L’Ins(1,3,4,5)P4 produit par l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase de type B (Itpkb) est nécessaire au développement des thymocytes et lymphocytes T murins. Trois hypothèses sont admises quant à la fonction physiologique et au mécanisme d’action de cet inositol phosphorylé : la première postule que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la réponse calcique intracellulaire ; la seconde, que cet inositolphosphate est un intermédiaire métabolique dans la synthèse d’inositols plus hautement phosphorylés ; la dernière, que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la localisation subcellulaire et la fonction de protéines capables de la reconnaître par des domaines spécifiques de liaison. Afin d’investiguer cette dernière hypothèse, nous avons analysé la physiologie des lymphocytes B invalidés pour Itpkb et avons généré et analysé des souris transgéniques d’addition pour Rasa3, récepteur potentiel à l’Ins(1,3,4,5)P4. Les lymphocytes B déficients en Itpkb présentent un défaut de survie car ils ne peuvent activer correctement les protéines kinases Erk1/2 suite à la stimulation du BCR de surface. Cela conduit à la surexpression anormale de la protéine pro-apoptotique Bim. La diminution de l’expression de Bim est suffisante dans ce modèle pour restaurer une fonction normale des lymphocytes B. In vitro, Nous avons montré que l’Ins(1,3,4,5)P4 est nécessaire à la translocation de Rasa3, protéine favorisant l’inactivation de la voie de Ras, de la membrane vers le cytoplasme. L’étude de lymphocytes invalidés pour Itpkb dans un modèle de BCR transgénique semble montrer que des anomalies de réponse calcique ne participent pas au phénotype. En conclusion, nos résultats indiquent qu’une des voies de signalisation préférentielle de l’Ins(1,3,4,5)P4 passe par la modulation de la localisation subcellulaire de protéines possédant un domaine d’affinité pour l’Ins(1,3,4,5)P4 telle que Rasa3.

Alzheimer’s disease is a neurodegenerative disease characterised by progressive memory deterioration and cognitive impairment. Pathological hallmarks are extracellular senile plaques, neurofibrillary tangles and neuron loss. Senile plaques are produced through altered processing of the membrane-bound protein APP. Different neurotransmitter signal transduction pathways have been implicated in the formation or development of Alzheimer’s pathologies, but the molecular mechanisms behind these changes are not well known. The overall aims of this thesis were to identify novel genes with differential expression in Alzheimer’s disease and to investigate mechanisms initiating these changes and their relationship to the disease. A real-time RT-PCR strategy was developed to enable detection of small mRNA changes in human brain autopsy samples. This approach was first used to investigate levels of expression of a candidate gene (MAO), and later employed to verify gene expression differences detected by cDNA microarray analysis. Of several genes verified as differentially expressed in the patients, ITPKB (Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B) and RGS4 (Regulator of G-protein signalling 4) presented the largest expression differences in Alzheimer’s cases compared to control samples. Several splice variants of RGS4 showed similar down-regulation levels and one rare haplotype was associated with decreased RGS4 expression. Functional studies in SH-SY5Y cell cultures overexpressing RGS4 showed that it is likely that RGS4 affects APP processing by regulating PRKC expression levels. The combined expression of RGS4 and ITPKB is for the first time presented in this thesis as genes with altered mRNA levels in Alzheimer’s disease. These two genes are implicated in the same signalling pathway that modifies calcium levels in the cell. Furthermore, the fact that RGS4 affects APP processing suggests that RGS4 is involved in the development of senile plaques. This motivates further functional studies of this gene and suggests that RGS4 may become a new potential drug target for Alzheimer’s disease.

L’isoforme B de l’inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase (Itpkb) génère de l’inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate (IP4) à partir d’inositol 1,4,5-trisphosphate. Une étude microarray de 2006 a montré que le taux d’ARNm d’Itpkb était augmenté dans le cerveau de patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA). La MA est la forme la plus courante de démence et est caractérisée par deux types de lésions histopathologiques :les dégénérescences neurofibrillaires intracellulaires, composées d’agrégats de protéines tau hyperphosphorylées, et les plaques séniles, composées d’agrégats de peptides Aβ extracellulaires et entourées de neurites dystrophiques. Durant ce travail, nous avons étudié l’expression et la fonction d’Itpkb dans le cerveau normal et le cerveau de patients atteints de la MA. Premièrement, nous avons montré qu’Itpkb était exprimée de manière physiologique dans les neurones et dans les astrocytes. Nous avons confirmé la surexpression d’Itpkb au niveau protéique dans le cerveau de patients atteints de la MA. L’immunoréactivité anti-Itpkb était surtout localisée au niveau des neurites dystrophiques entourant les plaques amyloïdes. Des résultats identiques furent obtenus sur un modèle murin de la forme familiale de la MA, le modèle 5xFAD, reproduisant la pathologie amyloïde. La surexpression d’Itpkb dans des cellules Neuro-2a (cellules murines de neuroblastome) mène à une induction d’apoptose, à une activité β-sécrétase augmentée et à une surproduction de peptides Aβ. L’inhibition in vitro des Mitogen-activated kinase kinases 1/2 abolit complètement la surproduction de peptides Aβ. Des analyses complémentaires ont permis de montrer que le site catalytique ainsi que la partie N-terminale (responsable du targeting membranaire) de la protéine Itpkb étaient nécessaire à l’augmentation de production des peptides Aβ. Chez des animaux transgéniques pour Itpkb, la surexpression neuronale de la protéine Itpkb n’est pas suffisante pour induire la formation de plaques amyloïdes ou pour induire une hyperphosphorylation de tau. Cependant, ces souris transgéniques développent une astrogiose marquée et présentent des neurites dégénératifs au niveau de l’hippocampe. Chez des souris transgéniques 5xFAD surexprimant Itpkb dans les neurones, l’activation des Extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK 1/2) et l’activité β-sécrétase sont drastiquement augmentés, ce qui exacerbe la pathologie Alzheimer, confirmée par une astrogliose plus importante chez ces animaux, une surproduction de peptides Aβ 40 et une hyperphosphorylation de tau. Aucun impact sur la pathologie Alzheimer ne fut observé lorsqu’un mutant catalytique inactif d’Itpkb fut surexprimé. En conclusion, nos résultats soutiennent que la voie de signalisation Itpkb / IP4 / ERK 1/2 est une voie régulatrice de l’apoptose neuronale, du processing du précurseur de la protéine amyloïde et de la phosphorylation de tau au cours de la maladie d’Alzheimer. Nos résultats ouvrent également des perspectives thérapeutiques pour les patients Alzheimer arborant une surexpression corticale d’Itpkb, chez qui Itpkb pourrait être une cible permettant de diminuer la pathologie amyloide. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’Ins(1,3,4,5)P4 produit par l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase de type B (Itpkb) est nécessaire au développement des thymocytes et lymphocytes T murins. Trois hypothèses sont admises quant à la fonction physiologique et au mécanisme d’action de cet inositol phosphorylé :la première postule que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la réponse calcique intracellulaire ;la seconde, que cet inositolphosphate est un intermédiaire métabolique dans la synthèse d’inositols plus hautement phosphorylés ;la dernière, que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la localisation subcellulaire et la fonction de protéines capables de la reconnaître par des domaines spécifiques de liaison. Afin d’investiguer cette dernière hypothèse, nous avons analysé la physiologie des lymphocytes B invalidés pour Itpkb et avons généré et analysé des souris transgéniques d’addition pour Rasa3, récepteur potentiel à l’Ins(1,3,4,5)P4.<p>Les lymphocytes B déficients en Itpkb présentent un défaut de survie car ils ne peuvent activer correctement les protéines kinases Erk1/2 suite à la stimulation du BCR de surface. Cela conduit à la surexpression anormale de la protéine pro-apoptotique Bim. La diminution de l’expression de Bim est suffisante dans ce modèle pour restaurer une fonction normale des lymphocytes B. In vitro, Nous avons montré que l’Ins(1,3,4,5)P4 est nécessaire à la translocation de Rasa3, protéine favorisant l’inactivation de la voie de Ras, de la membrane vers le cytoplasme. L’étude de lymphocytes invalidés pour Itpkb dans un modèle de BCR transgénique semble montrer que des anomalies de réponse calcique ne participent pas au phénotype.<p>En conclusion, nos résultats indiquent qu’une des voies de signalisation préférentielle de l’Ins(1,3,4,5)P4 passe par la modulation de la localisation subcellulaire de protéines possédant un domaine d’affinité pour l’Ins(1,3,4,5)P4 telle que Rasa3.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished