Dans ce mémoire nous discutons le développement de l’électrode de travail d’un bioréacteur électrochimique, dispositif permettant de synthétiser suivant un procédé dit de « Chimie Verte » des substances chimiques à haute valeur ajoutée. L’électrode de travail étant le siège de la synthèse électrocatalytique en jeu, l’optimisation de sa structure a été étudiée dans le but de maximiser l’aire de sa surface active. L’élaboration d’électrodes macroporeuses hautement organisées et de taille définie par les dimensions du prototype du réacteur pilote, a pu être obtenue en utilisant la méthode de Langmuir-Blodgett pour assembler le cristal colloïdal servant de template. La formation de ce dépôt organisé de colloïdes est suivie de l’électrodéposition du matériau d’électrode puis de la dissolution du template afin de révéler la structure macroporeuse. L’immobilisation de l’intégralité du matériel bio-électrocatalytique à l’intérieur des pores a été investiguée dans le but de prévenir la pollution du milieu contenant le produit final d’électrosynthèse par un des constituants redox et d’augmenter la durée de vie du dispositif. Ainsi, des couches ultra-minces de silice électrogénérée et des matrices de polymère électrodéposé ont été étudiées dans le but de préserver et d’optimiser l’activité enzymatique du système qu’elles encapsulent. Une attention particulière a été portée sur la qualité des dépôts au sein des structures poreuses. La procédure d’immobilisation des protéines rédox dans les matrices de silice et de polymère a été en outre associée à un jeu de construction moléculaire qui a permis par l’instauration de diverses interactions électrostatiques, de retenir toutes les espèces responsables de la catalyse à la surface de l’électrode. Enfin, dans le but d’intensifier les réactions catalytiques responsables de la synthèse à réaliser, des nano-particules d’ormodifiées par une couche monomoléculaire d’un médiateur redox ont été incorporées aux différents matériaux d’immobilisation permettant de ce fait d’augmenter les interfaces d’échanges électrochimiques entre matériau conducteur et biomolécules. L’insertion de ces nano-objectscombinée à la nanostructuration du matériau d’électrode a permis de multiplier par plus de 170 fois l’intensité des réactions enregistrées. / The present work deals with the development of the working electrode of an electrochemicalbioreactor. This device enables the green synthesis of high added value chemical compounds. As theelectrochemical synthesis is located at the interface of the working electrode, structural optimizationof this reactor key component is required in order to maximize the available active surface area.Elaboration of highly organized macroporous gold electrodes with a size required by the pilot reactordimensions were obtained with the Langmuir-Blodgett method that was used to assemble a colloidalcrystal as a template. The elaboration of the organized colloidal deposit is first followed by theelectrodeposition of the electrode material, then by the dissolution of the template. The immobilization of the complete bio-electrochemical system inside the electrode pores was investigated in order to prevent pollution of the final product medium by one of the catalytic chaincomponent. This also improves the device life time. Subsequently electrogenerated ultra-thin silicalayers and electrodeposited polymer matrices were studied in order to preserve and optimize the catalytic activity of the redox proteins. In order to enhance the electrocatalytic synthesis, mediatormodified gold nanoparticules were incorporated in the different immobilization matrices. This allowed to increase the area of the electrochemical interface. The combination of the nano-objectincorporation and electrode nano-structuring intensified by a factor of 170 the catalytic process. / Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung einer Arbeitselektrode für einenelektrochemischen Bioreaktor, der die umweltfreundliche Synthese von wertvollen chemischenKomponenten ermöglicht. Da die elektrochemische Synthese an der Oberfläche der Arbeitselektrodestattfindet, ist es nötig, den strukturellen Aufbau der Schlüsselkomponente des Reaktors zuoptimieren und die aktive Oberfläche der Elektrode zu erhöhen. Mit Hilfe der Langmuir-BlodgettTechnik wurden kolloidale Kristalle erzeugt, die als Template dienten, um hochgeordnetemakroporöse Goldelektroden, deren Dimensionen von dem Pilotreaktor bestimmt wurden,herzustellen. Nach dem Erzeugen von geordneten kolloidalen Filmen wurde der Zwischenraumzwischen den Partikeln mittels elektrochemischer Abscheidung gefüllt und das Templateanschließend chemisch aufgelöst. In der Folge wurde die Immobilisierung des komplettenbioelektrochemischen Systems im Poreninnenraum untersucht, mit dem Ziel eine Verunreinigung desReaktionsmediums durch eine der katalytischen Komponenten zu verhindern. Die Lebensdauer derElektrode kann so zusätzlich erhöht werden. Es wurde untersucht, inwieweit durch elektrogenerierteultra-dünne Silikaschichten oder durch Elektroabscheidung erzeugte Polymerfilme die katalytischeAktivität der Redoxproteine erhalten und weiter optimiert werden kann. Goldnanopartikel, die miteinem Mediator modifiziert wurden, wurden in die jeweilige Immobilisationsschicht integriert, mitdem Ziel die Effizienz der elektrokatalytischen Synthese zu erhöhen. Auf diese Weise konnte dieaktive elektrochemische Oberfläche der Elektrode weiter erhöht werden. Die Kombination aus einernanostrukturierten Elektrode und Nanoobjekten die in die Immobilisationsschicht eingebettetwurden, führte zu einer Signalerhöhung des katalytischen Prozesses um mehr als eineGrössenordnung.

Introduction: Cancer vaccines are a therapeutic approach to initiate an antigen specific cytotoxic immune responses against tumors. Cancer vaccines are composed by an antigen (tumor peptide) and adjuvant. A peptide in combination with adjuvants effectively activate dendritic cells (DCs), the most efficient antigen presenting cells in our immune system. DCs prime and activate CD8+ cytotoxic T cells which generates an antigen specific response.Aim: Developing an assay to study the internalisation rout of an antigen-adjuvant conjugate in human dendritic cells by using live cell imaging. Method: Immobilisation of cells is necessary for the ability to perform live cell imaging for several hours. The immobilisation ability of three coatings, collagen type I, fibronectin and matrigel, at different concentrations were evaluated by using live cell imaging in a fluorescence microscope. The potential induction of activation of the cells were evaluated by using flow cytometry and ELISA. Results: Immature DCs internalise antigen-adjuvant conjugate more efficiently than mature and activated DCs. Therefore, it is important that the coating do not induce activation. Cells must also be immobilised for the possibility of long term detection. Collagen type I immobilised cells and induced activation in all investigated concentrations. Fibronectin and matrigel had concentration-dependent abilities to immobilise the cells. Matrigel did not activate the cells whilst fibronectin was concentration dependent. Conclusion: Matrigel immobilise the cells which enables long term single cell imaging without activation.

Magnetically driven separation techniques using magnetic solid carriers are one of modern methods to speed up and facilitate the previously used separation and purification procedures. The use of magnetic particles in biology imposes strict requirements on physical, and chemical properties of the particles, including low toxicity, biocompatibility and non-interference with the chemical environment in diagnostics. The aim of this study was to evaluate carboxyl-functionalised magnetic non-porous P(HEMA-co-GMA), P(HEMA-co-EDMA), PGMA, silica-coated lanthanum manganese peroskvite La0.75Sr0.25MnO3 and thermosensitive poly(N-isopropylacrylamide) microspheres – P(NIPAAm) for DNA isolation from different types of complex food and environmental samples containing PCR inhibitors. The solid-phase reversible immobilisation (SPRI) of nucleid acids on microsphere surface and the release of adsorbed DNA were optimised. DNA from real samples (milk products and probiotic food suplements, mouse faeces) was apparently adsorbed on solid particles from the aqueous phase system composed of 16% PEG 6000 and 2M NaCl. The conditions of the subsequent release absorbed DNA to the elution buffer (pH of elution buffer, temperature and time of elution) were optimized. The quality of eluted DNA and the presence of target DNA were examined by PCR and q-PCR using domain-specific Bacteria and genus-specific Lactobacillus primer set. Real-time PCR was used for an estimation of the PCR interference by comparing the amplification efficiencies of purified DNA containing solid nanoparticles with the DNA standards free of any nanoparticles

Le but de notre projet était de mettre au point un procédé éco-compatible d’organocatalyse asymétrique hétérogène en flux continu. Pour réaliser ce procédé, nous avons choisi d’utiliser la cupréine, un alcaloïde dérivé de la quinine comme organocatalyseur bifonctionnel. La silice (un matériau inorganique mésoporeux) a été choisie comme support pour l’hétérogénéisation du catalyseur. La cupréine immobilisée sur silice a ensuite été testée comme organocatalyseur de la réaction d’addition de Michael asymétrique entre le trans-β-nitrostyrène (accepteur de Michael) et le diméthyl malonate (donneur de Michael) en condition de flux continu.Nous avons tout d’abord immobilisé la cupréine sur deux types de silice selon trois stratégies différentes. Chaque stratégie nous a permis d’obtenir le support greffé avec des quantités de cupréine allant de 0,2 à 0,4 mmol par gramme de silice, ainsi que des silices greffées possédant des caractéristiques différentes selon les stratégies envisagées.L’évaluation de l’activité catalytique de la cupréine greffée sur silice a ensuite été réalisée en milieu hétérogène en batch. Différents solvants biosourcés ont alors été testés comme solvants alternatifs pour la réaction d’addition de Michael. Le 2-MeTHF s’est révélé être un bon solvant et a été choisi pour les expériences de catalyse en flux continu. Les résultats obtenus en catalyse avec la cupréine greffée sur silice sont comparables à ceux en milieu homogène (excès énantiomériques supérieur ou égale à 85 % et conversion supérieure à 96 %) exceptés pour la fréquence de rotation (TOF, mol de substrat converti/mol de catalyseur/durée de réaction) qui est trois fois plus faible en milieu hétérogène (0,2 h-1 pour 0,6 h-1 en milieu homogène).Enfin, cette réaction d’addition de Michael a été réalisée en flux continu avec les différentes silices greffées. La fréquence de rotation de la cupréine a été multipliée par deux (0,4 h-1) et le nombre de rotation (TON, mol de substrat converti/mol de catalyseur) a lui aussi été augmenté, passant de 16 en milieu hétérogène en batch à 63 en condition de flux continu. Finalement, différents dérivés du trans-β-nitrostyrène (Chloré, phénolique et méthoxy en position 4) ont été testés avec succès.Ainsi, à notre connaissance, nous avons réalisé la première réaction d’addition de Michael entre le trans-β-nitrostyrène et le diméthyl malonate, organocatalysée en milieu hétérogène en batch et en flux continu par la cupréine immobilisée sur silice, en utilisant un solvant biosourcé. Nous avons réussi à mettre au point le procédé de catalyse hétérogène en flux continu permettant de recycler facilement le catalyseur et aussi d’augmenter la productivité de la cupréine immobilisée par rapport au milieu hétérogène en batch, tout en conservant une conversion et une énantiosélectivité équivalente à celles en milieu homogène. / The aim of our project was to develop an eco-friendly process based on heterogeneous asymmetric organocataysis in continuous flow conditions. To succeed in this development, we chose to use a quinine-derived bifunctional organocatalyst: cupreine. Silica, a mesoporous inorganic material, was chosen as the support to immobilize this organocatalyst. The grafted cupreine was then tested as catalyst for the asymmetric Michael addition between the trans-β-nitrostyrene (Michael acceptor) and the dimethyl malonate (Michael donor) in continuous flow condition.First, we immobilized the catalyst on two types of silica, following three different strategies. The various cupreine-grafted silicas we obtained were functionnalized with 0.2 to 0.4 mmol of cuprein per gram of silica. Each one of them possessed specific characteristics depending of the followed strategy.The assessment of the catalytic activity of immobilized silica was then performed in batch condition. Different bio-based solvents were used for the Michael addition. 2-MeTHF was chosen as the best solvent among those tested and used in continuous flow. Immobilized cupreine proved to be as efficient in heterogenous condition as in homogenous (enantiomeric excess was superior or equal to 85 % and conversion better than 96 %), except for turn over frequency (TOF, mol of converted substrate/mol of catalyst/reaction time) which is three times lower in hetereogeneous condition (0.2h-1 to 0.6 h-1 in homogenous condition).Michael addition of trans-β-nitrostyrene to dimethyl malonate was then realized in continuous flow condition, using the various silica-supported catalysts. Turn over frequency of cupreine was doubled (0.4 h-1) and the turn over number (mol of converted substrate/mol of catalyst) increased from 16 to 63 in continuous flow condition. Derivatives of trans-β-nitrostyrene (chlorinated, phenolic and methoxylated in position 4) were successfully tested in continuous flow.To the best of our knowledge, we realized the first asymmetric Michael addition between trans-β-nitrostyrene and the dimethyl malonate, catalysed by silica-supported cupreine in batch and in continuous flow, using a bio-based solvent.We successfully developed an eco-friendly process based on heterogeneous organocatalysis in continuous flow. This process favorited an efficient recycling of the supported catalyst, and increased the productivity of grafted cupreine compare to the heterogeneous condition in batch. The enantioselectivity of the cupreine for this reaction was similar in both homogeneous and heterogeneous conditions.

Für die Herstellung pharmazeutisch interessanter α-Hydroxyketone ist die dynamsich kinetische Racematspaltung (DKR) der korrespondierenden Racemate eine interessante und leistungsfähige Methode. Die dafür benötigten Lipasen zeichnen sich insbesondere durch ihre Aktivität und Stabilität in rein organischen Lösungsmitteln aus. Der Verzicht von Cofaktoren macht diese Enzymklasse für einen industriellen Einsatz besonders attraktiv. Für α-Hydroxyketone mit großen Seitenketten hat sich die Lipase TL aus Pseudomonas stutzeri als Biokatalysator als am geeignetsten gezeigt. In vorherigen Studien wurde die Lipase TL erfolgreich mit dem homogenen Shvo-Katalysator für eine effektive DKR von Benzoin und Benzoinderivaten kombiniert und eine strikte (S)-Selektivität der Lipase TL festgestellt. In einer weiteren Studie wurde eine komplett heterogene DKR etabliert. Hierbei wurde die Lipase TL adsorptiv auf dem Polypropylenträger Accurel MP1001 immobilisiert und der Shvo-Katalysator durch verschiedene Metallkatalysatoren ersetzt. Als Modellsubstrat wurde Benzoin verwendet. Das beste Ergebnis der DKR von Benzoin wurde mit den Katalysator Zr-TUD-1 (25) im Lösungsmittel Toluol erreicht. Hauptziel dieser Arbeit war die Übertragung der heterogenen DKR von Benzoin auf weitere pharmazeutisch relevante α-Hydroxyketone. Dafür wurde zunächst eine generelle Optimierung der Immobilisierung der Lipase TL durch Verwendung verschiedener trägerbasierter und trägerloser Methoden und die Charakterisierung der Wasseraktivitätsabhängigkeit der KR und der Racemisierung durchgeführt. Zur Verbesserung der Umweltfreundlichkeit der Reaktion wurden außerdem alternative Lösungsmittel als Reaktionsmedium untersucht. Das optimierte Reaktionssystem wurde auf ausgewählte symmetrische und asymmetrische α-Hydroxyketone übertragen und die Eignung der Lipase TL sowie der CALB als Biokatalysatoren überprüft. Nach der Wahl der passenden Lipase wurde die DKR der ausgewählten α-Hydroxyketone untersucht und optimiert.

Im Zuge der voranschreitenden Entwicklung neuartiger polymerer und molekularer Halbleiter besteht ein großer Bedarf an starken p-Dotierungsmitteln, welche in der Lage sind, organische Halbleiter mit hoher Austrittsarbeit bzw. Elektronenaffinität zu oxidieren. Bekannte und etablierte p-Dotierungsmittel wie CN6-CP bringen jedoch für lösungsbasierte Methoden zur Schichtbildung aufgrund ihrer niedrigen Löslichkeit viele Probleme mit sich. Weiterhin stellen Diffusion und Migration von Dotierungsmitteln durch die polymeren Halbleiter ein Problem dar, welches zum einen die Ausbildung von scharfen p-n-Übergängen erschwert, zum anderen die Lebensdauer von organischen elektrischen Bauteilen stark einschränkt. Eine Möglichkeit, diese Hürden zu überwinden, wäre die kovalente Anbindung des Dotierungsmittels an den polymeren Halbleiter, jedoch gibt es bisher kaum Forschungsergebnisse zu diesem Thema. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Struktur des Dotierungsmittels CN6-CP modifiziert, wodurch dessen Löslichkeit in organischen Lösemitteln signifikant verbessert und gleichzeitig die elektronischen Eigenschaften der Substanz nur geringfügig verändert wurden. Es wurde eine allgemeingültige Methode zur Synthese asymmetrisch substituierter Radialene etabliert und angewendet. Weiterhin wurden erstmals funktionelle Gruppen in die Struktur eines Dotierungsmittels eingebaut, welche eine kovalente Anbindung via Click-Chemie an polymere Halbleiter erlauben. Dies ermöglicht die Immobilisierung des Dotierungsmittels. Durch den Austausch von Gegenionen konnten die für die hergestellten Dotierungsmittel geeigneten Lösemittel gezielt eingestellt werden. Eine vollständige chemische Analyse und Charakterisierung der hergestellten Substanzen wurde durchgeführt. Im zweiten Teil wurde die Synthese des literaturbekannten polymeren Halbleiters PPPC (Polypropargyloxyphenylcarbazol) durchgeführt und optimiert sowie die hergestellten Batches charakterisiert. Über mehrere Modellversuche wurden Methoden entwickelt, um die hergestellten immobilisierbaren Dotierungsmittel an PPPC kovalent zu binden. Eine Reihe von Polymeren mit unterschiedlich hohem Anteil des Dotierungsmittels wurde synthetisiert und diese auf ihre Löslichkeit hin untersucht. Nach der Optimierung einer für alle diese PPPC-Derivate gültigen Methode zur Bildung dünner Polymerfilme und zur photochemischen Vernetzung wurden diese auf ihre elektrische Leitfähigkeit hin untersucht. Nach Oxidation mit NOSbF6 wurde die Stabilität der oxidierten Schichten gegenüber äußeren Einflüssen untersucht und deren elektrische Leitfähigkeit in Abhängigkeit des Anteils des Dotierungsmittels charakterisiert.:I INHALTSVERZEICHNIS ........................................................................... 1 II THEORETISCHER TEIL ......................................................................... 5 1 Motivation und Zielstellung .................................................................... 7 2 Theoretische Grundlagen ................................................................... 10 2.1 Organische Halbleiter ....................................................................... 10 2.1.1 Elektrische Leitfähigkeit ................................................................. 11 2.1.2 Elektrische Leitfähigkeit in Polymeren ........................................... 13 2.1.3 Konjugierte Polymere .................................................................... 17 2.1.4 Synthese von polymeren Halbleitern ............................................. 21 2.2 Dotieren ........................................................................................... 23 2.2.1 Molekulares Dotieren .................................................................... 24 2.2.2 Dotierungsmechanismen .............................................................. 25 2.2.3 Effizienz von Dotierungen.............................................................. 29 2.2.4 Moderne Dotierungsmittel ............................................................. 30 2.3 CN6-CP ............................................................................................ 32 2.3.1 Allgemeines ................................................................................... 32 2.3.2 Mechanismus der Synthese .......................................................... 34 2.3.3 Modifizierung ................................................................................. 35 2.4 Vernetzungsreaktionen ..................................................................... 37 2.4.1 Huisgen-Cycloaddition und CuAAC ............................................... 38 2.4.2 Photochemische Vernetzung ......................................................... 40 3 Analysemethoden ................................................................................ 41 3.1 Gelpermeationschromatographie (GPC) ........................................... 41 3.2 Leitfähigkeitsmessungen .................................................................. 42 3.3 Cyclovoltammetrie ............................................................................. 47 3.4 UV-Vis-Spektroskopie ........................................................................ 50 III RESULTATE UND DISKUSSION ............................................................ 53 1 Synthese von Dotierungsmitteln ........................................................... 55 1.1 CN4-CP-NEt3 .................................................................................... 56 1.1.1 Synthese ........................................................................................ 56 1.1.2 Analytik ........................................................................................... 58 1.2 CN5Et-CP .......................................................................................... 63 1.2.1 Dianionen ....................................................................................... 64 1.2.1.1 Synthese CN5Et-CP-2Na ............................................................. 64 1.2.1.2 Synthese CN5Et-CP-2TBA .......................................................... 66 1.2.1.3 Analytik ....................................................................................... 67 1.2.2 Radikal-Anion CN5Et-CP-K ............................................................ 75 1.2.3 Neutralform .................................................................................... 79 1.3 CN5HexN3-CP ................................................................................... 84 1.3.1 Zweitstufige Synthese von HexN3OAcCN ....................................... 85 1.3.2 Dianionen ...................................................................................... 89 1.3.2.1 Synthese CN5HexN3-CP-2Na ..................................................... 89 1.3.2.2 Synthese CN5HexN3-CP-2TBA ................................................... 90 1.3.2.3 Analytik ....................................................................................... 91 1.3.3 Radikal-Anion CN5HexN3-CP-K ..................................................... 96 1.4 Zusammenfassung ............................................................................ 99 2 Selbstkompensierende Polymere ....................................................... 102 2.1 Synthese von PPPC .........................................................................102 2.1.1 Synthese der Monomere .............................................................. 103 2.1.2 Suzuki-Polykondensation .............................................................. 106 2.1.3 Entschützung ................................................................................ 110 2.1.4 Propargylierung zu PPPC ............................................................. 111 2.2 Modell-Versuche .............................................................................. 124 2.2.1 Huisgen-Cycloaddition .................................................................. 124 2.2.2 CuAAC .......................................................................................... 130 2.3 Modifizierung des Polymers ............................................................. 133 2.4 Oxidation und Dotierung .................................................................. 143 2.4.1 Voruntersuchungen ...................................................................... 143 2.4.2 Optimierung der Polymerfilmpräparation ...................................... 149 2.4.3 Leitfähigkeitsmessungen .............................................................. 160 3 Zusammenfassung ............................................................................. 167 4 Ausblick .............................................................................................. 171 IV EXPERIMENTALTEIL ......................................................................... 173 1 Allgemeine Angaben .......................................................................... 175 1.1 Analytische Methoden ..................................................................... 175 1.2 Chemikalien und Lösungsmittel ....................................................... 178 1.3 Sonstiges ........................................................................................ 180 2 Synthesen .......................................................................................... 182 2.1 Derivate von CN6-CP ...................................................................... 182 2.1.1 Synthese von CN4-CP-NEt3 ......................................................... 182 2.1.2 Synthese von CN5Et-CP-2Na ....................................................... 184 2.1.3 Synthese von CN5Et-CP-2TBA .................................................... 185 2.1.4 Synthese von CN5Et-CP-K .......................................................... 187 2.1.5 Synthese von HexBrOAcCN ......................................................... 188 2.1.6 Synthese von HexN3OAcCN ........................................................ 189 2.1.7 Synthese von CN5HexN3-CP-2Na ............................................... 190 2.1.8 Synthese von CN5HexN3-CP-2TBA ............................................. 191 2.1.9 Synthese von CN5HexN3-CP-K .................................................... 192 2.2 Polymersynthese ............................................................................. 193 2.2.1 Synthese von THP-DBP ............................................................... 193 2.2.2 Synthese von EH-DBC ................................................................. 194 2.2.3 Synthese von Bor-EH-C ............................................................... 195 2.2.4 Synthese von Pd/PtBu3 ............................................................... 196 2.2.5 Suzuki-Polykondensation zu P-THP-PC ....................................... 197 2.2.6 THP-Entschützung zu P-OH-PC ................................................... 198 2.2.7 Propargylierung zu PPPC ............................................................. 199 2.3 1,3-Dipolare Cycloadditionen .......................................................... 200 2.3.1 Synthese 1,3,5-Tris(azidomethyl)benzol (TAMB) .......................... 200 2.3.2 Thermische Huisgen-Cycloaddition .............................................. 201 2.3.3 Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition ................................ 202 2.3.4 Filmpräparation ............................................................................ 203 V ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................. 204 VI LITERATURVERZEICHNIS ................................................................. 207 VII ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..............................................................222 VIII TABELLENVERZEICHNIS ................................................................. 234 IX PUBLIKATIONSVERZEICHNIS ............................................................ 236 X ANHANG ............................................................................................. 237

Dans son ensemble, les techniques de pointe actuelles procurent l'information nécessaire à une analyse approfondie de la cellule, ce qui nécessite cependant l’utilisation d’instruments et de plateformes analytiques différentes. Les biopuces à cellule permettent l’analyse des cellules vivantes en temps réel et constituent donc un outil important pour de nombreuses applications dans la recherche biomédicale telles que la toxicologie et la pharmaceutique.En effet, le suivi en temps réel de la réponse non-seulement physique mais aussi chimique des cellules, obtenue suite à des stimuli externes spécifiques et en utilisant un système d'imagerie cellulaire, peut fournir une meilleure compréhension des mécanismes et des voies de signalisation impliquées dans la réaction toxicologique.Le développement de tels dispositifs multianalytiques pour l'analyse biologique repose essentiellement sur la capacité de produire des surfaces fonctionnelles de pointe permettant une interaction et organisation contrôlée des cellules et d'autres entités telles que par exemple des anticorps ou des nanoparticules. Par conséquent, un grand effort technologique repose sur le développement des techniques permettant la création de motifs fonctionnels sur une surface de nature souvent inerte. Dans cette thèse, nous proposons deux techniques de micro- et nanofabrication permettant la création de motifs de cellules et d’anticorps sur un revêtement non-adhésif composé de poly (oxyde d'éthylène) (« PEO-like ») déposé par plasma. La première approche consiste à immobiliser par physisorption un micro-réseau de molécules adhésives de la matrice extracellulaire (par exemple la fibronectine) en utilisant des techniques d’impression par microcontact et par non-contact. La deuxième approche permet la création de motifs adhésifs sur la surface constitués de nanoparticules d'or (Au NPs) en utilisant des techniques d’impression similaire. L'immobilisation des Au NPs sur le revêtement « PEO-like » ne nécessite pas de modifications chimiques et est réalisé par une technique d'autoassemblage simple et irréversible. Ces surfaces d'or nanostructurées ont été testées pour l’analyse du phénomène de reconnaissance biomoléculaire et en tant que plateforme de culture cellulaire. Finalement, cette plateforme a été intégrée à un microscope plasmonique qui a permis, de façon préliminaire, la surveillance et la visualisation de la motilité d’une cellule unique, cela en temps réel et sans marquage, ainsi que la détection spécifique et sensible de protéines tests / State of the art techniques give as a whole the required information needed for the complete cell analysis but require different instruments and different types of platforms. The concept of cells on-a-chip allowing real-time analysis of living cells is, therefore, an important tool for many biomedical research applications such as toxicology and drug discovery. Monitoring in real-time the physical but also chemical response of live cells to specific external stimuli using live-cell imaging can provide a better understanding of the mechanisms and pathways involved in the toxicological reaction. The development of such multianalytical devices for biological analysis relies essentially on the ability to design advanced functional surfaces enabling a controlled interaction and organisation of cells and other nanostructures (e.g antibodies and nanoparticles). Therefore, a large technological effort is related on the development of advanced patterning techniques. In this thesis, we propose two simple and direct micro- and nano-fabrication techniques enabling the creation of cellular and sensing patterns on a non-adhesive and cell repellent plasma-deposited poly (ethyleneoxide) (PEO-like) coating. The first approach consists in immobilising a microarray of ECM molecules (cell-adhesive proteins, e.g fibronectin) on the cell repellent PEO-like surface by physisorption using microspotting or microcontact printing techniques. The second approach enables the creation of Gold nanoparticles (Au NPs) adhesive patterns on the surface using similar spotting techniques. The immobilization of Au NPs on PEO-like coatings does not require any prior chemical modifications and is achieved by a straightforward and irreversible self-assembly technique. These gold nanostructured surfaces have been tested for protein bio-recognition analysis and as a cell culture platform. Ultimately, this platform was integrated to a novel plasmonic microscope which enabled, preliminarily, the label-free monitoring and visualisation of a single cell attachment and detachment in real time, as well as the specific and sensitive detection of test proteins in a cell-free environment

Suite à la première thèse sur le greffage et l’adsorption physique successives de sélecteurs chiraux dans des tubes ouverts en électrochromatographie capillaire (ECC ou CEC) chirale, menée par le Dr Guillaume Pédéhontaa-Hiaa au sein de l’équipe du laboratoire COBRA (IUT d’Evreux), nous avons développé des phases stationnaires chirales covalentes (CSPs) à base de cyclodextrines (CDs) en tubes ouverts et des CSPs sur supports monolithiques pour l’emploi en CEC. Nous avons ainsi évalué les paramètres électrochromatographiques et la stabilité de ces CSPs en séparant une variété de racémiques neutres et chargés. L’influence de la température d’analyse, le potentiel appliqué ainsi que la nature et le pH des électrolytes sur la qualité des électrochromatogrammes ont été étudié en CEC chirale. Cette étude se divise en deux grandes parties. La première concerne les CSPs élaborées sur colonnes à tubes ouverts pour l’OT-CEC. Il s’agit initialement de graver la surface interne d’un capillaire de silice de 50 μm de diamètre interne à l’aide d’une solution de bifluorure d’ammonium dans le but premier d’augmenter considérablement sa surface spécifique et d’immobiliser en surface une grande quantité de sélecteurs chiraux à base de β-CD. Nous avons alors décrit des greffages covalents de CDs anioniques (Scc-β-CD et CM-β-CD) et d’un polymère anionique de CDs (p-CM-β-CD-) en surface de capillaire de gel de silice gravée et modifiée chimiquement par l’aminopropyltriéthoxysilane (APTEOS). Les greffages des sélecteurs ont été reproduits dans les mêmes conditions que dans la thèse rapportée précédemment en électrophorèse. L’originalité de la construction de ces CSPs réside dans la rapidité et la simplicité du couplage dit péptidique à température ambiante, des sélecteurs carboxylés sur des colonnes préalablement gravées. Ce greffage nécessite des agents de couplage peptidique solubles dans l’eau tels que 1-Ethyl-3-(diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) et le N-Hydroxysuccinimide (NHS). Il peut aussi être obtenu de manière moins efficace avec d’autres agents solubles en milieu organique tels que le O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tétraméthyluronium tétrafluoroborate et la triéthylamine (TBTU/TEA). Chaque étape menant aux CSPs a été caractérisée par une étude de flux électroosmotique (FEO) en OT-CEC. Des analyses en AFM et en MEB nous renseignent d’avantage sur le succès du procédé « etching » de nos capillaires. La deuxième grande partie de cette étude traite de la synthèse in-situ de CSPs sur des colonnes de type polymères monolithes organiques et un monolithe hybride à base de sol gel. Des post modifications de surface de ces supports monolithiques nous ont permis d’immobiliser de façon covalente et non covalente des sélecteurs de β-CD en surface des volumes macroporeux. Deux collaborations ont vu le jour pour atteindre ces objectifs. La première eut lieu avec le Dr Thuy Tran et le Pr Myriam Taverna de la Faculté de Pharmacie de Chatenay Malabry (UMR 8612), durant laquelle nous avons reproduit une colonne monolithe organique de type méthacrylate, porteuse de groupements phosphate dans l’optique d’adsorber physiquement en surface le polymère cationique de CDs (p-CD+) que nous a transféré le Pr Benjamin Carbonnier et d’évaluer les capacités de discrimination chirale de cette nouvelle CSP en m-CEC. La seconde collaboration a eu lieu avec le Dr Mohamed Guerrouache et le Pr Benjamin Carbonnier au sein du laboratoire ICMPE de Thiais, où nous avons synthétisé des colonnes monolithiques organiques à base d’acrylates dans le but de greffer en surface de façon covalente et non covalente les CDs et polymères de CDs et d’évaluer ces nouvelles CSPs en m-CEC. La troisième phase stationnaire monolithique employée est celle décrite par le Dr Huihui Yang qui décrit un monolithe hybride porteur de groupements sulfonates nous permettant par la suite d’immobiliser électrostatiquement le p-CD+ sur le réseau poreux et d’évaluer cette nouvelle CSP en m-CEC. / New chiral stationary phases have been prepared for Open Tubular and monolithic columns used in electrochromatography capillary. In order to separate racemic mixtures such as flavonoïd, Hidantoïn derivatives, Binaphtalene-2, 2-hydrogenophosphate and others chiral solutes, we use the β-cyclodextrin forms as chiral selector. Besides, β-cyclodextrin seems to be the most efficient chiral selector in chromatography since it is able to complex and dissolve optical organic isomers in an aqueous media, this chiral selector is able to dissolve even lipophilic molecule with high weight. The complexation is based on interactions with β-cyclodextrin. This study aims to elaborate new chiral stationary phase for CEC using β-cyclodextrin polymers and β-cyclodextrin derivatives. Two approaches were used: Firstly, covalent stationary phases coating with carboxymethyl-β-cyclodextrin polymers and oligomers containing carboxyl’s group had been experimented for open tubular and monolithic column in CEC. Then a non-covalent coating cationic polymer of β-cyclodextrin’s derivatives was immobilized (polytrimethyl ammonium β-CD) on continuous organic monoliths bearing anionic’s group. Prior to the covalent coating of the CD’s chiral selector for OT-CEC and m-CEC, we needed to modify the silicate surface and the monolithic surface with a primary amine silicate1,2 (aminopropyltriethoxysilane) and EDA, an amino-organic moiety (Ethylene diamine). The stability of the bonded organic moiety (APTEOS, EDA) were studied by CEC at different pH with constant ionic strength’s buffer. In this way, graft of carboxymethyl-β-cyclodextrin polymer on silica inner surface modified by APTEOS and on NAS-co-EDMA surface modified by EDA succeeded in activating and covalently coupling reagent as EDC and NHS (1-ethyl-3(-3-dimethtylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide, respectively3) with carboxymethyl’s group of carboxymethyl-β-cyclodextrin . The resultant stationary phase lead to stable chiral stationary phases, easier to prepare starting by coupling the selector to the amine’s group using EDC and NHS. In order to optimize enantio-separations by increasing the specific surface of open tubular columns, we reproduce the etching process to bared capillaries with ammonium bifluoride solution, referred to Pesek’s process4. By this mean, we increase dramatically the specific surface of bared capillaries before anchoring CDs polymers to silicate surfaces modified by APTEOS. Finally due to etching process, we obtain a covalent bonded Chiral Stationary Phase (CSP) which led to more efficient and resolvent enantio-separations by CEC. To describe, in another way, the non-covalent coating of CSP, we immobilised a cationic polymer (polytrimethyl ammonium β-CD+) on two kind of continuous organic and silica hybrid monoliths bearing sulfonate5 and phosphate’s groups. Based on precedent results for OT-CEC enantio-separation with LbL stationary phase7, using successive layers charged polymers to separate racemic mixture in CEC, we decided to adsorb a polycationic polymer hydrosoluble onto the silica hybrid monolith column to form chiral stationary phase (CSP) polytrimethyl ammonium β-cyclodextrin. This way of modification for monolithic surface by chiral selectors is nowadays highly efficient and attractive for CEC. The effect of the matrix and the coating’s nature are discussed by comparing the chromatographic parameters.

Summaries in Afrikaans and English / Text in Afrikaans / In South Africa the transfer and settlement processes associated with share transactions are essentially paper-based. The physical handling of the share certificate plays an important role in this regard. Foreign trends to reduce the movement of paper involve in broad terms the alternatives of dematerialisation and immobilisation of the share certificate. These developments cannot slavishly be followed without examining the legal nature of the South African share and share certificate. The process of immobilisation in a collective securities depository system involves no change in the nature of the shares. However, the use of a nominee where shares are held in safe custody forms a barrier between the shareholder and the issuer company which could dilute the shareholders' rights. This is even more applicable where shares are immobilised in a central depository. Further, although central depositories are based upon book-entries, they are still limited by the retention of the physical certificates. The development of electronic systems which dematerialise the share certificate must take into account the reasonable expectations of the public and should not be forced upon investors. The shareholder of a 'uncertificated' share must be placed, as far as possible, in the same position as if he had received a certificate. This requires legislation to amend present enactments and to define the rights of the shareholder. It is submitted that dematerialisation should gradually be phased in, starting with a voluntary dematerialisation in the case of holdings in the central securities depository. / In Suid-Afrika is die oordrag- en verrekeningsprosesse wat gepaardgaan met aandeletransaksies hoofsaaklik papiergebaseer. Die fisiese bantering van die aandelesertifikaat speel in die opsig 'n belangrike rol. Buitelandse pogings om die beweging van papier te verminder, neig in die algemene rigting van die dematerialisasie en immobilisasie van die aandelesertifikaat. Hierdie ontwikkelings kan nie slaafs nagevolg word sonder om die regsaard van die Suid-Afrikaanse aandeel en aandelesertifikaat te ondersoek nie. Die proses van immobilisasie in 'n kollektiewe bewaarnemerstelsel vir effekte wysig nie die aard van aandele nie. Nietemin plaas die gebruik van genomineerdes waar aandele in veilige bewaring gehou word 'n wig tussen die aandeelhouer en die uitreikermaatskappy wat die aandeelhouersregte kan verwater. Dit is selfs meer toepaslik waar aandele in 'n sentrale depot ge'lmmobiliseer word. Verder is dit so dat alhoewel sentrale depots op boekinskrywings gebaseer word, hul steeds beperk word deur die behoud van die fisiese sertifikate. Die ontwikkeling van elektroniese stelsels wat die aandelesertifikaat dematerialiseer moet rekening hou met die redelike verwagtinge van die publiek en behoort nie op beleggers afgedwing te word nie. Die aandeelhouer van 'n 'ongesertifiseerde' aandeel moet, so ver moontlik, in dieselfde posisie geplaas word asof hy 'n sertifikaat ontvang bet. Wetgewing is noodsaaklik om bestaande bepalings te wysig en die regte van die aandeelhouer te omskryf. Daar word aan die hand gedoen dat dematerialisasie stelselmatig infaseer word - aanvanklik met 'n vrywillige dematerialisasie in die geval waar aandeelhouding in sentrale bewaameming is. / Private Law / LL.D.

<p>U radu je ispitan i razvijen novi pristup tretmanu kože goveda prirodnom smolom &scaron;elak, koja je dozvoljena za kori&scaron;ćenje u hrani, u cilju redukcije unakrsne mikrobiolo&scaron;ke kontaminacije sa kože na goveđe meso. Mehanizam ovog tretmana je baziran na imobilizaciji mikroorganizama na dlaci tretirane kože i prevenciji njihovog fizičkog prenosa sa dlake na meso trupova tokom procesa obrade zaklanih goveda.<br />U in vitro uslovima, tretman uzoraka vizuelno čiste i suve kože 23% rastvorom &scaron;elaka u etanolu je redukovao prenos sa kože na sunđere kojima je koža uzorkovana brisevima: ukupne mikroflore (TVC) za 6,6 log (&gt;1000 puta vi&scaron;e u odnosu na 2,9 log redukcije kod tretmana samo etanolom), generičke Escherichia coli za najmanje 2,9 i Enterobacteriaceae za najmanje 4,8 log. Ove redukcije sve tri grupe mikroorganizama su bile značajno vi&scaron;e u odnosu na redukcije postignute tretmanom kože kombinacijom ispiranja sanitajzerom i vakumiranja. Značajno vi&scaron;e redukcije prenosa TVC sa kože na sunđerske briseve su postignute kori&scaron;ćenjem vi&scaron;ih koncentracija &scaron;elaka (23% i 30%) u odnosu na niže (4,8-16,7%) i u slučajevima kada je temperatura rastvora &scaron;elaka bila 20, 30 ili 40oC u odnosu na 50oC i 60oC. Takođe, tretman kože &scaron;elakom je značajno (3,7 puta) redukovao prevalencu E. coli O157 na prirodno kontaminiranoj, neinokulisanoj koži, kao i broj E. coli O157 na ve&scaron;tački inokulisanim kožama (redukcija od 2,1 log), u odnosu na odgovarajuće netretirane kontrole.<br />U uslovima laboratorijskog modela direktnog kontakta kože i mesa, tretman kože (različitih kategorija čistoće) 23% rastvorom &scaron;elaka je značajno smanjio prenos mikroorganizama sa tretirane kože na sterilno goveđe meso: do 3,6 log cfu/cm2 redukcije ukupnog broja bakterija (TVC), do 2,5 log cfu/cm2 Enterobacteriaceae (EC) i do 1,7 log cfu/cm2 generičke E. coli (GEC). Redukcija prenosa TVC je bila značajno vi&scaron;a, a redukcije EC i GEC slične, u odnosu na redukcije nakon tretiranja kože kombinacijom ispiranja-vakumiranja sanitajzerom.<br />U uslovima male komercijalne klanice sa nezadovoljavajućom procesnom praksom (klanje prljavih goveda i neadekvatna higijena procesa klanja i obrade), tretman koža zaklanih goveda 23% rastvorom &scaron;elaka je rezultirao značajnom mikrobnom redukcijom na mesu trupova goveda nakon skidanja kože: 1,7 log cfu/cm2 TVC, 1,4 log cfu/cm2 EC i 1,3 log cfu/cm2 GEC. Redukcija TVC na mesu trupova je bila značajno vi&scaron;a, a redukcije EC i GEC slične, u odnosu na redukcije nakon tretiranja kože ispiranjem-vakumiranjem sanitajzerom.<br />Ova istraživanja su po prvi put pružila naučne dokaze da se tretman kože goveda u cilju imobilizacije mikroflore na dlaci može uspe&scaron;no koristiti u cilju smanjenja kontaminacije mesa trupova tokom procesa skidanja kože, unapređenja finalnog mikrobiolo&scaron;kog statusa mesa i bezbednosti goveđeg mesa uop&scaron;te. Da bi se ostvario puni potencijal ovog novog tretmana u praksi, neophodna su dalja istraživanja u cilju njegove tehničke optimizacije u uslovima industrije mesa.</p> / <p> In this research, a new approach to cattle hide treatments, based on using a natural, food-grade resin, Shellac, to reduce microbial cross-contamination from the hides onto carcass meat, was developed and evaluated. The basis of this treatment is immobilisation of microorganisms on cattle hide&rsquo;s hair and subsequent reduction of their transmissibility from the hair onto carcass meat during dressing of slaughtered cattle.<br /> Under in vitro conditions, treatment of samples of visually clean and dry hides with 23% Shellac-in-ethanol solution reduced sponge-swabbing recoveries of general microflora (TVC) by a factor of 6.6 logs (&gt;1000-fold greater than the 2.9 log reduction observed by ethanol alone), and of generic E. coli (GEC) and Enterobacteriaceae (EC) by factors of at least 2.9 and 4.8 logs, respectively. The reductions of these three groups of microorganisms were superior to those achieved by a sanitizer rinse-vacuum hide treatment. Significantly greater reductions of TVC recoveries from hides were achieved when using higher Shellac concentrations (23.0% and 30.0% rather than 4.8-16.7%) and when Shellac solution temperatures were 20-40&deg;C rather than 50-60&deg;C. Furthermore, the Shellac-based treatment also markedly reduced the E. coli O157 prevalence (3.7-fold reduction) on natural, uninoculated hides, as well as the counts of E. coli O157 on artificially inoculated hides (2.1 log reduction) when compared to corresponding untreated controls.<br /> Under the conditions of a hide-to-meat direct contact laboratory-based model, treatment of hides (of varying visual cleanliness) with the 23% Shellac solution produced significant reductions of microbial transfer from treated hide onto sterile beef: up to 3.6 log10 CFU/cm2 of TVC, up to 2.5 log10 CFU/cm2 of EC and up to 1.7 log10 CFU/cm2 of GEC. TVC reductions of microbial transfer from treated hide onto beef achieved by the Shellac hide treatment were superior to those achieved by the comparative sanitizer rinse-vacuum hide treatment, but reductions of EC and GEC did not differ between the two hide treatments.<br /> In a small commercial abattoir with unsatisfactory process practices (slaughtering dirty cattle, inadequate process hygiene), treatment of hides with Shellac produced significant microbial reductions on skinned beef carcasses: 1.7 log10 CFU/cm2, 1.4 log10 CFU/cm2 and 1.3 log10 CFU/cm2 of TVC, EC and GEC, respectively. TVC reductions on skinned beef carcasses achieved by the Shellac hide treatment were superior to those achieved by the comparative sanitizer rinse-vacuum hide treatment, but reductions of EC and GEC did not differ significantly between the two hide treatments.<br /> These investigations produced the first scientific evidence that treatment of cattle hides with aim of immobilising microflora on the hair can be very successfully used to reduce carcass meat contamination during the skinning operation, thus improving the microbiological status of the final beef carcasses as well as the beef safety in general. To achieve the full potential of this new treatment in practice, further research aimed at its further technical optimization under real-life meat industry conditions is necessary.</p>