A reposição de ilhotas pancreáticas é uma forma eficaz de se restabelecer a homeostase glicêmica em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 com controle metabólico instável (“DM1 lábil”). Entretanto, ao longo do processo de isolamento, a partir do pâncreas do doador em morte encefálica (ME) e posterior enxerto no receptor, perdas importantes, tanto no número quanto na qualidade das ilhotas, limitam a eficácia do procedimento de transplante. Frequentemente, transplantes sequenciais de dois ou até três pâncreas são necessários para se atingir a independência de insulina exógena. Mesmo que centros transplantadores já reportem boas taxas de sucesso, utilizando apenas um doador por paciente, a escassez de doadores ainda é um forte limitador dessa terapêutica, dificultando a adoção da reposição de ilhotas como prática clínica de rotina para o tratamento de pacientes com DM1 lábil. Entre os fatores responsáveis pela perda das ilhotas, pode-se destacar o intenso estresse inflamatório produzido pela ME do doador. Semelhantemente ao que ocorre com ilhotas pancreáticas, estudos clínicos e experimentais evidenciam que a ME induz danos teciduais irreversíveis em vários outros órgãos e tecidos destinados a transplante, tais como o coração, pulmões, rins e fígado. Órgãos provenientes de doadores vivos, em geral, resultam em desfechos pós-transplante mais favoráveis quando comparados às taxas de sucesso obtidas com órgãos derivados de doadores cadavéricos. Estudos recentes demonstram que a Exendin-4, um análogo do glucagon-like peptide-1 (GLP-1), possui propriedades anti-inflamatórias, pró-proliferativas e de redução da apoptose de células β pancreáticas. Interessantemente, esse mesmo análogo também apresentou efeitos protetores em diversos modelos animais de doenças hepáticas. Sendo assim, nós hipotetizamos que a administração dessa droga a doadores cadavéricos poderia amenizar os danos causados pela ME nas ilhotas pancreáticas e no tecido hepático, preservando a qualidade desses tecidos para uso em transplantes. A fim de testar a hipótese sugerida, desenvolveram-se dois estudos em modelo murino de ME. A administração de Exendin-4 a animais com ME foi avaliada em relação a diversos parâmetros de dano e qualidade teciduais, além de marcadores inflamatórios e expressão gênica de genes ligados a inflamação e estresse. Grupos de animais que não sofreram ME ou que sofreram ME mas não receberam a droga foram utilizados como controles nesses experimentos. Os resultados gerados indicam que a administração de Exendin-4 a ratos em ME melhora a viabilidade e a função de ilhotas pancreáticas isoladas. Isso foi acompanhado por uma redução na expressão gênica da citocina pró-inflamatória Interleukin-1 beta (Il1b) no tecido pancreático. Além disso, o tratamento com Exendin-4 também modulou a expressão de genes que codificam para proteínas de controle do estresse oxidativo celular, a superoxide dismutase-2 (Sod2) e a uncoupling protein-2 (Ucp2). Genes relacionados ao estresse do retículo endoplasmático, C/EBP Homologous Protein (Chop) e Heat Shock 70kDa Protein 5 (Hspa5), também conhecido como immunoglobulin heavy-chain binding protein (BiP), tiveram suas expressões reduzidas em ilhotas isoladas de animais tratados. Recentemente, tem sido demonstrado que o estresse do retículo endoplasmático participa no mecanismo de morte celular da célula β induzida por citocinas. Assim, nós sugerimos que o efeito protetor da Exendin-4 contra os danos causados pela ME provavelmente se dê através de uma diminuição da inflamação e do estresse oxidativo no ambiente pancreático, o que se traduz em uma menor ativação do estresse do retículo endoplasmático na célula β, consequentemente, reduzindo a morte celular nas ilhotas isoladas. Em ressonância com os efeitos benéficos observados nas ilhotas, animais tratados também apresentaram níveis reduzidos de marcadores de dano hepático circulantes, além de uma diminuição significativa nas taxas de apoptose no tecido hepático. Os resultados aqui apresentados, portanto, sugerem que a administração de Exendin-4 a doadores cadavéricos de múltiplos órgãos tem o potencial para minimizar os efeitos deletérios causados pela ME nas ilhotas pancreáticas e no fígado. O GLP-1, uma incretina gastrointestinal secretada pelas células L do intestino delgado, estimula a secreção de insulina dependente de glicose nas células β pancreáticas. Estudos recentes demonstram que o GLP-1 é capaz de proteger as células β do estresse oxidativo e dos danos inflamatórios, os quais são considerados fatores importantes não apenas na mediação dos danos teciduais induzidos pela ME, mas também na patogênese do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Tal efeito estimulatório dependente de glicose pode ser explorado como uma estratégia terapêutica alternativa para o tratamento de pacientes com DM2, por reestabelecer a homeostase glicêmica e eliminar o risco de hipoglicemia associada à injeção exógena de insulina. Recentemente, vários ensaios clínicos confirmaram os efeitos benéficos de análogos do GLP-1, que incluem um melhor controle glicêmico e perda de peso, resultando na aprovação de tais análogos para o tratamento clínico do DM2. No entanto, os mecanismos moleculares que medeiam a estimulação da secreção de insulina pelo GLP-1 não são totalmente conhecidos. Isso gera a necessidade do desenvolvimento de estudos bioquímicos detalhados para elucidação das vias de transdução de sinal intracelulares responsáveis pela execução dos efeitos estimulatórios do GLP-1 na secreção de insulina. Devido à dependência de glicose para a ativação do seu efeito estimulatório, nós hipotetizamos que o GLP-1 possa atuar na regulação da atividade bioenergética de metabolismo da glicose na célula β. Utilizando-se da linhagem celular clonal secretora de insulina, BRIN-BD11 e ilhotas isoladas de camundongos, nós demonstramos que a sinalização através do receptor do GLP-1 (GLP-1R) promove a glicólise e, consequentemente, aumenta o conteúdo de ATP intracelular. Os dados deste estudo sugerem que isso provavelmente seja mediado pela ativação da mammalian Target of Rapamycin (mTOR), resultando na acumulação do fator de transcrição Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), que por sua vez promove um aumento na expressão gênica de genes que codificam para enzimas da via glicolítica. Sugere-se que essa indução na taxa glicolítica possa reforçar o acoplamento metabólico entre estímulo e secreção, resultando no aumento da secreção de insulina dependente de glicose mediada por GLP-1. / Replacement of pancreatic islets is an effective way to restore glucose homeostasis in patients with type 1 diabetes mellitus with unstable metabolic control ("T1DM labile"). However, along the isolation procedure from brain dead organ donors and later recipient engraftment, significant losses, both in number and quality of islets take place, limiting the effectiveness of islet transplantation as a whole. Often, sequential transplants of two or three donors are necessary in order to achieve exogenous insulin independence. Even with recent advances and transplant centers already reporting good success rates using only one donor per patient, the shortage of donors is still a strong limitation of this therapy, hindering the adoption of islets reposition as routine clinical practice for the treatment of patients with T1DM labile. Several factors are responsible for islets loss, including intense inflammatory stress produced by the donor’s brain death (BD). Similarly to what happens with pancreatic islets, clinical and experimental studies show that BD induces irreversible tissue damage in several other organs and tissues destined for transplantation, such as heart, lungs, kidneys and liver. In general, organs from living donors result in more favorable post-transplant outcomes when compared to organs procured from cadaveric donors. Recent studies indicate that Exendin-4, a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog, has anti-inflammatory, proliferative and anti-apoptotic properties in pancreatic β cells. Interestingly, this analog has also shown protective effects in several animal models of liver disease. Thus, we hypothesized that administration of this drug to cadaveric donors could mitigate damage caused by BD in the pancreatic islets and liver tissue. Such treatment could preserve islets and liver quality for use in transplantation and possibly improve outcomes. In order to test the suggested hypothesis, we developed two studies using a rat model of BD. Administration of Exendin-4 to animals that underwent experimental BD was evaluated against various parameters of tissue damage and quality, as well as inflammatory markers and gene expression of genes linked to inflammation and stress. Groups of animals that did not undergo BD or that underwent BD, but have not been given the drug were used as controls in these experiments. Results generated in these studies indicate that administration of Exendin-4 to brain dead rats improves the viability and function of isolated pancreatic islets. This was accompanied by a decrease in gene expression of the pro-inflammatory cytokine Interleukin-1 beta (Il1b) in the pancreatic tissue. In addition, treatment with Exendin- 4 also modulated the expression of genes encoding cellular oxidative stress control proteins, the superoxide dismutase-2 (Sod2), and uncoupling protein-2 (Ucp2). Genes related to stress of the endoplasmic reticulum (ER), C/EBP Homologous Protein (Chop) and Heat Shock 70kDa Protein 5 (Hspa5), also known as heavy-chain binding protein immunoglobulin (BiP), were found to be reduced in islets isolated from treated animals. Recently, ER stress has been shown to participate in the mechanism of β cell death induced by pro-inflammatory cytokines. Thus, we suggest that the protective effect of Exendin-4 against damage caused by BD probably occurs through a decrease in inflammation and oxidative stress in the pancreatic environment, which translates into a lower activation of ER stress in the β cells, hence reducing cell death of isolated islets. In resonance with the beneficial effects observed in islets, treated animals also showed reduced levels of circulating liver damage markers, and a significant decrease in the rate of apoptosis in the liver. Our results, therefore, suggest that administration of Exendin-4 to cadaveric organ donors has the potential to minimize the deleterious effects caused by BD in the pancreatic islets and liver. GLP-1, a gastrointestinal incretin secreted by the L-cells of the small intestine, stimulates insulin secretion in a glucose-dependent manner from pancreatic β cells. Recent studies have shown that GLP-1 is able to protect β cells from oxidative stress and inflammatory damage, which are considered important factors not only in mediating tissue damage induced by BD, but also in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Such glucose-dependent stimulatory effect can be exploited as an alternative therapeutic strategy for the treatment of patients with T2DM in order to reestablish glucose homeostasis and to eliminate the risk of hypoglycemia associated with exogenous insulin injection. Recently, several clinical trials have confirmed the beneficial effects of GLP-1 analogs, which include better glycemic control and weight loss, resulting in the approval of such analogs for the clinical treatment of T2DM. However, the molecular mechanisms that mediate stimulation of insulin secretion by GLP-1 are not fully characterized. Thus, detailed biochemical studies aiming at elucidating intracellular signal transduction pathways responsible for the execution of GLP-1 stimulatory effects on insulin secretion are of high interest. Due to glucose-dependence for activation of its stimulatory effect, we hypothesized that GLP-1 may act in the regulation of β cell bioenergetics and glucose metabolism. Using the clonal rat insulin-secreting cell line BRIN-BD11, and isolated mouse islets, we have demonstrated that signaling via the GLP-1 receptor (GLP-1R) promotes glycolysis and consequently increases intracellular ATP content. Our data suggest that this is likely mediated by activation of the mammalian Target of Rapamycin (mTOR), resulting in the accumulation of the transcription factor Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), which, in turn, promotes gene expression of genes that encode for glycolytic enzymes. We suggest that such increase in the glycolytic rate strengthens coupling between metabolic stimulus and secretion, ultimately resulting in exacerbated glucose-induced insulin secretion.

O transplante de ilhotas, como tratamento do diabetes mellitus tipo 1 (DM1) “lábil”, tem progredido consideravelmente ao longo dos últimos 12 anos. Nesse período, aproximadamente 750 pacientes foram transplantados em diversos centros, com resultados promissores. No entanto, é evidenciada uma grande disparidade entre os centros de transplantes em relação ao sucesso do isolamento e aos desfechos póstransplante. Alguns fatores podem explicar estas disparidades, como características do doador, qualidade do isolamento e o local da infusão das ilhotas. O isolamento das ilhotas é a fase mais complexa de todo o processo, devendo ser totalmente padronizada. O isolamento é feito com uma enzima de digestão, com auxílio físico e mecânico. A enzima Liberase HI era a enzima de escolha para a digestão do pâncreas, pois proporcionava uma boa quantidade e qualidade de ilhotas. No entanto, esta foi retirada do mercado em 2007, pois havia o risco de transmissão de encefalopatia espongiforme. Novas enzimas têm sido utilizadas e estão sendo testadas para a digestão do pâncreas; entretanto, não existe um consenso de qual enzima de digestão é mais eficiente no isolamento de ilhotas humanas.Devido à implantação do Laboratório de Biologia das Ilhotas Pancreáticas Humanas no Hospital de Clínicas de Porto Alegre e a necessidade da definição da enzima mais eficiente a ser utilizada no isolamento das ilhotas, consideramos adequada a realização de uma meta-análise sobre o tema. Esta metaanálise será útil para a tomada de decisão de outros Centros de isolamento e transplante de ilhotas pancreáticas. Para realizar a meta-análise foi feita a busca dos artigos nos sites Embase, Cochrane e PubMed. Dos 755 artigos encontrados, 16 artigos preencheram os critérios de elegibilidade e foram incluídos na meta-análise do tipo comparação de tratamentos múltiplos (MTC). Nossos resultados revelaram que as enzimas Vitacyte e Liberase MTF foram associadas a um pequeno aumento no rendimento das ilhotas [equivalentes de ilhotas (IEQ) /g pâncreas] quando comparadas com a Sevac [diferença média padronizada (95% intervalo de credibilidade) = -2.11 (- 4.09 a -0.29) e -2.20 (-4.26 a -0.31), respectivamente]. Contudo, as demais comparações de enzimas não mostraram nenhuma diferença significativa em relação ao rendimento de ilhotas. Além disso, nos desfechos pureza e viabilidade não foi verificado diferenças significativas entre nenhuma das enzimas de digestão analisadas. Assim, a nossa metaanálise MTC sugere que as enzimas de digestão disponíveis para o isolamento de ilhotas possuem eficiência semelhante em relação a rendimento de ilhotas, pureza e viabilidade. / Islet transplantation, as a treatment for brittle type 1 diabetes mellitus (DM1), has progressed considerably over the last 12 years. In this period, approximately 750 patients were transplanted in different centers, with promising results. However, a large disparity is observed among transplantation centers regarding the success of isolation and post-transplant outcomes. Some factors may explain these disparities, such as donor‘s characteristics, quality of the isolation and local of islet infusion. Islet isolation is the most complex phase of all process, and must be completely standardized. Isolation is performed using a digestion enzyme, with physical and mechanical aid. The Liberase HI enzyme was the enzyme of choice for pancreas digestion because it provided a good quantity and quality of islets. Nevertheless, this enzyme was withdrawn from the market in 2007 because there was a risk of transmission of bovine spongiform encephalopathy. New enzymes have been used and tested for pancreas digestion; however, there is no consensus about which is the digestion enzyme more efficient in human islet isolation. Due to the implementation of the Laboratory of Biology of Human Pancreatic Islets at Hospital de Clínicas de Porto Alegre and to the necessity to define the most efficient enzyme for being used in islet isolation, we consider appropriate to conduct a meta-analysis on the issue. This meta-analysis will be helpful for decision-making in other Centers of pancreatic islet transplantation. To carry out the meta-analysis we performed a comprehensive search for all entries in Pubmed, Embase and Cochrane libraries. Of 755 articles retrieved, 16 articles fulfilled the eligibility criteria and were included in a mixed-treatment comparison (MTC) meta-analysis. Our results revealed that Vitacyte and Liberase MTF were associated with a small increase in islet yield (islet equivalent number/g pancreas) when compared with Sevac enzyme [standardized mean difference (95% credible interval) = -2.11 (-4.09 to -0.29) and -2.20 (-4.26 to -0.31), respectively]. However, all other enzyme comparisons did not show any significant difference regarding islet yield. Moreover, percentages of purity and viability were not significantly different among any of the analyzed digestion enzymes. Thus, our MTC meta-analysis suggests that the digestion enzymes currently being used for islet isolation works with similar efficiency regarding islet yield, purity and viability.

Orientador: Débora Cristina Damasceno / Resumo: Introdução: Durante o período neonatal de ratos, o pâncreas endócrino sofre remodelamento, sendo considerado uma janela crítica de desenvolvimento, que determina a fisiologia do pâncreas no organismo e possíveis doenças na vida adulta, dentre elas o diabete. Na gravidez, o pâncreas sofre adaptações. Por isso, é relevante entender os mecanismos envolvidos nas adaptações das ilhotas pancreáticas frente à associação gravidez e diabete, a qual pode estar relacionada ao quadro de estresse oxidativo e alterações no desempenho reprodutivo materno. Objetivo: Analisar a morfologia das ilhotas pancreáticas e o quadro de estresse oxidativo durante a janela crítica de desenvolvimento pós-natal e na prenhez de ratas com diabete. Materiais e método: Para a indução do diabete, os recém-nascidos fêmeas receberam droga beta (β)-citotóxica (streptozotocin – STZ, 100 mg/kg de peso corporal via subcutânea) no primeiro dia de vida. As fêmeas controle receberam apenas o tampão de citrato. O critério de inclusão para o grupo diabético foi glicemia ≥ 400 mg/dL no dia 5 de vida (D5) e, para o grupo controle, glicemia < 120mg/dL em D5. Os animais de ambos os grupos foram mortos em momentos diferentes: D5, D10, D15, D30 e no dia 18 de prenhez. Foi realizado a coleta de sangue (dosagem sérica de insulina e glucagon) e do pâncreas (análise morfológica). Os anticorpos utilizados para análise imunoistoquímica foram: anti-Pdx-1, anti-Ki-67, anti-insulina, anti-glucagon, anti-somatostatina, anti-superóxido d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. / In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.

Submitted by PMBqBM null (pmbqbm@ufba.br) on 2017-03-28T14:02:01Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Brysa Mariana Dias Silveira_PMBqBM-UFBA.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / Approved for entry into archive by Uillis de Assis Santos (uillis.assis@ufba.br) on 2017-03-28T14:07:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Brysa Mariana Dias Silveira_PMBqBM-UFBA.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T14:07:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Brysa Mariana Dias Silveira_PMBqBM-UFBA.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / FAPESB / O transplante de ilhotas pancreáticas é uma alternativa promissora no tratamento do Diabetes Tipo 1. Entretanto, após o isolamento há perda de uma massa considerável da amostra, prejudicando o sucesso do transplante. O co-cultivo de células tronco mesenquimais , com ilhotas pancreáticas contribui para a melhoria da qualidade do enxerto. O objetivo do trabalho foi a avaliação in vitro do potencial angiogênico do meio condicionado (MC)de células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTMAD), por meio da revascularização e aumento da viabilidade das ilhotas pancreáticas. As células obtidas de 8 amostras de lipoaspirado foram caracterizadas (citometria de fluxo) e testadas quanto ao potencial multilinhagem. Para avaliação do potencial angiogênico , coletou-se MC em normóxia e hipóxia. Utilizou-se modelo com HUVEC para ensaio de migração e proliferação celular e ilhotas de ratos para análise da viabilidade intra ilhota. Análise proteômica foi realizada para avaliação da qualidade do MC. Dados obtidos demonstraram que HUVEC cultivadas na presença dos MC apresentaram aumento da capacidade proliferativa, migratória e redução do índice de apoptose. O MC em normóxia demonstrou maior capacidade angiogênica (p<0.001) e proliferativa (p<0.05) comparado ao MC em hipóxia. Ambos os MC estimularam a migração celular (p<0.01) e induziram a expressão da proteína Akt fosforilada em HUVEC. A presença de fatores de crescimento nos MC deu suporte aos efeitos observados no estudo. Desta forma, pode-se concluir que os MCde CTM-AD apresentam grande potencial para manutenção da integridade de ilhotas pancreáticas recém isoladas, devido aos seus efeitos protetor e angiogênico. / The islet transplantation is a promising alternative in the treatment of Diabetes Type 1. Nevertheless, after isolation there is loss of a part sample, hurting transplant sucess. Co-cultivation of mesenchymal stem cells with pancreatic islets contributes to improving the quality of the graft. The objective of this study was to evaluate in vitro angiogenic potential CM from MSC-AT through revascularisation and increase the viability of pancreatic islets. The cells obtained from 8 lipoaspirate samples were characterized (flow cytometry) and tested for multilineage potential. To evaluate the angiogenic potential, was collected CMs in normoxia and hypoxia. HUVEC model were used to migration and proliferation cell assay and rat islets for analysis intra islet viability. Proteomic analysis was performed to evaluate the CM quality. Results obtained showed that HUVEC cultured with CMs exibith increased proliferative, migratory capacity and reduced apoptosis index. CM in normoxia showed greater angiogenic capacity (p <0.001) and proliferative (p <0.05) compared to the CM in hypoxia. Both CM stimulated cell migration (p <0.01) and induced expression of the phosphorylated Akt protein on HUVEC. The presence of growth factors in CM gave support to the effects seen in this study. Thus, one can conclude that MSC-AT CM have great potential for maintaining the integrity of freshly isolated pancreatic islets due to its protective and angiogenic effects.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-05-29T15:33:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Brysa Mariana Dias Silveira.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-29T15:33:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Brysa Mariana Dias Silveira.pdf: 10348506 bytes, checksum: 834113d4760fa2ead263f8a996b57e9c (MD5) / FAPESB / O transplante de ilhotas pancreáticas é uma alternativa promissora no tratamento do Diabetes Tipo 1. Entretanto, após o isolamento há perda de uma massa considerável da amostra, prejudicando o sucesso do transplante. O co-cultivo de células tronco mesenquimais , com ilhotas pancreáticas contribui para a melhoria da qualidade do enxerto. O objetivo do trabalho foi a avaliação in vitro do potencial angiogênico do meio condicionado (MC)de células tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTMAD), por meio da revascularização e aumento da viabilidade das ilhotas pancreáticas. As células obtidas de 8 amostras de lipoaspirado foram caracterizadas (citometria de fluxo) e testadas quanto ao potencial multilinhagem. Para avaliação do potencial angiogênico , coletou-se MC em normóxia e hipóxia. Utilizou-se modelo com HUVEC para ensaio de migração e proliferação celular e ilhotas de ratos para análise da viabilidade intra ilhota. Análise proteômica foi realizada para avaliação da qualidade do MC. Dados obtidos demonstraram que HUVEC cultivadas na presença dos MC apresentaram aumento da capacidade proliferativa, migratória e redução do índice de apoptose. O MC em normóxia demonstrou maior capacidade angiogênica (p<0.001) e proliferativa (p<0.05) comparado ao MC em hipóxia. Ambos os MC estimularam a migração celular (p<0.01) e induziram a expressão da proteína Akt fosforilada em HUVEC. A presença de fatores de crescimento nos MC deu suporte aos efeitos observados no estudo. Desta forma, pode-se concluir que os MCde CTM-AD apresentam grande potencial para manutenção da integridade de ilhotas pancreáticas recém isoladas, devido aos seus efeitos protetor e angiogênico.

SABOIA, J G. P. Complicações microvasculares no diabetes tipo 1: uma análise comparativa entre pacientes tratados com transplante autólogo não mieloablativo de células-tronco hematopoiéticas versus pacientes tratados com insulinoterapia convencional em cenário de mundo real. 2017.118 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Medicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017 / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-10-13T15:52:25Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_jgps.pdf: 9880536 bytes, checksum: 60dc217a74c40c6be71e8c799ec903eb (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-10-16T11:49:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_jgps.pdf: 9880536 bytes, checksum: 60dc217a74c40c6be71e8c799ec903eb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-16T11:49:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_jgps.pdf: 9880536 bytes, checksum: 60dc217a74c40c6be71e8c799ec903eb (MD5) Previous issue date: 2017-08-17 / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a chronic disease in which the best-established treatment is to control the blood glucose by intensive insulin therapy. However, several studies have shown that, in clinical practice, only a minority of diabetic patients, irrespective of types of insulin or dosing schedules, can maintain HbA1c goal. This poor control is associated with the development of microvascular complications. Autologous Nonmyeloablative Hematopoietic Stem Cell Transplantation (AHSCT) has been proposed as a way to preserve B-cell function, improves metabolic control and, possible, reduces microvascular complications in T1DM patients. However, there is no available data compared AHST to conventional therapy. The aim of this study was to explore the impact on microvascular complications, long term preservation of residual B-cell function and glycemic control of patients with T1DM treated with Autologous Nonmyeloablative Hematopoietic Stem Cell Transplantation (AHSCT) compared to real world conventional therapy. Cross-sectional data of patients treated with AHSCT were compared with patients who received conventional therapy from the BrazDiab1, the largest multicenter observational study in type 1 diabetes mellitus in Brazil. Median duration of diabetes was approximately 8 years in both groups. The presence of microvascular complications, residual β-cell function, through insulin-dose adjusted HbA1c (IDAA1C), A1c and insulin dose of patients were compared. After approximately 8 years of diagnosis, AHSCT- treated patients (n=24) presented no cases of microvascular complications while 21.5% (31/144) had at least one (p<0.005) complications in the conventionally treated group (n=144). Further, no case of nephropathy was reported from thein the AHSCT group while 13.8% were detected in the conventional group of the control population treated with conventional therapy were registered for the condition during the same period (p<0.005). With regard of residual β-cell function, the percentage of individuals with predicted higher C-peptide levels (IDAA1C ≤ 9) was about ten times higher on in the AHSCT group compared with then conventional group (75% vs 7.58.3%) (p<0.001). Among AHSCT patients, 54.1% (13/24) had HbA1c<7.0 compared to 13.1% in the conventional group (p<0.001). Thus, after 8 years of follow-up, patients with newly-diagnosed type 1 diabetes treated with AHSCT presented lower prevalence of microvascular complications, higher residual B-cell function and better glycemic control compared to BrazDiab1 group treated with conventional therapy. These findings support AHSCT to have enhanced therapeutic outcomes for T1DM. Keywords: Diabetes Mellitus, Type 1. Transplantation. Insulin. / O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma doença crônica em que o uso de insulina exógena permance como a única modalidade terapêutica bem reconhecida. Inúmeros estudos demonstram que, independente do desenvolvimento de novas insulinas, da aplicação em bomba de insulina ou sob esquema basal-bolus, o ajuste glicêmico no diabetes permanece um desafio, e apenas uma minoria dos pacientes mantém-se nos alvos desejados. Este mau controle está associado ao desenvolvimento de complicações microvasculares. Por outro lado, o transplante autólogo não mieloablativo de células hematopoiéticas (TMO) tem sido proposto como forma de preservar a função das células beta e melhorar o controle glicêmico em portadores de DM1, levando a uma possível redução na prevalência de complicações microvasculares associadas a doença. Porém, até o momento não havia dados de comparação disponíveis na literatura em relação a insulinoterapia convencional. O objetivo desse estudo foi comparar o impacto da terapia com transplante autólogo não mieloablativo de células hematopoiéticas em pacientes com DM1 em relação às complicações microvasculares, a preservação da função residual das células B a longo prazo e ao controle glicêmico através da comparação com pacientes tratados com insulinoterapia convencional no cenário de mundo real. Foi um estudo transversal em que os dados dos pacientes tratados com TMO foram comparados aos de pacientes que receberam terapia convencional provenientes do BrazDiab1, o maior estudo observacional multicêntrico realizados em portadores de DM1 no Brasil. A mediana de duração do diabetes foi de aproximadamente 8 anos em ambos os grupos. Foi comparada a presença de complicações microvasculares, a função residual de células β através da dose de insulina ajustada para HbA1C (IDAA1C), o controle metabólico através da HbA1c e as doses de insulina dos pacientes. Após aproximadamente 8 anos de diagnóstico, os pacientes tratados com TMO (n = 24) não apresentaram nenhum caso de complicação microvascular, enquanto que 21,5% (31/144) dos pacientes no grupo de terapia convencional apresentou pelo menos uma (p <0,005), com destaque para nefropatia diabética, que foi detectada em 20 pacientes (13,8%) no grupo convencional durante o mesmo período (p <0,005). No que diz respeito à função residual das células β, a porcentagem de indivíduos que mantinham IDAA1C ≤ 9 (valores preditos de peptídeo C estimulados > 300 mmol/L) foi aproximadamente dez vezes maior no grupo TMO em comparação ao grupo convencional (75% vs 8,3%) (p <0,001). Entre os pacientes do grupo TMO, 54,1% (13/24) apresentaram HbA1c <7,0 em comparação a apenas 13,1% no grupo convencional (p <0,001). Assim, após 8 anos de diagnóstico, os pacientes com DM1 recém diagnosticado submetidos a terapia com TMO apresentaram menor prevalência de complicações microvasculares, maior função residual de células B e melhor controle glicêmico comparado ao grupo BrazDiab1 tratado com terapia convencional. Esses achados sugerem o TMO como possível modalidade terapêutica no DM1.

A reposição de ilhotas pancreáticas é uma forma eficaz de se restabelecer a homeostase glicêmica em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 com controle metabólico instável (“DM1 lábil”). Entretanto, ao longo do processo de isolamento, a partir do pâncreas do doador em morte encefálica (ME) e posterior enxerto no receptor, perdas importantes, tanto no número quanto na qualidade das ilhotas, limitam a eficácia do procedimento de transplante. Frequentemente, transplantes sequenciais de dois ou até três pâncreas são necessários para se atingir a independência de insulina exógena. Mesmo que centros transplantadores já reportem boas taxas de sucesso, utilizando apenas um doador por paciente, a escassez de doadores ainda é um forte limitador dessa terapêutica, dificultando a adoção da reposição de ilhotas como prática clínica de rotina para o tratamento de pacientes com DM1 lábil. Entre os fatores responsáveis pela perda das ilhotas, pode-se destacar o intenso estresse inflamatório produzido pela ME do doador. Semelhantemente ao que ocorre com ilhotas pancreáticas, estudos clínicos e experimentais evidenciam que a ME induz danos teciduais irreversíveis em vários outros órgãos e tecidos destinados a transplante, tais como o coração, pulmões, rins e fígado. Órgãos provenientes de doadores vivos, em geral, resultam em desfechos pós-transplante mais favoráveis quando comparados às taxas de sucesso obtidas com órgãos derivados de doadores cadavéricos. Estudos recentes demonstram que a Exendin-4, um análogo do glucagon-like peptide-1 (GLP-1), possui propriedades anti-inflamatórias, pró-proliferativas e de redução da apoptose de células β pancreáticas. Interessantemente, esse mesmo análogo também apresentou efeitos protetores em diversos modelos animais de doenças hepáticas. Sendo assim, nós hipotetizamos que a administração dessa droga a doadores cadavéricos poderia amenizar os danos causados pela ME nas ilhotas pancreáticas e no tecido hepático, preservando a qualidade desses tecidos para uso em transplantes. A fim de testar a hipótese sugerida, desenvolveram-se dois estudos em modelo murino de ME. A administração de Exendin-4 a animais com ME foi avaliada em relação a diversos parâmetros de dano e qualidade teciduais, além de marcadores inflamatórios e expressão gênica de genes ligados a inflamação e estresse. Grupos de animais que não sofreram ME ou que sofreram ME mas não receberam a droga foram utilizados como controles nesses experimentos. Os resultados gerados indicam que a administração de Exendin-4 a ratos em ME melhora a viabilidade e a função de ilhotas pancreáticas isoladas. Isso foi acompanhado por uma redução na expressão gênica da citocina pró-inflamatória Interleukin-1 beta (Il1b) no tecido pancreático. Além disso, o tratamento com Exendin-4 também modulou a expressão de genes que codificam para proteínas de controle do estresse oxidativo celular, a superoxide dismutase-2 (Sod2) e a uncoupling protein-2 (Ucp2). Genes relacionados ao estresse do retículo endoplasmático, C/EBP Homologous Protein (Chop) e Heat Shock 70kDa Protein 5 (Hspa5), também conhecido como immunoglobulin heavy-chain binding protein (BiP), tiveram suas expressões reduzidas em ilhotas isoladas de animais tratados. Recentemente, tem sido demonstrado que o estresse do retículo endoplasmático participa no mecanismo de morte celular da célula β induzida por citocinas. Assim, nós sugerimos que o efeito protetor da Exendin-4 contra os danos causados pela ME provavelmente se dê através de uma diminuição da inflamação e do estresse oxidativo no ambiente pancreático, o que se traduz em uma menor ativação do estresse do retículo endoplasmático na célula β, consequentemente, reduzindo a morte celular nas ilhotas isoladas. Em ressonância com os efeitos benéficos observados nas ilhotas, animais tratados também apresentaram níveis reduzidos de marcadores de dano hepático circulantes, além de uma diminuição significativa nas taxas de apoptose no tecido hepático. Os resultados aqui apresentados, portanto, sugerem que a administração de Exendin-4 a doadores cadavéricos de múltiplos órgãos tem o potencial para minimizar os efeitos deletérios causados pela ME nas ilhotas pancreáticas e no fígado. O GLP-1, uma incretina gastrointestinal secretada pelas células L do intestino delgado, estimula a secreção de insulina dependente de glicose nas células β pancreáticas. Estudos recentes demonstram que o GLP-1 é capaz de proteger as células β do estresse oxidativo e dos danos inflamatórios, os quais são considerados fatores importantes não apenas na mediação dos danos teciduais induzidos pela ME, mas também na patogênese do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Tal efeito estimulatório dependente de glicose pode ser explorado como uma estratégia terapêutica alternativa para o tratamento de pacientes com DM2, por reestabelecer a homeostase glicêmica e eliminar o risco de hipoglicemia associada à injeção exógena de insulina. Recentemente, vários ensaios clínicos confirmaram os efeitos benéficos de análogos do GLP-1, que incluem um melhor controle glicêmico e perda de peso, resultando na aprovação de tais análogos para o tratamento clínico do DM2. No entanto, os mecanismos moleculares que medeiam a estimulação da secreção de insulina pelo GLP-1 não são totalmente conhecidos. Isso gera a necessidade do desenvolvimento de estudos bioquímicos detalhados para elucidação das vias de transdução de sinal intracelulares responsáveis pela execução dos efeitos estimulatórios do GLP-1 na secreção de insulina. Devido à dependência de glicose para a ativação do seu efeito estimulatório, nós hipotetizamos que o GLP-1 possa atuar na regulação da atividade bioenergética de metabolismo da glicose na célula β. Utilizando-se da linhagem celular clonal secretora de insulina, BRIN-BD11 e ilhotas isoladas de camundongos, nós demonstramos que a sinalização através do receptor do GLP-1 (GLP-1R) promove a glicólise e, consequentemente, aumenta o conteúdo de ATP intracelular. Os dados deste estudo sugerem que isso provavelmente seja mediado pela ativação da mammalian Target of Rapamycin (mTOR), resultando na acumulação do fator de transcrição Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), que por sua vez promove um aumento na expressão gênica de genes que codificam para enzimas da via glicolítica. Sugere-se que essa indução na taxa glicolítica possa reforçar o acoplamento metabólico entre estímulo e secreção, resultando no aumento da secreção de insulina dependente de glicose mediada por GLP-1. / Replacement of pancreatic islets is an effective way to restore glucose homeostasis in patients with type 1 diabetes mellitus with unstable metabolic control ("T1DM labile"). However, along the isolation procedure from brain dead organ donors and later recipient engraftment, significant losses, both in number and quality of islets take place, limiting the effectiveness of islet transplantation as a whole. Often, sequential transplants of two or three donors are necessary in order to achieve exogenous insulin independence. Even with recent advances and transplant centers already reporting good success rates using only one donor per patient, the shortage of donors is still a strong limitation of this therapy, hindering the adoption of islets reposition as routine clinical practice for the treatment of patients with T1DM labile. Several factors are responsible for islets loss, including intense inflammatory stress produced by the donor’s brain death (BD). Similarly to what happens with pancreatic islets, clinical and experimental studies show that BD induces irreversible tissue damage in several other organs and tissues destined for transplantation, such as heart, lungs, kidneys and liver. In general, organs from living donors result in more favorable post-transplant outcomes when compared to organs procured from cadaveric donors. Recent studies indicate that Exendin-4, a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog, has anti-inflammatory, proliferative and anti-apoptotic properties in pancreatic β cells. Interestingly, this analog has also shown protective effects in several animal models of liver disease. Thus, we hypothesized that administration of this drug to cadaveric donors could mitigate damage caused by BD in the pancreatic islets and liver tissue. Such treatment could preserve islets and liver quality for use in transplantation and possibly improve outcomes. In order to test the suggested hypothesis, we developed two studies using a rat model of BD. Administration of Exendin-4 to animals that underwent experimental BD was evaluated against various parameters of tissue damage and quality, as well as inflammatory markers and gene expression of genes linked to inflammation and stress. Groups of animals that did not undergo BD or that underwent BD, but have not been given the drug were used as controls in these experiments. Results generated in these studies indicate that administration of Exendin-4 to brain dead rats improves the viability and function of isolated pancreatic islets. This was accompanied by a decrease in gene expression of the pro-inflammatory cytokine Interleukin-1 beta (Il1b) in the pancreatic tissue. In addition, treatment with Exendin- 4 also modulated the expression of genes encoding cellular oxidative stress control proteins, the superoxide dismutase-2 (Sod2), and uncoupling protein-2 (Ucp2). Genes related to stress of the endoplasmic reticulum (ER), C/EBP Homologous Protein (Chop) and Heat Shock 70kDa Protein 5 (Hspa5), also known as heavy-chain binding protein immunoglobulin (BiP), were found to be reduced in islets isolated from treated animals. Recently, ER stress has been shown to participate in the mechanism of β cell death induced by pro-inflammatory cytokines. Thus, we suggest that the protective effect of Exendin-4 against damage caused by BD probably occurs through a decrease in inflammation and oxidative stress in the pancreatic environment, which translates into a lower activation of ER stress in the β cells, hence reducing cell death of isolated islets. In resonance with the beneficial effects observed in islets, treated animals also showed reduced levels of circulating liver damage markers, and a significant decrease in the rate of apoptosis in the liver. Our results, therefore, suggest that administration of Exendin-4 to cadaveric organ donors has the potential to minimize the deleterious effects caused by BD in the pancreatic islets and liver. GLP-1, a gastrointestinal incretin secreted by the L-cells of the small intestine, stimulates insulin secretion in a glucose-dependent manner from pancreatic β cells. Recent studies have shown that GLP-1 is able to protect β cells from oxidative stress and inflammatory damage, which are considered important factors not only in mediating tissue damage induced by BD, but also in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Such glucose-dependent stimulatory effect can be exploited as an alternative therapeutic strategy for the treatment of patients with T2DM in order to reestablish glucose homeostasis and to eliminate the risk of hypoglycemia associated with exogenous insulin injection. Recently, several clinical trials have confirmed the beneficial effects of GLP-1 analogs, which include better glycemic control and weight loss, resulting in the approval of such analogs for the clinical treatment of T2DM. However, the molecular mechanisms that mediate stimulation of insulin secretion by GLP-1 are not fully characterized. Thus, detailed biochemical studies aiming at elucidating intracellular signal transduction pathways responsible for the execution of GLP-1 stimulatory effects on insulin secretion are of high interest. Due to glucose-dependence for activation of its stimulatory effect, we hypothesized that GLP-1 may act in the regulation of β cell bioenergetics and glucose metabolism. Using the clonal rat insulin-secreting cell line BRIN-BD11, and isolated mouse islets, we have demonstrated that signaling via the GLP-1 receptor (GLP-1R) promotes glycolysis and consequently increases intracellular ATP content. Our data suggest that this is likely mediated by activation of the mammalian Target of Rapamycin (mTOR), resulting in the accumulation of the transcription factor Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), which, in turn, promotes gene expression of genes that encode for glycolytic enzymes. We suggest that such increase in the glycolytic rate strengthens coupling between metabolic stimulus and secretion, ultimately resulting in exacerbated glucose-induced insulin secretion.

O transplante de ilhotas, como tratamento do diabetes mellitus tipo 1 (DM1) “lábil”, tem progredido consideravelmente ao longo dos últimos 12 anos. Nesse período, aproximadamente 750 pacientes foram transplantados em diversos centros, com resultados promissores. No entanto, é evidenciada uma grande disparidade entre os centros de transplantes em relação ao sucesso do isolamento e aos desfechos póstransplante. Alguns fatores podem explicar estas disparidades, como características do doador, qualidade do isolamento e o local da infusão das ilhotas. O isolamento das ilhotas é a fase mais complexa de todo o processo, devendo ser totalmente padronizada. O isolamento é feito com uma enzima de digestão, com auxílio físico e mecânico. A enzima Liberase HI era a enzima de escolha para a digestão do pâncreas, pois proporcionava uma boa quantidade e qualidade de ilhotas. No entanto, esta foi retirada do mercado em 2007, pois havia o risco de transmissão de encefalopatia espongiforme. Novas enzimas têm sido utilizadas e estão sendo testadas para a digestão do pâncreas; entretanto, não existe um consenso de qual enzima de digestão é mais eficiente no isolamento de ilhotas humanas.Devido à implantação do Laboratório de Biologia das Ilhotas Pancreáticas Humanas no Hospital de Clínicas de Porto Alegre e a necessidade da definição da enzima mais eficiente a ser utilizada no isolamento das ilhotas, consideramos adequada a realização de uma meta-análise sobre o tema. Esta metaanálise será útil para a tomada de decisão de outros Centros de isolamento e transplante de ilhotas pancreáticas. Para realizar a meta-análise foi feita a busca dos artigos nos sites Embase, Cochrane e PubMed. Dos 755 artigos encontrados, 16 artigos preencheram os critérios de elegibilidade e foram incluídos na meta-análise do tipo comparação de tratamentos múltiplos (MTC). Nossos resultados revelaram que as enzimas Vitacyte e Liberase MTF foram associadas a um pequeno aumento no rendimento das ilhotas [equivalentes de ilhotas (IEQ) /g pâncreas] quando comparadas com a Sevac [diferença média padronizada (95% intervalo de credibilidade) = -2.11 (- 4.09 a -0.29) e -2.20 (-4.26 a -0.31), respectivamente]. Contudo, as demais comparações de enzimas não mostraram nenhuma diferença significativa em relação ao rendimento de ilhotas. Além disso, nos desfechos pureza e viabilidade não foi verificado diferenças significativas entre nenhuma das enzimas de digestão analisadas. Assim, a nossa metaanálise MTC sugere que as enzimas de digestão disponíveis para o isolamento de ilhotas possuem eficiência semelhante em relação a rendimento de ilhotas, pureza e viabilidade. / Islet transplantation, as a treatment for brittle type 1 diabetes mellitus (DM1), has progressed considerably over the last 12 years. In this period, approximately 750 patients were transplanted in different centers, with promising results. However, a large disparity is observed among transplantation centers regarding the success of isolation and post-transplant outcomes. Some factors may explain these disparities, such as donor‘s characteristics, quality of the isolation and local of islet infusion. Islet isolation is the most complex phase of all process, and must be completely standardized. Isolation is performed using a digestion enzyme, with physical and mechanical aid. The Liberase HI enzyme was the enzyme of choice for pancreas digestion because it provided a good quantity and quality of islets. Nevertheless, this enzyme was withdrawn from the market in 2007 because there was a risk of transmission of bovine spongiform encephalopathy. New enzymes have been used and tested for pancreas digestion; however, there is no consensus about which is the digestion enzyme more efficient in human islet isolation. Due to the implementation of the Laboratory of Biology of Human Pancreatic Islets at Hospital de Clínicas de Porto Alegre and to the necessity to define the most efficient enzyme for being used in islet isolation, we consider appropriate to conduct a meta-analysis on the issue. This meta-analysis will be helpful for decision-making in other Centers of pancreatic islet transplantation. To carry out the meta-analysis we performed a comprehensive search for all entries in Pubmed, Embase and Cochrane libraries. Of 755 articles retrieved, 16 articles fulfilled the eligibility criteria and were included in a mixed-treatment comparison (MTC) meta-analysis. Our results revealed that Vitacyte and Liberase MTF were associated with a small increase in islet yield (islet equivalent number/g pancreas) when compared with Sevac enzyme [standardized mean difference (95% credible interval) = -2.11 (-4.09 to -0.29) and -2.20 (-4.26 to -0.31), respectively]. However, all other enzyme comparisons did not show any significant difference regarding islet yield. Moreover, percentages of purity and viability were not significantly different among any of the analyzed digestion enzymes. Thus, our MTC meta-analysis suggests that the digestion enzymes currently being used for islet isolation works with similar efficiency regarding islet yield, purity and viability.

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. / In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.