A regulação do processo de maturação e manutenção do metabolismo das células de Sertoli é fundamental para a promoção adequada da fertilidade masculina. Além dos hormônios andrógenos, com a testosterona (T), os retinóides possuem papel fundamental na regulação e manutenção da espermatogênese. Sabe-se que além dos efeitos individuais, os retinóides interagem com outros hormônios, modulando suas ações. Este trabalho teve como objetivos estudar as possíveis interações nas vias de sinalização do retinol e da T em rápidas respostas mediadas pela membrana plasmática, verificando a influência destes hormônios sobre o influxo de cálcio, analisando a influência dos canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L (CCDV-L) e dos canais de potássio dependentes de voltagem (Kv) em testículos de ratos imaturos de 10 dias de idade. Também foi objetivo deste trabalho analisar a resposta eletrofisiológica destes hormônios em cultura primária de células de Sertoli. Na técnica de influxo de cálcio foi realizada curva de dose-resposta, onde os tecidos foram tratados com retinol ou testosterona, por 2 minutos, nas concentrações 10-12, 10-9 e 10-6 M e 10-9 e 10-6 M, respectivamente. Após definido a concentração para os demais experimentos, foi analisado a interação entre estes dois hormônios. Em seguida foi verificada a influência dos canais CCDV-L e Kv, através da utilização dos bloqueadores nifedipina e cloreto de tetraetilamônio (TEA), respectivamente. Também foi realizada a técnica de eletrofisiologia Patch Clamp em whole cell onde foi analisada a atividade das correntes de potássio através da ação não clássica destes hormônios. Concluímos que o retinol estimula o influxo de cálcio em testículos de ratos imaturos. Este efeito estimulatório ocorre através dos CCDV-L e em parte através dos canais Kv. A T também estimula o influxo de cálcio em testículos de ratos imaturos. Este efeito estimulatório ocorre através dos canais Kv e em parte através dos CCDV- L. Além disso, o retinol e a T estimulam as correntes do íon potássio através da abertura dos canais de Kv das células de Sertoli imaturas de cultura primária. O retinol e a T interagem entre si, agindo de forma sinérgica, estimulando ainda mais o influxo de cálcio quando aplicados simultaneamente, demonstrando que sua ação é 6 desencadeada pela abertura de diferentes tipos de canais iônicos.

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=6 células de Sertoli). A aplicação tópica de Tolbutamida (10 μM) bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando uma despolarização de –41,0± 0,47mV variou até -39,0 ± 2,02mV, aos 120 segundos após a aplicação do Isoproterenol (p>0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. / Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p<0.001) (n=6Sertoli cells). Topical application of Tolbutamide (10μM) blocked the action of Isoproterenol (2μM), causing a depolarization of -41.0±0.47 mV ranged up to-39.0± 2.02 mV at 120 seconds after application of Isoproterenol (p>0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. / In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=6 células de Sertoli). A aplicação tópica de Tolbutamida (10 μM) bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando uma despolarização de –41,0± 0,47mV variou até -39,0 ± 2,02mV, aos 120 segundos após a aplicação do Isoproterenol (p>0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. / Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p<0.001) (n=6Sertoli cells). Topical application of Tolbutamide (10μM) blocked the action of Isoproterenol (2μM), causing a depolarization of -41.0±0.47 mV ranged up to-39.0± 2.02 mV at 120 seconds after application of Isoproterenol (p>0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. / In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=6 células de Sertoli). A aplicação tópica de Tolbutamida (10 μM) bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando uma despolarização de –41,0± 0,47mV variou até -39,0 ± 2,02mV, aos 120 segundos após a aplicação do Isoproterenol (p>0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. / Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p<0.001) (n=6Sertoli cells). Topical application of Tolbutamide (10μM) blocked the action of Isoproterenol (2μM), causing a depolarization of -41.0±0.47 mV ranged up to-39.0± 2.02 mV at 120 seconds after application of Isoproterenol (p>0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. / In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.

Hipertensão e Diabetes são dois dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de aterosclerose e doença da artéria coronária. Tais enfermidades aumentam o risco cardiovascular a índices muito elevados, e são acompanhadas por uma alteração fisiopatológica comum, que é o remodelamento vascular acelerado, caracterizado pelo desarranjo na regulação da atividade das metaloproteinases (MMPs) associado ao aumento do \"stress\" oxidativo. Um dos modelos mais semelhantes ao quadro de hipertensão renovascular em humanos é o modelo de hipertensão renovascular unilateral (2R-1C), que é produzido pelo clampeamento de uma das artérias renais, e manutenção do rim contra lateral intacto. Por outro lado, a Aloxana tem sido extensivamente utilizada como modelo de indução química dos tipos de diabetes não-insulino dependentes. Este remodelamento vascular acelerado presente na hipertensão bem como na diabetes está associado a ativação de um grupo de endopeptidases zinco-dependentes denominadas metaloproteinases, que têm sido implicadas no remodelamento vascular subjacente à aterosclerose. MMPs têm sido reconhecidas como um grupo de enzimas envolvidas na degradação de componentes da matriz extracelular em processo fisiológicos, bem como patológicos, e uma aumentada expressão e atividade de MMP pode resultar num remodelamento cardiovascular exacerbado e aterosclerose da artéria coronária. Lercanidipina é um bloqueador de canal de cálcio (CCB) da classe das diidropiridinas usado para tratamento da hipertensão. Além de reduzir a pressão arterial, há evidências de que a lercanidipina tenha ações pleiotrópicas que possam significativamente contribuir para os benefícios que ela produz na terapia da hipertensão. É possível que a lercanidipina e outros CCB com efeitos antioxidantes reduzam a atividade/ expressão das MMPs na hipertensão e diabetes. Baseado nestas informações, o os objetivos do nosso trabalho foram primeiramente, verificar possíveis aumentos de \"stress\" oxidativo e de MMP-2 (atividade e expressão gênica) nos vasos de ratos nos modelos de hipertensão arterial renovascular e diabetes mellitus citados. Objetivamos ainda estudar os efeitos do tratamento com lercanidipina sobre as alterações mencionadas anteriormente. E como terceiro objetivo, buscamos estudar os efeitos do tratamento com lercanidipina sobre a disfunção vascular presentes nos dois modelos experimentais de hipertensão arterial e de diabetes mellitus. Os resultados deste estudo mostraram que o tratamento com lercanidipina reduziu a pressão arterial sistólica nos ratos hipertensos e diabéticos. Além disso os animais tratados com tratamento com lercanidipina apresentaram uma redução significativa nos níveis plasmáticos de malondialdeído e da atividade da MMP-2. Os animais diabéticos tratados com lercanidipina, apresentaram ainda um aumento da expressão de RNAm de TIMP-2. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a lercanidipina produziu efeitos antihipertensivos e reverteu a disfunção endotelial associada com a hipertensão 2R-1C e diabetes mellitus induzida pela aloxana, provavelmente através de mecanismos envolvendo efeitos antioxidantes, o que levaria a uma menor ativação da MMP-2. Nossos achados sugerem que as drogas antihipertensivas com atividade antioxidante podem inibir a ativação da MMP-2 e colaborar na prevenção a aterosclerose. / Hypertension and Diabetes are two of the main factors of risk for the development of atherosclerosis and disease of the coronary artery. Such diseases increase the cardiovascular risk to the high elevated levels, and are followed by a common physiopatologic alteration, that is the accelarated vascular remodeling, characterized of the disarrangement in the regulation of the activity metalloproteinases (MMPs) associated to the increased of oxidative stress. One of the models most similar to the renovascular hypertension in humans, it is the model of unilateral renovascular hypertension (2R-1C), that is produced by the clamping of one of the renal arteries, and maintenance of intact contralateral kidney. Moreover, Alloxan has been exclusively used as a model of chemical induction of the diabetes not-insulin dependent. This vascular accelerated remodeling present in the hypertension as well in the diabetes is associated with a group of endopeptidases zinc-dependents recognized as metalloproteinases, that have been applied in a vascular remodeling associated to the atherosclerosis. MMPs have been recognized as a group of enzymes involved on the degradation of the components of extracellular matrix in physiologic process, as in the pathologic events, and the increased expression and the activity of MMP can result in an accelerated cardiovascular remodeling and atherosclerosis in the coronary artery. Lercanidipine is a calcium channel blocker (CCB) of the dihydropiridines used for the treatment of hypertension. Beyond reduding the arterial pressure, there is evidences that lercanidipine has pleiotropic actions can significantly contribute for the benefits that its produces in the therapy of hypertension. It is possible that lercanidipine and another CCBs with antioxidant effects reduce the activity/ expression of the MMPs in the hypertension and diabetes. Based in these information, the objectives of our work had been first, to verify possible increases of oxidative stress and MMP-2 (activity and expression) in the vases of rats in the models of cited renovascular arterial hypertension and diabetes mellitus. We still objective to study the effects of the treatment with lercanidipine on the alterations previously mentioned. And as third objective, we search to study the effect of the treatment with lercanidipine on the vascular dysfunction in the two experimental models of arterial hypertension and diabetes mellitus. The results of this study had shown that the treatment with lercanidipine reduced the systolic arterial pressure in hypertensive and diabetic rats. Morever, the animals treated with lercanidipine presented a significant reduction in the malondialdehyde levels and in the activity of MMP-2. The treated diabetic animals with lercanidipine, had still presented an increase of the expression of RNAm of TIMP-2. In conclusion, our result suggest that lercanidipine produced antihypertensive effects and reverted the endothelial dysfunction associated with the induced hypertension 2R-1C and diabetes mellitus, probably through mechanisms involving antioxidant effects, what it would lead to a lesser activation of MMP-2. Our findings suggest that the antihypertensive drugs with antioxidant activity can inhibit the activation of MMP-2 and collaborate in the prevention of atherosclerosis.

O processo de fertilização está intimamente relacionado ao íon cálcio. Há relatos que bloqueadores de canais de íons cálcio voltagem-dependentes, utilizados na terapia anti-hipertensiva, podem levar à infertilidade masculina, mas poucos relatos são os de seus efeitos sobre o oócito. O objetivo deste experimento foi verificar a influência dos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L, verapamil, nifedipina e diltiazem, sobre os gametas masculino e feminino. Machos e fêmeas hamsters foram utilizados em testes in vivo e in vitro. Foram realizados tratamentos in vitro no Experimento I: espermatozóides foram capacitados em meios contendo três concentrações de bloqueadores de canais de cálcio e avaliados quanto à capacitação espermática, hiperatividade e fertilidade in vitro. Oócitos foram tratados previamente por 30 minutos com quatro concentrações de antagonistas de canais de cálcio e submetidos a teste de fertilização in vitro e à avaliação do comportamento dos grânulos corticais. No Experimento II, os bloqueadores de canais de cálcio foram administrados, duas vezes ao dia, por 60 dias nos machos e por 30 dias nas fêmeas, que foram analisados pela fertilidade in vivo, capacitação e hiperatividade espermáticas, fecundação in vitro e exocitose dos grânulos corticais, e microscopia eletrônica de transmissão nos oócitos tratados in vivo. No Experimento III, a concentração intracelular de cálcio foi mensurada em espermatozóides e oócitos na presença dos bloqueadores de canais de cálcio. Como resultados, no Experimento I, os fármacos atuaram de forma dose-dependente, os espermatozóides tratados apresentaram menor taxa de capacitação espermática, de hiperatividade e de fecundação in vitro. Os oócitos tratados mostraram menor taxa de fertilização in vitro em relação ao controle e, nos grupos verapamil e diltiazem, exocitose parcial dos grânulos corticais e ativação não completa dos oócitos. O Experimento II demonstrou que os machos dos grupos tratados tiveram menor taxa de capacitação espermática, de hiperatividade e de fertilidade in vitro em relação ao grupo controle, e nos grupos verapamil e nifedipina houve uma redução da fertilidade refletida no número de fêmeas paridas em relação ao grupo controle e diltiazem. A fecundação in vivo das fêmeas tratadas não variou entre os grupos; porém, a taxa de fertilização in vitro dos oócitos de fêmeas tratadas in vivo com os antagonistas foi menor em relação ao controle; tanto a exocitose dos grânulos corticais quanto a microscopia eletrônica não foram detectadas diferenças entre os grupos. As ninhadas de fêmeas que receberam a terapia no início da gestação apresentaram menor peso ao nascimento e maior taxa de mortalidade. No Experimento III, notou-se que os fármacos causaram um bloqueio do influxo de cálcio extracelular tanto em espermatozóides como em oócitos. Concluiu-se que, tanto espermatozóides como oócitos, possuem em sua membrana plasmática canais de íons cálcio sensíveis aos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L. Nos tratamentos in vitro, estes fármacos atuaram negativamente na capacidade de fecundação dos espermatozóides e dos oócitos. A terapia com os bloqueadores de canais de cálcio reduziu a fertilidade nos machos, mas não nas fêmeas. A administração dos bloqueadores no início da gestação causou efeitos teratogênicos / Fertilization process is closely related with calcium ion. There are reports about voltage-dependent calcium ion channel blockers of anti-hypertension therapeutic use causing male infertility, but there are few reports about such effects on the oocyte. The main goal of this experiment was to check the influence of verapamil, nifedipine and diltiazem (L-type voltage-dependent calcium ion channel blockers) on spermatozoa and oocytes. Male and female hamsters were used for in vivo and in vitro experiment. In vitro treatments were preformed in the Experiment I, in which: spermatozoa were capacitated in three concentrations of the three calcium ion channel blockers and they were evaluated for sperm capacitation, hyperactivity and in vitro fertility. Oocytes were incubated for 30 minutes in four concentrations of the same calcium channel antagonists and submitted to in vitro fertilization and evaluation of cortical granules exocytosis. In the Experiment II, calcium channel blockers were supplied twice per day to males during 60 days and to females during 30 days. After this period, drug effects on the animals were evaluated through in vivo fertility, sperm capacitation and hyperactivity, in vitro fertilization, cortical granules exocytosis and transmission electronic microscopy of in vivo treated oocytes. In the Experiment III, the intracellular calcium concentrations were measured in spermatozoa and oocytes in the presence of calcium ion channel blockers. As results, in the Experiment I, the antagonists presented dose-dependent effects, affecting sperm capacitation rate, hyperactivity and in vitro fertilization rate on treated spermatozoa. Treated oocytes presented lower in vitro fertilization rate when compared to the control group and, in the verapamil and diltiazem groups, cortical granules exocytosis was partial and oocyte activation was not concluded. Experiment II showed that male hamsters of treatment groups presented lower sperm capacitation rate, hyperactivity and in vitro fertilization rate and there were fewer pregnant females, demonstrating a reducing male fertility in verapamil and nifedipine groups when compared to the control and diltiazem groups. In vivo fertility of treated females did not change among groups; however, in vitro fertilization rates in oocytes of calcium antagonists in vivo treated females were lower. Nor cortical granules exocytosis neither electronic microscopy detected differences among groups. Progeny of females that received the therapy in the beginning of pregnancy presented lower birth weight and higher mortality rate. In the Experiment III, the antagonists blocked extracellular calcium influx in spermatozoa and in oocytes. It is concluded that, there were calcium ion channels with sensibility to L-type voltage-dependent calcium ion channel blockers in the plasmatic membrane of spermatozoa and oocytes. In in vitro treatments, these antagonists influenced negatively spermatozoa and oocytes capacity of fertilization. Calcium channel blocker therapy reduced the fertility in males, but not in females. Calcium channel blockers supplied in the beginning pregnancy caused teratogenic effects

O processo de fertilização está intimamente relacionado ao íon cálcio. Há relatos que bloqueadores de canais de íons cálcio voltagem-dependentes, utilizados na terapia anti-hipertensiva, podem levar à infertilidade masculina, mas poucos relatos são os de seus efeitos sobre o oócito. O objetivo deste experimento foi verificar a influência dos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L, verapamil, nifedipina e diltiazem, sobre os gametas masculino e feminino. Machos e fêmeas hamsters foram utilizados em testes in vivo e in vitro. Foram realizados tratamentos in vitro no Experimento I: espermatozóides foram capacitados em meios contendo três concentrações de bloqueadores de canais de cálcio e avaliados quanto à capacitação espermática, hiperatividade e fertilidade in vitro. Oócitos foram tratados previamente por 30 minutos com quatro concentrações de antagonistas de canais de cálcio e submetidos a teste de fertilização in vitro e à avaliação do comportamento dos grânulos corticais. No Experimento II, os bloqueadores de canais de cálcio foram administrados, duas vezes ao dia, por 60 dias nos machos e por 30 dias nas fêmeas, que foram analisados pela fertilidade in vivo, capacitação e hiperatividade espermáticas, fecundação in vitro e exocitose dos grânulos corticais, e microscopia eletrônica de transmissão nos oócitos tratados in vivo. No Experimento III, a concentração intracelular de cálcio foi mensurada em espermatozóides e oócitos na presença dos bloqueadores de canais de cálcio. Como resultados, no Experimento I, os fármacos atuaram de forma dose-dependente, os espermatozóides tratados apresentaram menor taxa de capacitação espermática, de hiperatividade e de fecundação in vitro. Os oócitos tratados mostraram menor taxa de fertilização in vitro em relação ao controle e, nos grupos verapamil e diltiazem, exocitose parcial dos grânulos corticais e ativação não completa dos oócitos. O Experimento II demonstrou que os machos dos grupos tratados tiveram menor taxa de capacitação espermática, de hiperatividade e de fertilidade in vitro em relação ao grupo controle, e nos grupos verapamil e nifedipina houve uma redução da fertilidade refletida no número de fêmeas paridas em relação ao grupo controle e diltiazem. A fecundação in vivo das fêmeas tratadas não variou entre os grupos; porém, a taxa de fertilização in vitro dos oócitos de fêmeas tratadas in vivo com os antagonistas foi menor em relação ao controle; tanto a exocitose dos grânulos corticais quanto a microscopia eletrônica não foram detectadas diferenças entre os grupos. As ninhadas de fêmeas que receberam a terapia no início da gestação apresentaram menor peso ao nascimento e maior taxa de mortalidade. No Experimento III, notou-se que os fármacos causaram um bloqueio do influxo de cálcio extracelular tanto em espermatozóides como em oócitos. Concluiu-se que, tanto espermatozóides como oócitos, possuem em sua membrana plasmática canais de íons cálcio sensíveis aos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L. Nos tratamentos in vitro, estes fármacos atuaram negativamente na capacidade de fecundação dos espermatozóides e dos oócitos. A terapia com os bloqueadores de canais de cálcio reduziu a fertilidade nos machos, mas não nas fêmeas. A administração dos bloqueadores no início da gestação causou efeitos teratogênicos / Fertilization process is closely related with calcium ion. There are reports about voltage-dependent calcium ion channel blockers of anti-hypertension therapeutic use causing male infertility, but there are few reports about such effects on the oocyte. The main goal of this experiment was to check the influence of verapamil, nifedipine and diltiazem (L-type voltage-dependent calcium ion channel blockers) on spermatozoa and oocytes. Male and female hamsters were used for in vivo and in vitro experiment. In vitro treatments were preformed in the Experiment I, in which: spermatozoa were capacitated in three concentrations of the three calcium ion channel blockers and they were evaluated for sperm capacitation, hyperactivity and in vitro fertility. Oocytes were incubated for 30 minutes in four concentrations of the same calcium channel antagonists and submitted to in vitro fertilization and evaluation of cortical granules exocytosis. In the Experiment II, calcium channel blockers were supplied twice per day to males during 60 days and to females during 30 days. After this period, drug effects on the animals were evaluated through in vivo fertility, sperm capacitation and hyperactivity, in vitro fertilization, cortical granules exocytosis and transmission electronic microscopy of in vivo treated oocytes. In the Experiment III, the intracellular calcium concentrations were measured in spermatozoa and oocytes in the presence of calcium ion channel blockers. As results, in the Experiment I, the antagonists presented dose-dependent effects, affecting sperm capacitation rate, hyperactivity and in vitro fertilization rate on treated spermatozoa. Treated oocytes presented lower in vitro fertilization rate when compared to the control group and, in the verapamil and diltiazem groups, cortical granules exocytosis was partial and oocyte activation was not concluded. Experiment II showed that male hamsters of treatment groups presented lower sperm capacitation rate, hyperactivity and in vitro fertilization rate and there were fewer pregnant females, demonstrating a reducing male fertility in verapamil and nifedipine groups when compared to the control and diltiazem groups. In vivo fertility of treated females did not change among groups; however, in vitro fertilization rates in oocytes of calcium antagonists in vivo treated females were lower. Nor cortical granules exocytosis neither electronic microscopy detected differences among groups. Progeny of females that received the therapy in the beginning of pregnancy presented lower birth weight and higher mortality rate. In the Experiment III, the antagonists blocked extracellular calcium influx in spermatozoa and in oocytes. It is concluded that, there were calcium ion channels with sensibility to L-type voltage-dependent calcium ion channel blockers in the plasmatic membrane of spermatozoa and oocytes. In in vitro treatments, these antagonists influenced negatively spermatozoa and oocytes capacity of fertilization. Calcium channel blocker therapy reduced the fertility in males, but not in females. Calcium channel blockers supplied in the beginning pregnancy caused teratogenic effects