuführen sein dürfte. Die Arbeit erweitert somit die Kenntnisse auf dem Gebiet der Sauerstofftoleranz von Hydrogenasen sowie der Eigenschaften der Gruppe 5-[NiFe]-Hydrogenasen und ihrer physiologischen Rolle in den betreffenden Organismen. / In the biogeochemical hydrogen cycle, the dominating process for hydrogen uptake from the atmosphere is performed in soils. Only recently it was shown that hydrogen oxidation in soils is presumably mediated by a number of soil-dwelling actinobacteria, which are enabled in high-affinity hydrogen uptake. These bacteria encode [NiFe] hydrogenases of a novel group classified as group 5 of [NiFe] hydrogenases. A hydrogenase of this group is also found in the beta proteobacterium Ralstonia eutropha and was named „Actinobacterial Hydrogenase“ (AH) for its similarity to the group 5 [NiFe] hydrogenases found in actinobacteria. In this work, the AH from R. eutropha was, as the first group 5 [NiFe] hydrogenase, purified to homogeinity and thoroughly characterized by various biochemical, spectroscopic and X-ray crystallographic methods. The results obtained hereby support the function in maintaining a basal metabolism under challenging conditions, that was postulated for group 5 [NiFe] hydrogenases. Yet, the results also exclude the possibility of the AH contributing to high-affinity hydrogen uptake in soils. However, the enzyme shows the novel property of being able of oxygen-insensitive hydrogen oxidation. This property is obviously connected to an unusual [4Fe4S] cluster coordinated by 1 aspartate and 3 cysteines, as well as to a supposed coupling of the electron transport chains in the double dimeric native form of the enzyme. Hence, this work broadens the knowledge in the field of oxygen tolerant hydrogen oxidation and provides new insights in the function of group 5 [NiFe] hydrogenases and their physiological role in the organisms.

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Mitochondrial dysfunction has been implicated for a wide range of human diseases. One of the major biosynthetic processes in human mitochondria is the biogenesis of Iron-Sulfur (Fe-S) clusters which primarily involves in electron transfer reactions during oxidative phosphorylation (OXPHOS). Defects in Fe-S cluster biogenesis process leads to mitochondrial dysfunction and that eventually results in various human mitochondrial disorders. One of the major mitochondrial disorders associated with Fe-S cluster biogenesis impairment is exercise intolerance disorder ISCU myopathy, which is a result of loss of function of Fe-S cluster scaffold protein ISCU. Our biochemical results using yeast model system and HeLa cells lines suggests that ISCU Myopathy results in defective Fe-S cluster biogenesis in mitochondrial compartment. As a result, electron transport chain (ETC) complexes demonstrate significant reduction in their redox properties, leading to loss of cellular respiration. Furthermore, in ISCU Myopathy, mitochondria display enhancement in iron levels and reactive oxygen species, thereby causing oxidative stress leading to impairment in the mitochondrial functions. On the other hand, in mammalian mitochondria, the initial step of Fe-S cluster assembly process is assisted by NFS1-ISD11 complex, which delivers sulfur to the scaffold protein ISCU during Fe-S cluster synthesis. In humans, loss of ISD11 function leads to development of respiratory distress disorder, Combined Oxidative Phosphorylation Deficiency 19 (COXPD19). Our study maps the important ISD11 amino acid residues critical for in vivo Fe-S cluster biogenesis. Importantly, mutation of these critical ISD11 residues to alanine leads to its compromised interaction with NFS1, which results in reduced stability and enhanced aggregation of NFS1 in the mitochondria. Moreover, our findings highlight that, COXPD19 associated R68L ISD11 mutant displays reduced affinity to form a stable sub-complex with NFS1, thereby fails to prevent NFS1 aggregation, resulting impairment of Fe-S cluster biogenesis. The prime affected machinery is the ETC complex which demonstrates compromised redox properties, causing diminished mitochondrial respiration in COXPD19 patients. In summary, our findings provide compelling evidence that respiration defect due to impaired biogenesis of Fe-S clusters in ISCU myopathy patients, leads to manifestation of complex clinical symptoms. Additionally, our study highlights the role of ISD11 protein in Fe-S cluster biogenesis and maps the surface residues of ISD11 protein that are involved in interaction with sulfur donor protein NFS1. Moreover, we have demonstrated the molecular basis of disease progression of COXPD19 as a result of R68L ISD11 mutation.

Die lösliche, NAD+-reduzierende Hydrogenase (SH) aus Ralstonia eutropha H16 ist eine Pyridinnukleotid-abhängige Hydrogenase. Das heißt, der Umsatz von H2 im Hydrogenasemodul des Enzyms ist an die Reduktion von NAD(P)+ im NAD(P)H:Akzeptor-Oxidoreduktasemodul gekoppelt. Die SH ist Vertreter des Subtyps, der auch in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv ist. Dies wird ermöglicht durch eine reduktive Entfernung von O2, die nach dem aktuellen Modell abhängig ist vom rückläufigen e--Transport vom NADH:Akzeptor-Oxidoreduktasemodul zum aktiven [NiFe]-Zentrum in der großen Hydrogenaseuntereinheit. Der Einfluss des FeS-Clusters in der kleinen Hydrogenaseuntereinheit HoxY auf diesen Prozess wurde hier untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die vier hochkonservierten Cysteine C41, C44, C113 und C179 in HoxY an der Koordination des FeS-Zentrums beteiligt sind. Außerdem wurde das nahegelegene Cystein C39 als relevant für die Sauerstofftoleranz identifiziert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das Tryptophan W42 aus HoxY essentiell für die Hydrogenaseaktivität der SH ist. Damit bestätigt sich, dass die Kinetik des rückläufigen e--Transports durch die Aminosäureumgebung des FeS-Clusters in HoxY beeinflusst ist. Ferner wurden in dieser Arbeit Ansätze zum Einsatz der SH aus R. eutropha in einer H2-produzierenden cyanobakteriellen Designzelle weiterverfolgt. Dazu wurden Hybridsysteme aus SH und cyanobakteriellem Photosystem I in vitro hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur lichtgetriebenen H2-Produktion untersucht. Außerdem wurde an einem heterologen Expressionssystem der SH für Cyanobakterien gearbeitet. Weiterhin wurde die SH aus Rhodococcus opacus MR11 als komplementäres Modellsystem für O2-tolerante Pyridinnukleotid-abhängige Hydrogenasen etabliert. Dieser zur SH aus R. eutropha homologe Komplex hatte in früheren Arbeiten Vorteile für spektroskopische Studien offenbart und wurde hier erstmals im direkten Vergleich zur SH aus R. eutropha biochemisch und spektroskopisch charakterisiert. / The soluble, NAD+-reducing hydrogenase (SH) from Ralstonia eutropha H16 is a pyridine nucleotide-dependent hydrogenase. In these types of enzymes the conversion of H2 in the hydrogenase module of the complex is coupled to the reduction of NAD(P)+ in the NAD(P)H:acceptor oxidoreductase module. The SH belongs to a subtype that is catalytically active also in the presence of O2. This O2 tolerance is enabled by a reductive removal of O2, which according to the current model depends on a reverse e- flow from the NADH:acceptor oxidoreductase module to the active [NiFe] site in the large hydrogenase subunit. The impact of the FeS cluster in the small hydrogenase subunit HoxY on this process was analyzed in this study. Thereby it was shown that the four highly conserved cysteines C41, C44, C113 and C179 in HoxY are involved in the coordination of the FeS center. Further the nearby cysteine C39 was identified to be relevant for the O2 tolerance of the SH. Additionally we found the tryptophan W42 to be essential for the hydrogenase activity of the SH. Thus it was confirmed that the kinetic of the reverse e- transport is affected by the amino acid environment of the FeS cluster in HoxY. In addition, approaches for using the SH from R. eutropha in H2 producing cyanobacterial design cells were pursued. On one hand hybrid systems consisting of the SH and cyanobacterial photosystem I were analyzed in vitro for their capacity to produce H2 in a light dependent manner. On the other hand work on a heterologous expression system of the SH for Cyanobacteria was continued. Furthermore the SH from Rhodococcus opacus MR11 was established as complementary model system for O2-tolerant pyridine nucleotide-dependent hydrogenases. This complex, which is homologous to the SH from R. eutropha, has revealed advantages for spectroscopic analysis in earlier studies. Here it was characterized biochemically and spectroscopically for the first time in direct comparison with the SH from R. eutropha.